CC BY
5Я. А. Бутко1, С. М. Дроговоз1, Г. И. Губина-Вакулик2 Т. В. Горбач2
ДИНАМИКА УРОВНЯ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ ПРИ
ОЖОГОВОЙ ТРАВМЕ У КРЫС ПОД ВЛИЯНИЕМ КЕРАМИДОВ И ИХ КОМБИНАЦИИ С ДЕКСПАНТЕНОЛОМ
Национальный фармацевтический университет, 2Харьковский национальный медицинский университет, г. Харьков, Украина
Проведено изучения влияния кремов с керамидами и их комбинации с декспан-тенолом на динамику уровня провоспалительных цитокинов (IL и TNF) при ожоговой травме у крыс. Установлено, что ожоговая травма у крыс сопровождается значительным повышением провоспалительных цитокинов, высокий уровень которых в течение всего периода наблюдений задерживает ее заживление. Результаты исследования показали, что применение кремов с керамидами и их комбинации с дек-спантенолом на протяжении всего периода наблюдения способствовало заживлению ожоговых ран и достоверному снижению уровня изучаемых провоспалительных цитокинов и по отношению к контрольной патологии и лекарственному средству сравнения, что подтверждает выраженную эффективность местного лечения ожоговых ран. Следует отметить, что использование исследуемых средств с различным механизмом ранозаживляющего действия вызывает однотипные изменения цито-кинового профиля в крови и очага ожоговой раны. Перспективным является дальнейшее исследование данных кремов с целью изучения их механизмов влияния на процессы репарации.
Ключевые слова: крем, керамиды, декспантенол, ожоговая травма, цитокины.
ВВЕДЕНИЕ
Ожоговая травма является одним из самых распространенных травматических повреждений в мире [1, 2]. При ожогах в первую очередь повреждается кожный покров, и именно его повреждение считают главным в развитии ожоговой болезни. Динамические процессы, которые возникают в ответ на термическое повреждение, сочетают в себе стрессовую реакцию системы крови с активацией симпатоадреналовой системы, развитие неспецифической воспалительной реакции с переходом в структурно-метаболические нарушения органов, тканей и систем [3, 4]. В реализации воспаления важное место занимают молекулы межклеточной сигнализации - ци-токины, в частности, провоспалительные интерлейкины ГЬ-1, ГЬ-6, ГЬ-8, и фактор некроза опухоли Т№а, которые продуцируются в ответ на повреждение тканей и стимулируют развитие местной воспалительной реакции, направленной на заживление ожоговой травмы [5]. Т№а - это полипептидный цитокин, который инициируется при патологических процессах, обладает возможностью активировать апоптоз, вызывает активацию в клеточной мембране активных форм кислорода и N0,
повышает образование белков острой фазы воспаления (С-реактивного белка, гапто-глобина и др.) [6]. IL-1a - это конститутивный эпидермальный цитокин, который производится кератиноцитами эпидермиса нормальной кожи. Нарушение целостности поверхности кожи немедленно увеличивает продукцию IL-1a и подтверждает факт наличия массивного разрушения ке-ратиноцитов [7]. Следует отметить, что IL и TNF играют ключевую роль в миграции и активации раневых фибробластов, продуцирующих субстанции (протеогликаны, эластин, коллаген, энзимы), необходимые для заживления ран.
В настоящее время в терапии повреждений кожи актуальными являются методы, направленные на замещение кожного дефекта новообразованным эпидермисом, в основе которых лежит стимуляция пролиферации эпидермиса, что дает лучшие косметические результаты. В связи с этим новые перспективы открывают раноза-живляющие лекарственные средства (ЛС), которые созданы с учетом биологического ресурса кожи и содержат пластический материал для реконструкции эпидермиса (например, керамиды).
Керамиды содержат концентрированные и высокоочищенные гликокерамиды,
аналогичные керамидам кожи человека, являются продуктами природного происхождения. Благодаря специфическому биологическому действию в верхних слоях эпидермиса они действуют как гликокера-миды - усиливают, удерживают и восстанавливают поврежденные или ослабленные бислои липидов и эндогенных керамидов (расположенных между корнеоцитами), а также усиливают очень чувствительные к внешним факторам липидные ламелляр-ные системы межклеточного пространства и улучшают терминальную дифференциацию эпидермиса [8]. Керамиды восполняют дефицит природных керамидов, заполняют пространство между мертвыми клетками рогового слоя эпидермиса, скрепляют их, восстанавливают целостность кожного покрова, поддерживают баланс влажности, повышают эластичность и упругость кожи, способствуют восстановлению барьерной функции кожи и повышению её устойчивости к токсинам [9].
Для повышения эффективности местного лечения ран под руководством проф. Н. А. Ляпунова были разработаны кремы с керамидами и их комбинации с дек-спантенолом, которые проявляют широкий спектр фармакологического действия (за счет действующих компонентов обладают репаративным, метаболическим, противовоспалительным, антиоксидант-ным действием, восполняют дефицит эндогенных керамидов эпидермиса, повышают эластичность и барьерные функции кожи) для применения во II-III фазах раневого процесса.
Целью данной работы было изучение динамики уровня провоспалительных ци-токинов в крови и в коже экспериментальных животных с ожоговой травмой III степени под влиянием керамидов и их комбинации с декспантенолом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты на модели ожоговой травмы проводили на 84 белых беспородных крысах массой 200-240 г. Животным под тиопенталовым наркозом на депили-рованном участке кожи спины, отступив от позвоночника 1,5 см, моделировали ожог. Для этого использовали прибор с установленной температурной шкалой и электропаяльником, на конце которого крепится круглая металлическая пластина диаме-
тром 2,5 см. Время экспозиции нагретой до 2000С контактной пластинки составило 10 сек. [10]. Этот метод позволил получить стандартные ожоги по площади и глубине поражения кожи, отвечающие ША степени клинической классификации ожогов.
Экспериментальные животные были разделены на 5 групп: I - интактный контроль (ИК) (n = 6), II - контрольная патология, животные с ожоговыми ранами, которых не лечили (КП) (n = 24), III - опытная группа, животные с ожоговыми ранами, которых лечили кремом «Керамиды» (n = 18), IV - группа, которую лечили кремом «Декспантенол с керамидами» (n = 18). В V группе животных лечили ЛС сравнения - кремом «Бепантен» («Bayer», Германия) (n = 18), который был выбран как аналог по лекарственной форме, частично по составу действующих компонентов, фармакологическому действию и показанию к применению. Лечение ожоговых ран начинали на следующий день после их моделирования и до полного заживления, ЛС наносили 1 раз в день в эмпирической дозе 15 мг/см2 [10].
Клинические наблюдения за процессом заживления ожоговых ран у животных проводили каждый день. В эти сроки оценивали состояние раны, площади ожоговой раны (S) и регистрировали сроки полного заживления ожогов. Для количественного определения в периферической крови провоспалительных цитокинов IL-1а и TNF-а использовали метод иммуно-ферментного анализа с помощью наборов тест-систем фирмы «Bender Medsystems» (США) и иммуноферментного анализатора «Libline-90» (Австрия). Изучение уровня цитокинов проводили на 2-й день после моделирования ожогов, а также на 9-й и 18-й день лечения ран, что соответствует срокам течения всех фаз раневого процесса (гнойно-воспалительная фаза, фаза грануляции, фаза эпителизации).
Для дальнейшего иммуногистохими-ческого исследования ожоговой раны был выбран цитокин IL-1a, который непосредственно принимает участие в процессах формирования и функционирования кожи. Исследования клеток-продуцентов IL-1a проводили на 9-й день лечения ожогов (фаза грануляции) с помощью иммуно-гистофлуоресцентной реакции по методу Brozman на парафиновых срезах кожи [11]. Иммунные клетки дифференцировали с
помощью моноклональных антител к IL-1а. Исследовали микропрепараты на люминесцентном микроскопе «Axioscop-40» (Zeiss, ФРН). Фотографировали участки микропрепаратов с использованием цифровой фотокамеры «Pixera». Количественно оценивали наличие клеток-продуцентов IL-1a с помощью программы Photoshop-7 и специальной программы для морфоме-трии «Видеотест» (Санкт-Петербург).
Все вмешательства и эвтаназию животных осуществляли с соблюдением принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и научных целей» (Страсбург, 1986) и рекомендаций 1-го Национального конгресса по биоэтике (Киев, 2001). Полученные результаты обрабатывали по программе Statistica 6.0 на основе однофакторного дисперсионного анализа с использованием критериев Кру-скала-Уолиса, Ньюмена-Кейлса при уровне значимости р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Воспроизведение ожоговой травмы на коже у крыс сопровождалось образованием плотного струпа темно-бурого цвета с четко ограниченной зоной некроза и воспалением окружающих тканей. В первые дни после ожоговой травмы животные
были неактивными и имели плохой аппетит. Следует отметить, что на протяжении всего эксперимента гибели животных вследствие развития ожоговой болезни, как в экспериментальных, так и в группе контрольной патологии не наблюдали.
Исходная площадь ожоговых ран у животных в разных группах была размером от 574,8 ± 36,49 мм2 до 731,5 ± 47,37 мм2. Развитие ожогов у крыс на 2-й день эксперимента сопровождалось значительным повышением содержания цитокинов по сравнению с интактным контролем: ГЬ-1а в 32 раза (рисунок 1), Т№а в 15 раз (рисунок 2), что свидетельствует об активации иммунного ответа и каскада последующих реакций: гиперактивации фагоцитирующих клеток, вовлечении эпителиальных и эндотелиальных клеток, связанных с деструкцией тканей.
Дальнейшее наблюдение за динамикой заживления показало, что в группе контрольной патологии на 9-й день площадь ожогов уменьшалась на 53,5% по сравнению с исходной площадью, и в течение нескольких дней произошло отслоение струпа. В дальнейшем процесс заживления ускорялся: к 18-у дню площадь ожогов уменьшалась на 89,5%, а полное заживление происходило на 25-й день эксперимента. Изучение уровня провоспалительных цитокинов в динамике показало, что на 9-й день эксперимента
Интакт_2-й день_9-й день_18-й день
□ Контрольная патология ES1 Бепантен ЕЭ Керамиды В Декспантенол с керамидами
Примечание: * - показатели достоверны по отношению к группе интактного контроля; @ - по отношению к пику патологии (2-й день эксперимента); # - по отношению к группе контрольной патологии; $ - по отношению к препарату сравнения, р < 0,05.
Рисунок 1 - Динамика уровня цитокина ГЬ-1а в крови животных с ожоговой травмой под влиянием керамидов и их комбинации с декспантенолом
Примечание: * - показатели достоверны по отношению к группе интактного контроля; @ - по отношению к пику патологии (2-й день эксперимента); # - по отношению к группе контрольной патологии; $ - по отношению к препарату сравнения, р < 0,05.
Рисунок 2 - Динамика уровня цитокина Т№а в крови животных с ожоговой травмой под влиянием керамидов и их комбинации с декспантенолом
Интакт 2-й день 9-й день 18-й день
В Контрольная патология Б Бепантен Н Керамиды В Декспантенол с керамидами
наблюдалось снижение ГЬ-1а и Т№а в 1,6 раза, а на 18-й день уровень ГЬ-1а снижался в 5,4 раза, а Т№а - в 8,4 раза по отношению к пику патологии (на 2-й день эксперимента). Несмотря на значительное снижение уровня цитокинов в крови, их показатели достоверно превышали уровень показателей животных интактного контроля.
При лечении ожоговых ран динамика заживления имела следующую тенденцию: на 9-й день при лечении кремом «Декспантенол с керамидами» площадь ран по отношению к исходным данным уменьшалась на 72,9%, кремом «Керамиды» - на 63,2%, а кремом «Бепантен» - на 65%, на 18-й день - на 99,8%, 98,7% и 98,5%, соответственно. Полное заживление ран при лечении кремом «Декспантенол с керами-дами» происходило на 19-й день, что на 6 дней раньше, чем в группе контрольной патологии, а при лечении кремами «Кера-миды» и «Бепантен» - на 21-й день эксперимента, что на 4 дня раньше, чем в группе контрольной патологии.
Изучение содержания провоспалитель-ных цитокинов показало, что под действием кремов «Декспантенол с керамидами» и «Керамиды» уровень цитокина ГЬ-1а на 9-й день уменьшался в 5 раз и 3,7 раза, на 18-й - в 34 раза и 14,5 раза соответственно, а при лечении кремом «Бепантен» на 9-й день - в 2,4 раза, а на 18-й - в 5,6 раза по отношению к пику патологии. Уровень цитокина Т№а
уменьшался под влиянием кремов «Дек-спантенол с керамидами» и «Керамидами» на 9-й день - в 3,3 раза и 2,4 раза, на 18-й - в 22,5 раза и 13,6 раза соответственно, а под действием крема «Бепантен» - на 9-й день - в 2,2 раза, на 18-й - в 12,3 раза по отношению к пику патологии.
Следующим этапом работы было проведение иммуногистохимического исследования провоспалительных цитокинов в очаге термического воспаления. Оценивали содержание клеток-продуцентов ГЬ-1а, которые характеризуют активность формирования воспалительной реакции, необходимой для утилизации некротических масс в очаге повреждения. При оценке иммуногистохимической реакции на интерлейкин установлено, что на 9-й день наблюдения после термического повреждения кожи у животных, которых не лечили, в глубине раны, на уровне образующихся грануляций, ГЬ-1а-экспрессирующие клетки встречались относительно редко - только в пределах просвета и стенок сосудов (рисунок 3 а, см. обложку журнала). В глубине грануляционной ткани единичные ГЬ-1а-клетки-продуценты оказывались и вне сосудов, и на периферии раны. Однако под сохраненным эпидермисом можно было увидеть более многочисленные группы таких клеток (рисунок 3 б, см. обложку журнала). Относительное количество клеток-про-
дуцентов интерлейкина в коже у крыс составляло 0,406±0,006 у.е. (таблица).
Обработка ожоговой раны кремом «Керамиды» обеспечивает более выраженную васкуляризацию грануляционной ткани. Общее количество ГЬ-1а-экспрессирующих клеток было больше в
1,2 и 1,1 раза, чем в группе контрольной патологии и в группе леченных препаратом сравнения (таблица). Эти клетки выявлялись как в просвете тонкостенных сосудов грануляционной ткани, так и вне сосудов, в более глубоких слоях периферии раны (рисунок 3 в, см. обложку журнала).
Таблица - Относительное количество клеток-продуцентов ГЬ-1 а в коже с термическим ожогом у крыс при лечении исследуемыми средствами в поле зрения х 400
(в перерасчете на 100 клеток)
Группы эксперимента На 9-й день лечения
Контрольная патология 0,406 ± 0,006
Крем «Керамиды» 0,478 ± 0,010*'**
Крем «Декспантенол с керамидами» 0,783 ± 0,008*'**
Крем «Бепантен» 0,449 ± 0,004*
Примечание: * - отклонения достоверны по отношению к группе контрольной патологии; ** шению к препарату сравнения, р < 0,05.
- по отно-
Лечение ожоговой раны кремом «Декса-пантенол с керамидами» также способствовало повышению образования и миграции ГЬ-1а-экспрессирующих клеток, но преимущественно на периферии раны, т.е. в пери-фокальном воспалительном инфильтрате, а не в грануляционной ткани. Измерение интенсивности свечения клеток-продуцентов ГЬ-1а показало резкое увеличение свечения, а, следовательно, и активности интерлейки-на ГЬ-1а (рисунок 3 г, д, см. обложку журнала). Уровень свечения клеток-продуцентов при использовании крема «Декспантенол с керамидами» был в 1,9 раза выше, чем у не-леченных животных, и в среднем в 1,7 раза выше по сравнению с кремом «Бепантен» и кремом «Керамиды» (таблица).
При использовании крема «Бепантен» для лечения термического ожога у крыс количество ГЬ-1а-экспрессирующих клеток в капиллярах грануляционной ткани мало отличалось (в 1,1 раза) от их количества у животных из группы контрольной патологии (таблица). Немногочисленные клетки-продуценты ГЬ-1а занимали пристеночное положение в тонкостенных сосудах грануляционной ткани. Только глубоко в ране обнаруживалось большее количество этих клеток как в сосудах, так и вне их (рисунок 3 е, см. обложку журнала).
Таким образом, проведенные исследования показали, что ожоговая травма у крыс сопровождается значительным повышением провоспалительных цитокинов в крови и в ране, высокий уровень которых в течение всего периода наблюдений задерживает ее заживление. Применение ЛС с керамидами
и их комбинации с декспантенолом способствовало достоверному снижению уровня изучаемых провоспалительных цитокинов и по отношению к контрольной патологии, и при использовании ЛС сравнения, что подтверждает выраженную эффективность местного лечения ожоговых ран. Следует отметить, что использование исследуемых препаратов с различным механизмом ра-нозаживляющего действия вызывает однотипные изменения цитокинового профиля в крови и в очаге ожоговой раны. По степени выраженности нормализации уровня провоспалительных цитокинов у крыс препараты можно расположить в следующей последовательности: крем «Декспантенол с керамидами» > крем «Керамиды» > крем «Бепантен».
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Развитие раневого процесса у крыс с ожогами ША степени сопровождается многократным повышением уровня про-воспалительных цитокинов в крови (ГЬ-1а и Т№а) и в ткани (1Ь-1а). В ходе спонтанного заживления через 18 дней их уровень снижается, однако не достигает интактных значений, что свидетельствует о тяжести характера ожоговой травмы и увеличивает сроки заживления.
2. Лечение ожоговых ран кремами «Ке-рамиды» и «Декспантенол с керамидами» способствует положительной динамике уровня цитокинов (1Ь-1а и Т№а), восстановлению их интактных значений, ускоряет и сокращает сроки заживления на 4-6
дней. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли провоспалительных цитокинов при заживлении ожоговых ран и эффективности местного лечения. По выраженности ранозаживляющего действия исследуемые препараты превышают эффективность препарата сравнения.
3. Перспективным является дальнейшее доклиническое изучение спектра фармакологического действия керамидов и их комбинаций с декспантенолом с целью повышения эффективности местного лечения ожоговых ран на П-Ш фазах раневого процесса.
SUMMARY
Ya. A. Butko, S. M. Drogovoz, G. I. Gubina-Vakulik T. V. Gorbach DYNAMICS OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKINES LEVEL IN BURN INJURY IN RATS UNDER THE INFLUENCE OF CERAMIDES AND THEIR COMBINATION WITH DEXPANTHENOL The influence of creams with ceramides and their combination with dexpanthenol on the dynamics of pro-inflammatory cytokines level (IL and TNF) was studied on the model of burn injury in rats. It was found, that burn injury in rats is accompanied by significant increase in pro-inflammatory cytokines, which high level throughout the whole period of observation delays the healing of wound. Study results have shown that application of preparations with ceramides and their combination with dexpanthenol during the whole period of observation promoted burn wounds healing, and significantly decreased the level of pro-inflammatory cytokines, compared to the control pathology and reference-drug, which confirms expressed efficiency of burn wounds local treatment. It should be noted that application of investigational preparations with various mechanisms of wound healing action causes similar changes in cytokine profile in blood and burn wound lesion. Therefore, further study of these creams is promising in order to examine their mechanism of action on repair processes.
Keywords: cream, ceramides, dexpanthenol, burn injury, cytokines.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ткачева, О. В. Ожоги кожных покровов: классификация и методы лечения / О. В. Ткачева, Я. А Бутко // Провизор. -2008. - № 2. - С. 23-28.
2. Фисталь, Э.Я. Комбустиология /
3.Я. Фисталь, Г.П. Козинец, Г.Е. Самой-ленко. - Донецк. 2006.- 236 с.
3. Козинец, Г. П. Ожоговая интоксикация. Патогенез, клиника, принципы лечения / Г. П. Козинец, С. В. Слесаренко, Б.С. Шейман. - Киев.: Фенкс. - 2004. - 272 с.
4. Velnar, T. The wound healing process: an overview of the cellular and molecular mechanisms / T. Velnar, T. Bailey, V. Smrkolj // J. Int. Med. Res. - 2009. - Vol. 37, № 5. - Р. 1528-1542.
5. Динамика изменения активности цитокинов и функций нейтрофилов в крови крыс после термического ожога кожи /
B. И. Коненков [и др.] // Цитокины и воспаление. - 2007. - № 3. - С. 57-62.
6. Кетлинский, С. А. Цитокины /
C. А. Кетлинский, А. С. Симбирцев - СПб.: ООО Изд-во «Фолиант», 2008. - 552 с.
7. Use of gene-modified keratinocytes and fibroblasts to enhance regeneration in a full skin defect / J. A. Lohmeyer [et al.] // Langenbecks Arch Surg. - 2011. - Vol. 2, № 3. - P. 76-79.
8. Thermal dependence of Raman descriptors of ceramides. Part II: effect of chains lengths and head group structures / E. Guil-lard [et al.] // Anal Bioanal Chem. - 2010. -Vol. 3, N 399. - Р. 1201-1214.
9. Ceramides stimulate caspase-14 expression in human keratinocytes / Y. J. Jiang [et al.] // Exp. Dermatol. - 2013. - Vol. 2, № 22. - Р. 113-118.
10. Експериментальне вивчення нових препарапв для мюцевого лкування ран: метод.рекомендацп ДЕЦ МОЗ Укра'ши / Л. В. Яковлева [та шш.] - Х.: Вид-но НФаУ, 2013. - 52 с.
11. Патент на корисну модель №46489. Споаб кшькюного визначення вмюту антигену в бюлопчних тканинах / Г. I. Губша-Вакулик, I. В. Сорокша, В. Д. Марковсь-кий, О. В. Кихтенко, Л. С. Купрiянова, Р. В. Сидоренко // Опубл. 25.12.2009, Бюл. №
4. - 4 с.
Адрес для корреспонденции:
61002, Украина,
г. Харьков, ул. Мельникова, 12,
Национальный фармацевтический
университет,
кафедра фармакологии,
тел. (8057)706-30-69,
е-mail: yaroslavabutko79@mail.ru,
Бутко Я.А.
Поступила 21.11.2014 г.
Рисунки к статье И. А. Зупанец, Т. С. Сахарова, £. В. Ветрова, £. А. Зупанец «Изучение влияния производных глюкозамина на доксорубицин-индуцированную гибель
клеток в эксперименте» (С. 3-88)
а б
Рисунок 1 — Гистологическое строение печени: а - интактных крыс: нормальное состояние паренхимы (х250); б — крыс после введения ДОКС: гепатоциты с разной стадией лизиса ядер, тельце Каунсильмена (стрелка) (х400).
Гематоксилин-эозин
Рисунок 2 - Гистологическое строение печени крыс.
получавших на фоне Д( комбинацию КА+Кв: нормальная структура печеночных балок, отсутствие гемо-динамических расстройств (х200). Гематоксилин-эозин
Рисунок 3 - Вс1-2-позитивные клетки в микропрепаратах
печени. Иммуногистохимия (х150)
Рисунки к статье В. М. Ёршик «Противовирусная активность извлечений лимонника
китайского» (С. 96-100)
а б
Рисунок 2 — Микрофотографии пораженного (а) и нормального (б) монослоя клеток
Рисунки к статье Я. А. Бутко, С. М. Дроговоз, Г. И. Губина-Вакулик, Т. В. Горбач «Динамика уровня провоспалительных цитокинов при ожоговой травме у крыс под влиянием керамидов и их комбинации с декспантенолом» (С. 101-106)
где Группа 1Ь-1а положительных клеток в грануляционной ткани, которая формируется: в группе контрольной патологии (а, б); при лечении кремом «Керамиды» (в); кремом «Декспантенол с керамидами» (г, д); кремом «Бепантен» (е). Иммуногистохимическая реакция с антителами к ТЬ- 1а. Люминесцентная микроскопия х 100 (а, д) или х 600 (б-г, е). Рисунок 3 - Микропрепараты кожи крыс на 9-й день исследования ожоговой травмы
