Динамика субпопуляции В-лимфоцитов у больных системной красной волчанкой на фоне терапии генно-инженерными биологическими препаратами Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Динамика субпопуляции В-лимфоцитов у больных системной красной волчанкой на фоне терапии генно-инженерными биологическими препаратами

Меснянкина А.А.1, Соловьев С.К.1, Александрова Е.Н.1, Алексанкин А.П.1, Супоницкая Е.В.1, Елонаков А.В.2, Асеева Е.А.1, Насонов Е.Л.13

1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой», Москва, Россия; 2ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского», Москва, Россия; 3ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, кафедра ревматологии Института профессионального образования, Москва, Россия 1115522 Москва, Каширское шоссе, 34А; 2129110 Москва, ул. Щепкина 61/2; 3119991 Москва, ул.Трубецкая, 8, стр.2

1V.A. Nasonova Research Institute of Rheumatology, Moscow, Russia; 2M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, Moscow, Russia; department of Rheumatology, Institute of Professional Education, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Health of Russia, Moscow, Russia

134A, Kashirskoe Shosse, Moscow 115522; 261/2, Shchepkin St., Moscow 129110; 38, Trubetskaya St., Build. 2, Moscow 119991

Контакты: Анна Александровна Меснянкина; a.a.mesnyankina@gmail.com

Contact:

Anna Mesnyankina; a.a.mesnyankina@gmail.com

Поступила 29.03.17

Цель исследования — изучить исходный уровень и динамику субпопуляций В-клеток в периферической крови больных системной красной волчанкой (СКВ) в сопоставлении с клиническими проявлениями заболевания на фоне терапии ритуксимабом (РТМ) и белимумабом (БЛМ).

Материал и методы. Пациенты с достоверным диагнозом СКВ, с высокой и средней степенью активности заболевания по индексу SLEDAI-2K (n=49), разделены на три группы: 40 больных получали РТМ, 5 пациентам назначался БЛМ, 4 больным проводилась комбинированная терапия (двойная анти-В-клеточная терапия) РТМ + БЛМ. Определение субпопуляций В-лимфоцитов в периферической крови методом многоцветной проточной цитофлюориметрии с использованием панели моноклональных антител к поверхностным мембранным маркерам В-лимфоцитов и клинико-иммунологическое обследование больных проводились до начала терапии генно-инженерными биологическими препаратами и каждые 3 мес в течение года. Результаты и обсуждение. Пациенты с высокой активностью СКВ (SLEDAI-2K 18±5) и поражением жизненно важных органов, как правило, имели более высокие уровни двойных негативных клеток «памяти» (r=0,52; p<0,001) при относительно низких количествах наивных В-клеток (r=-0,54; p<0,0007), по сравнению с больными без тяжелой органной патологии (SLEDAI-2K 8±2). Терапия РТМ к 3-му месяцу наблюдения приводила к заметному уменьшению количества наивных и двойных негативных В-клеток «памяти», в меньшей степени — «непереключенных» и «переключенных» В-клеток «памяти». Быстрое восстановление числа В-клеток «памяти» и плазмобластов после курса РТМ к 6-му месяцу от начала терапии должно оцениваться как предиктор раннего обострения СКВ. У всех 5 пациентов, получающих БЛМ на различных этапах контроля, наблюдалось уменьшение клинико-лабораторных признаков активности СКВ, а также угнетение наивных В-клеток, плазматических клеток и плазмобластов. Двойная анти-В-клеточная терапия наиболее эффективно обеспечивала снижение активности заболевания к 3-му месяцу, пролонгировала достигнутую ремиссию, способствовала достижению и сохранению низкого уровня В-лимфоцитов на последующих этапах контроля, дальнейшему сокращению количества плазмобластов и плазматических клеток, препятствовала синтезу аутоантител. Заключение. Оценка динамики субпопуляций В-лимфоцитов в периферической крови предоставляет новые возможности в определении нарушения функции и регуляции клеточного иммунитета у больных СКВ, может быть полезным диагностическим параметром для мониторинга аутоиммунного заболевания, а также являться ценным инструментом в оценке и прогнозировании ответа.

Ключевые слова: В-лимфоциты; системная красная волчанка; лечение; ритуксимаб; белимумаб. Для ссылки: Меснянкина АА, Соловьев СК, Александрова ЕН и др. Динамика субпопуляции В-лимфоцитов у больных системной красной волчанкой на фоне терапии генно-инженерными биологическими препаратами. Научно-практическая ревматология. 2017;55(3):252-260.

THE TIME COURSE OF CHANGES IN B LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS IN PATIENTS WITH SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS DURING THERAPY WITH BIOLOGICAL AGENTS Mesnyankina A.A.1, Solovyev S.K.1, Aleksandrova E.N.1, Aleksankin A.P.1, Suponitskaya E.V.1, Elonakov A.V.2, Aseeva E.A.1, Nasonov E.L.1, 3

Objective: to study the baseline level and time course of changes in peripheral blood B cell subpopulations in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) versus the clinical manifestations of the disease during therapy with ritux-imab (RTM) and belimumab (BLM).

Subjects and methods. 49 patients with a documented diagnosis of SLE and high and moderate SLEDAI-2K values were divided into three groups: 1) 40 patients received RTM, 2) 5 patients took BLM; 3) 4 patients had combination therapy (dual anti-B-cell therapy) with RTM + BLM. Peripheral blood B lymphocyte subpopulations were measured by multicolor flow cytometry using a panel of monoclonal antibodies against surface membrane markers of B lymphocytes; the patients underwent clinical immunological examination before therapy with biological agents and every 3 months during a year.

Results and discussion. Patients with high SLE activity (SLEDAI-2K 18±5) and involvement of vital organs had generally higher levels of double negative memory cells (r = 0.52; p < 0.001) with relatively low counts of naive B cells (r=-0.54; p < 0.0007) than those without severe organ pathology (SLEDAI-2K 8±2). RTM therapy at 3 month of follow-up resulted in a noticeable decrease in the number of naive and double negative memory B cells and to a lesser extent in that of non-switched and switched memory B cell. A rapid recovery of the count of memory B cells and plas-mablasts after a RTM cycle at 6 months after therapy initiation should be evaluated as a predictor of early exacerbation of SLE. There was a reduction in the clinical and laboratory signs of SLE activity, as well as inhibition of naive B cells, plasma cells, and plasmablasts in all the 5 patients receiving BLM at various stages of follow-up. Dual anti-B cell therapy most effectively reduced disease activity at 3 months, prolonged the achieved remission, contributed to the achievement and maintenance of a low B lymphocyte level at later stages of control, to the further decline in the number of plasmablasts and plasma cells, and prevented the synthesis of autoantibodies.

Conclusion. Assessment of the time course of changes in peripheral blood B lymphocyte subpopulations provides new opportunities to identify impaired function and regulation of cellular immunity in patients with SLE, it may be a useful diagnostic parameter to monitor an autoimmune disease and a valuable tool to assess and predict a response.

Key words: B lymphocytes; systemic lupus erythematosus; treatment; rituximab; belimumab.

For reference: Mesnyankina AA, Solovyev SK, Aleksandrova EN, et al. The time course of changes in B lymphocyte subpopulations in patients with systemic lupus erythematosus during therapy with biological agents. Nauchno-Prakticheskaya Revmatologiya = Rheumatology Science and Practice. 2017;55(3):252-260 (In Russ.).

doi: http://dx.doi.org/10.14412/1995-4484-2017-252-260

Системная красная волчанка (СКВ) — аутоиммунное ревматическое заболевание неизвестной этиологии, патогенез которого заключается в нарушении активации Т- и В-лимфоцитов, гиперреактивности В-клеток с неконтролируемым синтезом широкого спектра аутоанти-тел к ядерным антигенам и формированием иммунных комплексов, вызывающих иммуновоспалительное повреждение внутренних органов [1].

Исследования последних лет свидетельствуют о важной роли в развитии и течении заболевания анти-телопродуцирующих клеток и их предшественников — В-лимфоцитов. В норме В-клетки человека имеют сложный цикл развития, обеспечивающий формирование В-клеточной толерантности к собственным антигенам [2]. Нарушение этих механизмов приводит к формированию аутореактивных клонов В-клеток, синтезирующих антитела к множеству аутоантигенов, среди которых при СКВ доминируют антитела к нативной ДНК (нДНК). Помимо этого, В-лимфоциты участвуют в синтезе цитоки-нов, а также презентации антигена Т-лимфоцитам [3]. В результате активированные лимфоциты, иммунные комплексы индуцируют воспалительный процесс в тканях. Эти данные обосновывают ведущее значение В-кле-ток в патогенезе СКВ.

К настоящему времени разработаны и активно применяются в клинической практике генно-инженерные биологические препараты (ГИБП) ритуксимаб (РТМ) и белимумаб (БЛМ), механизм действия которых тем или иным образом направлен на подавление В-лим-фоцитов. РТМ и БЛМ неоднократно доказывали свою эффективность у пациентов с тяжелой, рефрактерной к стандартной терапии СКВ [4—7]. Маркерами эффективности такой терапии, как правило, служили степень деплеции В-клеток, динамика клинических и лабораторных признаков активности заболевания, а предиктором обострения являлась репопуляция или сохранение остаточных В-лимфоцитов после курса ГИБП [4—10]. Тем не менее при использовании одинаковых схем лечения у, казалось бы, схожих по клиническому течению больных не всегда удается достигнуть эффекта от терапии и ремиссии заболевания, равно как и восстановление пула CD19+ В-лимфоцитов не всегда означает рецидив СКВ.

Вполне закономерно нарастает интерес к изучению конкретных участников патогенеза заболевания, а поскольку В-клетки играют огромную роль в развитии СКВ, определение роли отдельных субпопуляций В-лимфоци-тов, а также влияния на них анти-В-клеточных препаратов может иметь большое значение в оценке эффективности терапии и прогнозе. В нескольких клинических исследованиях при изучении развернутой формулы В-кле-ток у больных с активной формой СКВ был обнаружен ряд закономерных особенностей в базальной характеристике субпопуляций В-лимфоцитов и их динамики после

применения терапии. Так, отмечалось значительное увеличение содержания двойных негативных В-лимфоцитов «памяти», что коррелировало с развитием СКВ, высокой активностью волчаночного нефрита и наличием аутоан-тител (к нДНК, 8ш, рибонуклеопротеину) [11, 12]. Высокие уровни плазматических клеток выявлены у пациентов, позитивных по антителам к Яо, и 8ш, а количество короткоживущих плазматических клеток коррелировало с активностью заболевания. Уровень циркулирующих субпопуляций В-лимфоцитов (наивные В-клетки, В-клет-ки «памяти» и плазматические клетки) не зависел от возраста или пола больных, однако некоторые авторы считают, что он может зависеть от продолжительности заболевания [8].

РТМ и БЛМ по-разному влияют на В-лимфоци-ты. Лечение РТМ, направленное на подавление CD20+ В-лимфоцитов, приводило к быстрому исчезновению наивных и двойных негативных В-лимфоцитов «памяти», резидуальными клетками оставались преимущественно В-клетки «памяти» и плазматические клетки [13]. Долгосрочный ответ был связан с неполным и медленным восстановлением числа В-лимфоцитов «памяти» и плазмобластов, а их ранняя репопуляция ассоциировалась с обострением [9, 10]. Лечение БЛМ приводило к снижению числа наивных и переходных В-клеток с умеренным уменьшением количества плазматических клеток и ассоциировалось со снижением активности заболевания [14].

Дискуссионным вопросом является схема применения комбинированной терапии ГИБП, заключающаяся в использовании РТМ для получения быстрого эффекта с последующим назначением БЛМ с целью поддержания низкой активности и достижения ремиссии. Перекрывающие друг друга механизмы действия препаратов должны способствовать подавлению большой группы субпопуляций В-лимфоцитов, уменьшению их активации, В-клеточной гиперреактивности и как следствие снижению содержания широкого спектра аутоантител [15-17].

Таким образом, на основании полученных данных были выдвинуты предположения о возможных предикторах эффективности терапии и обострения СКВ на основании подробного анализа клеточных субпопуляций, что в будущем позволит прогнозировать и предупреждать рецидив заболевания.

Целью исследования является изучение исходных уровней и динамики субпопуляций В-клеток периферической крови у больных СКВ в сопоставлении с клиническими проявлениями заболевания на фоне терапии РТМ и БЛМ.

Материал и методы

В исследование включено 49 пациентов с достоверным диагнозом СКВ высокой и средней степени активно-

сти заболевания, а также 20 здоровых доноров (табл. 1). Девять пациентов с дебютом СКВ ранее не получали терапию по основному заболеванию. Назначение ГИБП было обусловлено высокой активностью заболевания, неэффективностью высоких доз ГК и цитотоксических препаратов, а также наличием сопутствующих заболеваний, ограничивающих возможность применения стандартной терапии.

После проведенного обследования пациенты были разделены на три группы. В первую вошли 40 пациентов, получавших РТМ в дозе 500—2000 мг. Пяти больным второй группы назначался БЛМ в дозе 10 мг/кг массы тела. Четырем больным третьей группы проводилась комбинированная терапия: им вводился РТМ в дозе 1000 мг, а через 3 мес назначался БЛМ по стандартной схеме — 10 мг/кг 1 раз в месяц в течение 8 мес (табл. 2). Во время повторных визитов (через 3, 6, 9 мес) 11 пациентам из первой группы осуществлено плановое введение РТМ в дозе 500-1000 мг.

До введения ГИБП, а затем каждые 3 мес в течение года проводилось клинико-иммунологическое обследование больных и определение субпопуляций В-лимфоцитов в периферической крови. Оценка результатов осуществля-

Таблица 1 Характеристика пациентов, включенных в наблюдение

Показатель Значение

Возраст, годы, Ме [25-й; 75-й перцентили] 36 [28; 43]

Пол, женщины/мужчины, п 45/4

Длительность заболевания, п

0-1 год 24

2-9 лет 13

>10 лет 12

SLEDAI-2K, баллы, Ме [25-й; 75-й перцентили] 15 [10; 18]

SLEDAI-2K, п:

активность 2-й степени 14

активность 3-й степени 35

BILAG total, Ме [25-й; 75-й перцентили] 17,5 [13; 22]

SLICC/ИП >1, п (%) 20 (40,8)

Поражение органов и систем, п (%):

люпус-нефрит 18 (36,7)

нейролюпус 5 (10,2)

васкулит 11 (22,4)

поражение кожи 22 (45,9)

поражение слизистых оболочек 17 (34,7)

артрит 23 (47)

серозит 16 (32,6)

гематологические нарушения 25 (51)

Тяжелое поражение внутренних органов и систем 29 (59,2)

(нейролюпус, люпус-нефрит, васкулит), п (%)

Предшествующая терапия, п (%):

не проводилась 9 (18,4)

ГК <30 мг/сут 8 (16,3)

ГК >30 мг/сут 32 (65,3)

ПТ ГК 26 (53)

ПТ ЦФ 16 (32,6)

ММФ 6 (12,2)

противомалярийные препараты 28 (57,1)

ВВИГ 8 (16,3)

ГИБП 5 (10,2)

Примечание. ПТ - пульс-терапия, ВВИГ - внутривенный иммуноглобулин, ЦФ - циклофосфан, ММФ - микофенолата мофетил, ГК - глюкокортикоиды.

лась при помощи индексов SLEDAI-2K, BILAG, индекса обострения SFI (умеренное, тяжелое обострение), индекса ответа на терапию SRI.

Исследовали абсолютное количество CD19+ В-клеток, В-клеток «памяти» (CD19+CD27+), «непереключенных» (CD19+IgD+CD27+) и «переключенных» (CD19+IgD-CD27+) В-клеток «памяти», наивных (CD19+IgD+CD27-), транзиторных (CD19+IgD+CD10+CD38++CD27-) В-кле-ток, плазмобластов (CD19+CD38+++IgD-CD27+CD20-), плазматических клеток (CD19+CD38+), двойных негативных В-клеток (CD19+CD27-IgD-). Все субпопуляции В-клеток определялись в периферической крови методом многоцветной проточной цитофлюориметрии с использованием панели моноклональных антител к поверхностным мембранным маркерам В-лимфоци-тов. Оценку результатов четырехцветного окрашивания В-лимфоцитов проводили на проточном цитофлюори-метре Beckman Coulter NAVIOS (Beckman Coulter, США). Для каждого анализа подсчитано 50 тыс. событий. B-клеточные популяции идентифицировали c помощью программного обеспечения CXP (Beckman Coulter, США). При гейтировании по горизонтальной и вертикальной осям определяли процентное содержание лимфоцитов (CD45+) и В-клеток (CD19+), а на основании экспрессии поверхностных мембранных маркеров IgD, CD20, CD27, CD38, CD10 и CD138 проводили количественное определение субпопуляций В-клеток (см. табл. 1) [18].

Деплецией CD19+ В-лимфоцитов после курса РТМ считалось снижение их количества ниже 0,5%: 0% — полная деплеция, 0,1—0,5% — частичная деплеция, >0,5% — отсутствие деплеции.

Статистическая обработка результатов проводилась с применением программы Statistica 7.0 (StatSoft, США), включая методы непараметрического анализа. Для параметров, распределение которых отличалось от нормального, при сравнении двух групп использовался U-критерий Манна—Уитни, результаты представлены в виде медианы (Ме) [25-го; 75-го перцентилей]. Применялись также методы описательной статистики. Корреляционный анализ проводился с использованием рангового коэффициента корреляции Спирмена. Статистическая значимость определялась как p<0,05.

Результаты

Исходная характеристика субпопуляций В-лимфоци-тов. При подсчете базального количества субпопуляций В-клеток у больных СКВ выявлено высокое процентное и абсолютное содержание наивных, двойных негативных, «переключенных» В-клеток «памяти». В сравнении со здоровыми донорами, обращал на себя внимание более высокий уровень двойных негативных В-клеток и плазматических клеток (табл. 3).

В последующем до начала статистической обработки с целью предоставления точных результатов базального количества В-лимфоцитов у пациентов с СКВ из таблицы исходных данных были исключены 5 больных с предшествующей терапией РТМ, а также 5 пациентов с исходно низким содержанием В-лимфоцитов (CD19+ <3%). Последние имели высокую активность заболевания (трое — с проявлениями васкулита, дигитальных ос-кольчатых капилляритов, феноменом Рейно; у двоих было поражение кожи, слизистых оболочек, суставов,

Таблица 2

Проводимая терапия, г

Визит

Всего

РТМ

БЛМ

РТМ+БЛМ

Повторные инфузии РТМ

500 мг

1000 мг

Исходно 49 40 5 4

3 мес 39 30 5 4 1 -

6 мес 33 24 5 4 3 4

9 мес 25 19 3 3 1 2

12 мес 23 19 1 3 - -

Таблица 3

Базальные уровни субпопуляций В-лимфоцитов у пациентов с СКВ, Ме [25-й; 75-й перцентили]

В-лимфоциты

Молекулярные маркеры

Больные СКВ (n=49), процентное соотношение (%) / абсолютные значения ( • 109/л)

Здоровые добровольцы (n=20), процентное соотношение (%) / абсолютные значения ( • 109/л)

Общая популяция В-лимфоцитов Наивные (зрелые) В-лимфоциты В-клетки «памяти»

«Непереключенные» В-клетки «памяти» «Переключенные» В-клетки «памяти» Плазматические клетки Плазмобласты

Двойные негативные В-клетки

CD19+ CD19+CD27-IgD+

CD19+CD27+ CD19+CD27+IgD+ CD19+CD27+IgD-CD19+CD38+ CD19+CD38+++IgD-CD27+CD20-CD19+CD27-IgD-

9,6 [5,9; 14,6] / 0,13 [0,07; 0,29] 66,4 [52,5; 75,9] / 0,1 [0,04; 0,2] 1,2 [0,8; 1,8] / 0,001 [0,0008; 0,004] 3,4 [1,9; 7,9] / 0,005 [0,002; 0,015] 5,9 [2,2; 11,3] / 0,01 [0,004; 0,02] 0,55 [0,1; 6,3] / 0,0015 [0,0002; 0,008] 0,3 [0,1; 0,6] / 0,00032 [0,0002; 0,0008] 20,8 [12,2; 35,3] / 0,029 [0,0147; 0,05]

8,5 [7,2; 11,0] / 0,2 [0,1; 0,2]

64.7 [57,6; 72,4] / 0,1 [0,06; 0,1] 2,2 [1,1; 3,0] / 0,003 [0,001; 0,007] 7,4 [3,7; 11,1] / 0,01 [0,005; 0,02]

12.8 [9,3; 17,0] / 0,02 [0,01; 0,04] 0,1 [0,05; 0,1] / 0,0001 [0,00; 0,0002] 0,1 [0,1; 0,2] / 0,0002 [0,0001; 0,0004]

13,3 [7,1; 19,3] / 0,02 [0,01; 0,02]

гематологические нарушения; SLEDAI-2K — 12—37 баллов), только двое пациентов имели предшествующую терапию цитостатиками более чем за 1 год до момента включения в исследование, один — проходил ежегодные курсы плазмафереза. Ни один из них не получал ранее ГИБП.

Таким образом, исходное количество В-лимфоци-тов оценивалось у 39 пациентов, которые были условно разделены на две группы: с высокой степенью активности заболевания, обусловленной тяжелым поражением внутренних органов и систем (люпус-нефрит, нейролюпус, проявления васкулита; n=24, среднее значение SLEDAI-2K - 18±5, медиана BILAG - 20 [17; 26]) и средней степенью активности заболевания без поражения жизненно важных органов (ЖВО; n=15, среднее значение SLEDAI-2K - 8±2, медиана BILAG - 16 [9; 17]). Эти группы не различались между собой по возрасту и длительности заболевания.

У пациентов с поражением почек, центральной нервной системы, проявлениями васкулита выявлено перераспределение процентного количества субпопуляций в сторону увеличения процентного содержания двойных негативных клеток «памяти» (без поражения ЖВО - 13,6 [10,4; 20,7]%, с поражением ЖВО - 26,3 [18,4; 41,2]%; г=0,52; p<0,001), в то время как уровень наивных В-лимфоцитов был ниже (62 [43; 68]%) по сравнению с больными СКВ без органной патологии (76 [66; 84]%; r=-0,54; p<0,0007; рис. 1). Определялось также некоторое увеличение абсолютного количества наивных В-лимфоцитов у больных без поражения ЖВО, однако статистически достоверных различий не выявлено (p=0,052), что, возможно, обусловлено небольшим числом включенных на настоящий момент больных.

Статистически значимой корреляции содержания антител (в том числе антител к нДНК, Ro, Lа) и определенных субпопуляций В-клеток у представленных 39 больных выявить не удалось.

Также в группах обнаружены достоверные различия длительности заболевания с момента установления диагноза и начала лечения. Процентное содержание общей популяции CD19+ В-лимфоцитов было ниже у пациентов с длительностью заболевания >1 года (n=15; p<0,04; рис. 2).

Динамика субпопуляций В-лимфоцитов на фоне терапии ритуксимабом. Деплеция — 3-й месяц после введения ГИБП. Степень деплеции В-клеток к 3-му месяцу не зави-

100

80

60

40

20

0

1 0 1 - поражение ЖВО (г=24) 0 - нет поражения ЖВО (г=15) [о] Наивные В-лимфоциты g Двойные негативные В-лимфоциты р<0,002*

Рис. 1. Процентное содержание наивных и двойных негативных В-лимфоцитов у пациентов с поражением и без поражения ЖВО

села от базального количества определенных субпопуляций В-лимфоцитов, активности СКВ, возраста пациентов и длительности заболевания.

К 3-му месяцу полной деплеции удалось достичь у 53% пациентов, и к 6-му месяцу она сохранялась у 26% больных (табл. 4, рис. 3).

У пациентов с частичной деплецией, ответивших на лечение, к 3-му месяцу после одного курса РТМ отмеча-

0 1 0-я группа - <1 года (п=16) 1-я группа - >1 года (п=23) □ Ме □ 25-й; 75-й перцентили х Мт-тах

Рис. 2. Процентное содержание CD19+ В-лимфоцитов у пациентов в дебюте СКВ и у больных с давностью заболевания >1 года (6 [3; 12])

Таблица 4 Степень деплеции В-лимфоцитов к 3-му месяцу наблюдения, п (%)

Доза РТМ, мг

Деплеция к 3-му месяцу наблюдения

(число больных) полная деплеция частичная деплеция нет деплеции

500 (n=6) 2 (33) 4 (67) -

1000 (n=21) 11 (52,4) 6 (28,6) 4 (19)

2000 (n=3) 3(100) - -

Всего (n=30) 16 (53) 10 (33) 4 (14)

С поражением ЖВО 12 (40) 5 (16) 2 (7)

Без поражения ЖВО 4 (13) 5 (16) 2 (7)

70 60 Ï 50

0

1 40

s

i 30 â 20 10 0

3 мес (n=30) 6 мес (n=23) 9 мес (n=12) 12 мес (n=10) □ Полная деплеция □ Частичная деплеция □ Нет деплеции

Рис. 3. Число пациентов, у которых сохраняется деплеция CD19+ В-лимфоцитов (во время последующих визитов исключены пациенты, получившие курс РТМ через 6 и 9 мес)

лось снижение уровней всех субпопуляций В-клеток, такая терапия приводила к быстрому истощению пула наивных и двойных негативных В-клеток «памяти». Резиду-альными клетками являлись, главным образом, наивные (0,0005 [0,0003; 0,001] • 109/л), «непереключенные» (0,00055 [0,00003; 0,001]«10'/л), «переключенные» (0,0005 [0,0002; 0,001]«109/л), двойные негативные В-клетки «памяти» (0,0006 [0,0003; 0,001]«10'/л), а их процентное распределение в группе составляло: 19,7 [13,5; 32,7]%, 20,5 [2,5; 30]%, 27,65 [6,7; 52,7]%, 19,7 [14,9; 40]% соответственно. Следует отметить, что такое соотношение обусловлено более низкой деплецией и сохранением «непере-ключенных» и, в большей степени, «переключенных» В-клеток «памяти».

У пациентов с отсутствием деплеции выявлено снижение абсолютных значений всех популяций В-клеток по сравнению с базальными уровнями, однако их процентное распределение не отличалось от исходного, а именно — сохранялся сдвиг формулы в сторону увеличения доли наивных и двойных негативных В-клеток (69,7 [43,5; 80,4]% и 17,6 [12,4; 40,85]% соответственно). Двое больных с отсутствием деплеции после одного курса РТМ имели неблагоприятные реакции (крапивница, гриппо-подобный синдром), у одного пациента ответа на терапию не наблюдалось, и ему продолжено лечение РТМ по 500 мг 1 раз в 3 мес в течение года до достижения депле-ции В-лимфоцитов.

Пациенты с частичной и полной деплецией к 3-му месяцу не различались по степени активности заболевания (SLEDAI-2K 6 [2; 10] и 6 [4; 8], BILAG - 8 [0; 12] и 8 [0; 9]) и концентрации антител к нДНК (53,7 [23; 112] и 52,8 [28; 75,4] Ед/мл) соответственно, однако уровни С3с-, С4-компонентов комплемента при полной депле-ции были значительно выше, чем при частичной (С3с -1,04 [0,91; 1,18] и 0,75 [0,67; 0,92] г/л, С4 - 0,18 [0,155; 0,26] и 0,13 [0,1; 0,155] г/л соответственно; p<0,019). Больные с отсутствием деплеции демонстрировали лишь незначительное повышение уровня антител к нДНК (81,1 [31; 190] Ед/мл).

Репопуляция. Репопуляция к 6-му месяцу наблюдения отмечалась у 74% больных за счет наивных, «переключенных», «непереключенных» В-клеток «памяти», двойных негативных, в меньшей степени - плазмобластов и плазматических клеток, однако полного восстановления субпопуляций В-лимфоцитов до исходных значений не выявлено ни у одного больного. Пациенты с обострением и без обострения СКВ имели одинаково высокие уровни наивных В-лимфоцитов (0,006 [0; 0,008]«10'/л).

У 4 больных с обострением СКВ одновременно с увеличением активности заболевания (SLEDAI-2K — 15 [13; 21]) и повышением уровня антител к нДНК (224 [131; 300]) выявлена более быстрая репопуляция двойных негативных, «непереключенных», «переключенных» В-клеток «памяти», плазмобластов по сравнению с пациентами без раннего обострения (0,0035 [0,0019; 0,005] и 0,0005 [0,0 0,002]«10'/л; 0,0024 [0,0005; 0,005] и 0,00014 [0,0 0,00085]»10'/л; 0,001 [0,0003; 0,0035] и 0,00015 [0,0 0,001]*109/л; 0,000015 [0,000009; 0,00006] и 0,000002 [0 0,00001]*109/л соответственно; рис. 4).

У двух из трех пациентов с более поздним обострением (>6 мес после введения РТМ) к визитам на 9-м и 12-м месяцах соответственно содержание В-клеток было <0,4% от общего числа лимфоцитов, однако обострение у таких

больных наблюдалось после восстановления клеток «памяти» (до 0,000007 и 0,00001 • 109/л соответственно) и увеличения количества двойных негативных В-клеток (до 0,003 и 0,001 • 109/л соответственно). К 9-му месяцу у одного больного произошла полная репопуляция до исходных значений всех субпопуляций В-клеток, однако обострение в виде усиления кожных высыпаний и повышения иммунологической активности у него выявлено только к 12-му месяцу наблюдения.

Терапия белимумабом. БЛМ получали пациенты со средней степенью активности заболевания и высокой иммунологической активностью, без признаков органной патологии. Ответ на терапию в виде постепенного уменьшения клинико-лабораторных показателей активности СКВ (ВШАв - 16 [13; 17], 8 [1; 8], 8 [1; 9], 5 [2; 12]; SLEDAI-2K — 8 [8; 10], 6 [5; 8], 6 [4; 8], 5 [4; 7] исходно, через 3, 6, 9 мес соответственно), снижения уровней антител кнДНК (87 [73; 137], 140,9 [55; 144], 73,9 [41,9; 139], 43,7 [42,3; 81] Ед/мл), нарастания концентрации компонентов комплемента у 4 пациентов отмечался в различные периоды наблюдения, и в одном случае сохранялась средняя активность заболевания.

На протяжении 9 мес наблюдения у представленных больных выраженного влияния на уровень CD19+ В-лимфоцитов препарат не оказывал. Изменения субпопуляций В-клеток на фоне терапии БЛМ характеризовались нарастанием числа двойных негативных (0,01 [0,01; 0,044], 0,02 [0,01; 0,076], 0,03 [0,02; 0,046], 0,04 [0,025; 0,075]«10'/л), «непереключенных» В-клеток «памяти» (0,0017 [0,001; 0,003], 0,029 [0,008; 0,04], 0,006 [0,002; 0,03], 0,025 [0,007; 0,065]«10'/л) с одновременным снижением содержания наивных В-лимфоцитов (0,09 [0,03; 0,105], 0,02 [0,02; 0,12], 0,02 [0,02; 0,03], 0,025 [0,02; 0,065]«10'/л), плазматических клеток (0,0001 [0,00007; 0,013], 0,00006 [0,00004; 0,029], 0,00008 [0; 0,007], 0 [0; 0,005]«10'/л) и плазмобластов (0,0005 [0,0001; 0,0007], 0,0003 [0,0002; 0,0006], 0 [0; 0], 0,0001 [0,00005; 0,0002]«10'/л) исходно, через 3, 6 и 9 мес соответственно (рис. 5).

Двойная терапия. Возраст пациентов, которым проводилась комбинированная терапия РТМ и БЛМ, варьировал от 20 до 25 лет. Все больные получали стандартную терапию согласно принятым рекомендациям. Два пациента имели органные поражения (люпус-нефрит, признаки васкулита), два — поражение кожи, суставов, слизистых оболочек.

Двойная анти-В-клеточная терапия приводила к быстрому снижению активности заболевания (ВГЬАв и SLEDAI-2K; рис. 6). Благодаря такому эффекту удалось снизить дозу ГК без риска нового обострения ниже 15 мг/сут (в пересчете на преднизолон). К 3-му месяцу полная деплеция достигнута у двух пациентов, частичная депле-ция — у одного, и еще у одного деплеции не было. У последней больной на фоне лечения БЛМ количество В-лимфо-цитов продолжало снижаться.

Несмотря на восстановление числа В-лимфоцитов к 6-му месяцу, что наблюдалось и при монотерапии РТМ, репопуляция основных групп В-лимфоцитов происходила медленнее (рис. 7). К 6-му месяцу выявлена тенденция к сокращению количества плазматических клеток и плазмобластов (к 6-му, 9-му месяцам; рис. 8). Несмот-

ря на нарастание к 9-му и 12-му месяцам количества CD19+ В-лимфоцитов, обострения СКВ не было ни у одного пациента.

0,0005

Без обострения СКВ I | Двойные негативные

С обострением СКВ

Рис. 4. Уровень двойных негативных В-лимфоцитов «памяти» и активность СКВ (Б1^А1-2К) у пациентов с ранним обострением и отсутствием обострения СКВ к 6-му месяцу после введения РТМ

0,03 0,02 0,01 0

Исходно 3 мес 6 мес

Двойные негативные В-лимфоциты О «Непереключенные» В-лимфоциты О Наивные В-лимфоциты

9 мес

0,0006

0,0005 -

0,0004 -

0,0003 -

0,0002 -

0,0001 .

0

Исходно 3 мес

Г"| Плазмобласты

6 мес 9 мес

О Плазматические клетки

Рис. 5. Динамика абсолютного количества субпопуляций В-кле-ток на фоне терапии БЛМ (• 109/л)

2

0

18 16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 -0

Исходно

3 мес 6 мес 9 мес

BILAG —□— SLEDAI-2K

Рис. 6. Динамика активности СКВ по SLEDAI-2K и BILAG

£ 0,8 о

L 0,7 то

о 0,6

12 мес

ли0,5

D0,4

ст0,3

0,2

т0,1

•Ф. С. Л. Х.

Исходно 0,2880 0,7400 0,11

0,08

3 мес 0 0 0,01 0,01

6 мес 0 0,01 0,01 0,007

9 мес 0,004 0,01 0,02

Рис. 7. Динамика абсолютного количества CD19+ лимфоцитов у 4 пациентов (Ф., С., Л., Х.) на фоне комбинированной терапии и лечения РТМ, абсолютные значения • 109/л. Серая шкала - количество CD19+ у пациентов, находящихся на комбинированной терапии РТМ и БЛМ; белая шкала -количество CD19+ у пациентов, находящихся на терапии РТМ (повторных инфузий РТМ в течение наблюдения не было или такие пациенты были исключены в последующем)

3 мес

0,00030

0,00025

0,00020

0,00015

0,00010

0,00005

Î

6 мес

' I

9 мес

Л. Х. Ф. С. Л. Х. □ Плазматические клетки

I

Ф.

Î

С. Л. Х. Ф î Плазмобласты

Рис. 8. Количество плазмобластов и плазматических клеток у 4 пациентов, находящихся на комбинированной терапии, в динамике на 3, 6, 9, 12-м месяцах

Обсуждение

В нашей работе изучались связь между соотношением субпопуляций В-клеток и активностью СКВ, гомеостаз В-клеток на фоне лечения ГИБП, возможность идентификации среди субпопуляций В-клеток потенциальных предикторов ответа, эффективности терапии ГИБП и развития обострения СКВ.

Полученные нами результаты свидетельствуют о значимом увеличении процентного соотношения двойных негативных В-клеток «памяти», что подтверждается данными других авторов [12], а также о снижении количества наивных В-клеток у пациентов с высокой активностью СКВ, обусловленной поражением внутренних органов и систем. Возможно, низкий уровень наивных В-клеток в данном случае обусловлен их усиленным потреблением на последующих этапах развития В-лимфо-цитов с нарастанием количества В-клеток «памяти», антителопроду-цирующих клеток (периферической крови и тканевых), что приводит к увеличению синтеза аутоантител, прогрессированию и усилению активности заболевания. Накопление двойных негативных В-клеток у пациентов с СКВ свидетельствует об особой их роли в развитии заболевания, такой феномен подлежит дальнейшему наблюдению и анализу. Таким образом, есть две точки опоры для дополнительного уточнения степени активности заболевания — это снижение количества наивных В-лимфоцитов с увеличением числа двойных негативных В-клеток «памяти», что ассоциируется с высокой активностью СКВ.

У пациентов с длительностью заболевания более 1 года с момента установления диагноза отмечено уменьшение процентного содержания В-лимфоцитов, что, вероятно, связано с проведением длительной иммуносупрессивной терапии (включая лечение цитостатиками и высокие дозы ГК), которая также в некоторой степени влияет на определенные субпопуляции В-клеток.

В динамике нами было обнаружено, что терапия РТМ приводила к деплеции CD19+ В-лимфоцитов к 3-му месяцу у 86% больных, достигших ответа на терапию без признаков рецидива СКВ. Такие результаты у данной группы были достигнуты благодаря эффективному уничтожению наивных, двойных негативных В-клеток, даже при относительном сохранении и меньшей степени де-плеции «непереключенных» и «переключенных» В-клеток «памяти», что может объяснять сохраняющиеся повышенными титры аутоантител после терапии ГИБП.

12 мес

0,007 0,01 0,04

12 мес

С. Л.

Х.

0

0

Малое количество пациентов, у которых было зафиксировано обострение заболевания, не позволяет на настоящий момент выявить определенные предикторы обострения в отношении репопуляции определенных субпопуляций В-клеток. Значительное восстановление наивных В-лимфоцитов и их большее количество по сравнению с другими субпопуляциями выявлено у большинства пациентов, однако признаков обострения СКВ не зафиксировано. С другой стороны, больные с ранним рецидивом имели более высокие уровни различных групп клеток «памяти» и плазмобластов. Таким образом, настороженность в отношении обострения заболевания должна возникнуть при быстром восстановлении (к 6-му месяцу наблюдения) количества двойных негативных, «непереключенных», «переключенных» В-клеток «памяти», плазмобластов. Низкая частота обострений у представленных больных обусловлена периодическим плановым повторным проведением лечения РТМ в дозе 500-1000 мг.

В нашем исследовании также был показан эффект БЛМ, при назначении которого отмечалось угнетение наивных, плазматических клеток и плазмобластов с одновременным снижением клинико-иммунологической активности, что подтверждается данными других авторов [14], однако такая терапия не оказывала существенного влияния на В-лимфоциты «памяти».

Двойная анти-В-клеточная терапия способствовала быстрому снижению клинико-иммунологической активности заболевания, которая оценивалась по BILAG и SLEDAI-2K. Обострения СКВ за 12 мес динамического контроля не было ни у одного пациента. Анализ субпопуляций В-лимфоцитов демонстрировал более медленную репопуляцию В-клеток, а также продолжающееся сокращение количества плазматических клеток и плазмобластов к 6, 9, 12-му месяцам после введения РТМ, что было достигнуто благодаря таргетному действию БЛМ на эти клетки.

В данной статье также в отдельную группу были выделены 5 пациентов без предшествующей терапии ГИБП, с высокой клинико-иммунологической активностью СКВ в сочетании с исходно низким содержанием В-лим-фоцитов (CD19+ <3%). У всех проводилось лечение РТМ. В данной подгруппе эффективность РТМ была существенно ниже, чем у остальных больных. Тем не менее в 4 случаях мы наблюдали некоторое клиническое улучшение. У двух из этих пациентов (у одной из которых выявлялся васкулит) положительная динамика клинических симптомов (уменьшение кожных высыпаний, артритов и артралгий) сопровождалось снижением уровня антител к нДНК, тем не менее отмечалось быстрое нарастание иммунологических показателей крови до исходных значений (антител к нДНК Ед/мл >300 к 6-му месяцу), которое сопровождалось усугублением клинической симптоматики СКВ. У двух других больных с явлениями васку-лита отмечалась положительная динамика со стороны клинических проявлений СКВ, тем не менее к 3-му и 6-му месяцам наблюдения зафиксировано обострение заболевания, даже несмотря на применение высоких доз цитостатиков, ГК. При анализе данных еще одной пациентки не выявлено какой-либо положительной динамики в отношении клинико-лабораторных показателей активности СКВ. Вероятнее всего, у таких больных механизм патологического процесса связан в большей степени с ак-

тивацией и воздействием цитотоксических Т-клеток и иммунных комплексов и требует дальнейшего дополнительного анализа. Таким образом, низкий базальный уровень В-лимфоцитов у больных, не получавших ранее ГИБП, может быть связан с повышенным риском раннего обострения и тяжелого течения СКВ.

Выводы

В сравнении со здоровыми добровольцами, больные СКВ обладают большим количеством двойных негативных В-клеток и плазматических клеток.

Пациенты с высокой активностью СКВ и поражением ЖВО, как правило, имеют более высокие уровни двойных негативных клеток «памяти» при относительно низких количествах наивных В-клеток по сравнению с больными со средней активностью заболевания.

Терапия РТМ приводит к заметному уменьшению количества наивных и двойных негативных В-клеток «памяти», в меньшей степени — «непереключенных» и «переключенных» В-клеток «памяти».

Быстрое восстановление числа В-клеток «памяти» (двойных негативных, «непереключенных», «переключенных») и плазмобластов после курса РТМ должно расцениваться как предиктор раннего обострения СКВ.

Уменьшение клинико-лабораторных признаков активности СКВ на фоне лечения БЛМ связано с угнетением наивных В-клеток, плазматических клеток и плазмобла-стов.

Двойная анти-В-клеточная терапия наиболее эффективно обеспечивает снижение активности заболевания, пролонгирует достигнутую ремиссию без необходимости применения высоких доз ГК, пульс-терапии, иммуносу-прессивной терапии, тем самым снижая риск формирования необратимых органных повреждений. Наблюдение в течение года не показало отрицательных результатов комбинированной терапии РТМ и БЛМ. Неблагоприятные реакции не зарегистрированы.

Двойная анти-В-клеточная терапия способствует достижению и сохранению низкого уровня В-лимфоцитов, дальнейшему сокращению количества плазмобластов и плазматических клеток, а следовательно, препятствует синтезу аутоантител.

Парадигма современной медицины — персонифицированный подход к терапии, в связи с этим необходимо продолжать поиски клинико-биологических субтипов СКВ. Полученные нами данные, возможно, позволят в будущем выявить среди пациентов с СКВ так называемых «ответивших» и «не ответивших» на применение ГИБП. В этом отношении роль динамики субпопуляций В-лим-фоцитов трудно переоценить, поскольку именно эти им-мунокомпетентные клетки являются основной мишенью РТМ и, опосредованно, БЛМ.

Прозрачность исследования

Исследование не имело спонсорской поддержки. Авторы несут полную ответственность за предоставление окончательной версии рукописи в печать.

Декларация о финансовых и других взаимоотношениях

Все авторы принимали участие в разработке концепции статьи и в написании рукописи. Окончательная версия рукописи была одобрена всеми авторами. Авторы не получали гонорар за статью.

ЛИТЕРАТУРА

1. Насонов ЕЛ, Насонова ВА, редакторы. Ревматология: Национальное руководство. Москва: ГЭОТАР-Медиа; 2008 [Nasonov EL, Nasonova VA, editors. Revmatologiya: Natsional'noe rukovodstvo [Rheumatology: National guidelines]. Mosraw: GEOTAR-Media; 2008].

2. Halverson R, Torres RM, Pelanda R. Receptor editing is the main mechanism of B cell tolerance toward membrane antigens. Nat Immunol. 2004;5(60):645-50. doi: 10.1038/ni1076

3. Chan OT, Hannum LG, Haberman AM, et al. A novel mouse with B cells but lacking serum antibody reveals an antibody-independent role for B cells in murine lupus. J Exp Med. 1999;189:1639-48. doi: 10.1084/jem.189.10.1639

4. Looney RJ, Anolik JH, Campbell D, et al. B cell depletion as a novel treatment for systemic lupus erythematosus a phase I/II dose-escalation trial of rituximab. Arthritis Rheum. 2004;50(8):2580-9. doi: 10.1002/art.20430

5. Vigna-Perez M, Hernandez-Castro B, Paredes-Saharopulos O, et al. Clinical and immunological effects of Rituximab in patients with lupus nephritis refractory to conventional therapy: a pilot study. Arthritis Res Ther. 2006;8:83. doi: 10.1186/ar1954

6. Цанян МЭ, Соловьев СК, Торгашина АВ и др. Эффективность терапии ритуксимабом у больных рефрактерной к стандартной терапии системной красной волчанкой при длительном динамическом наблюдении. Научно-практическая ревматология. 2014;52(2):159-68 [Tsanyan ME, Soloviev SK, Torgashina AV, et al. Rituximab treatment efficacy in patients with systemic lupus erythematosus refractory to standard therapy in the long-term follow-up. Nauchno-Prakticheskaya Revmatologiya = Rheumatology Science and Practice. 2014;52(2):159-68 (In Russ.)]. doi: 10.14412/19954484-2014-159-168

7. Асеева ЕА, Соловьев СК, Меснянкина АА и др. Опыт применения белимумаба у больных системной красной волчанкой. Научно-практическая ревматология. 2015;53(3):329-35 [Aseeva EA, Soloviev SK, Mesnyankina AA, et al. Experience with belimumab in patients with systemic lupus erythematosus. Nauchno-Prakticheskaya Revmatologiya = Rheumatology Science and Practice. 2015;53(3):329-35 (In Russ.)]. doi: 10.14412/1995-4484-2015-329-335

8. Jacobi AM, Odendahl M, Reiter K, et al. Correlation between circulating CD27(high) plasma cells and disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2003;48:1332-42. doi: 10.1002/art.10949

9. Vital EM, Dass S, Buch MH, et al. B cell biomarkers of rituximab responses in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2011;63:3038-47. doi: 10.1177/0961203309350752

10. Anolik JH, Barnard J, Owen T, et al. Delayed memory B cell recovery in peripheral blood and lymphoid tissue in systemic lupus erythematosus after B cell depletion therapy. Arthritis Rheum. 2007;56:3044-56. doi: 10.1002/art.22810

11. Wei C, Anolik J, Cappione A, et al. A new population of cells lacking expression of CD27 represents a notable component of the B cell memory compartment in systemic lupus erythematosus.

J Immunol. 2007;178:6624-33. doi: 10.4049/jimmunol.178.10.6624

12. Iwata S, Tanaka Y. B-cell subsets, signaling and their roles in secretion of autoantibodies. Lupus. 2016 Jul;25(8):850-6. doi: 10.1177/0961203316643172

13. Anolik JH, Barnard J, Cappione A. Rituximab improves peripheral B cell abnormalities in human systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum. 2004;50(11):3580-90. doi: 10.1002/art.20592

14. Jacobi AM, Huang W, Wang T, et al. Effect of long-term belimum-ab treatment on B cells in systemic lupus erythematosus: extension of a phase II, double-blind, placebo-controlled, dose-ranging study. Arthritis Rheum. 2010;62(1):201-10. doi: 10.1002/art.27189

15. Bekar KW, Owen T, Dunn R, et al. Prolonged effects of short-term anti-CD20 B cell depletion therapy in murine systemic lupus ery-thematosus. Arthritis Rheum. 2010;62:2443-57.

doi: 10.1002/art.27515

16. Wei Yu Lin, Seshasayee D, Lee WP, et al. Dual B cell immunotherapy is superior to individual anti-CD20 depletion or BAFF blockade in murine models of spontaneous or accelerated lupus. Arthritis Rheum. 2015;67(1):215-24. doi: 10.1002/art.38907

17. Kraaij T, Huizinga TW, Rabelink TJ, et al. Belimumab after ritux-imab as maintenance therapy in lupus nephritis. Rheumatology. 2014;53:2122-4. doi: 10.1093/rheumatology/keu369. Epub 2014 Sep 8.

18. Супоницкая ЕВ, Алексанкин АП, Александрова ЕН и др. Определение субпопуляций В-лимфоцитов периферической крови методом проточной цитофлуорометрии у здоровых лиц и больных ревматическими заболеваниями. Клиническая лабораторная диагностика. 2015;60(6):30-3 [Suponickaja EV, Aleksankin AP, Aleksandrova EN, et al. Determination of subpopulations of peripheral blood B-lymphocytes by flow cytofluorome-try in healthy individuals and patients with rheumatic diseases. Klinicheskaja Laboratornaja Diagnostika. 2015;60(6):30-3 (In Russ.)].