CC BY
97
КЛИНИЧЕСКАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ
clinical pharmacology
ДИНАМИКА ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ НА ФОНЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА
Сагынбаева В.Э., ЛазебникЛ.Б., Князев О.В., ЕфремовЛ.И.
ГУ Центральный научно-исследовательский институт гастроэнтерологии ДЗ г. Москвы
РЕЗЮМЕ
Хроническое воспаление при ВЗК сопровождается дисбалансом в продукции Тх1- и Тх2-цитокинов. Дисбаланс цитокинового профиля имеет важное патогенетическое значение при хронизации воспалительного процесса, поскольку формирование неполноценного иммунного ответа на патогенный агент способствует рецидивированию заболевания. Анализ динамики уровня провоспалительных цитокинов позволяет оценить как активность воспалительного процесса, так и эффективность проводимой терапии. Повышение уровней провоспалительных цитокинов: ФНО-а, ИФН-y, ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15 в сыворотке крови больных ВЗК указывает на их возможное участие в механизмах развития БК и ЯК. Увеличение содержание данных цитокинов сопровождалось повышением активности заболеваний, что может быть использовано для диагностики активности ВЗК. Ключевые слова: болезнь Крона; инфликсимаб; мезенхимальные стромальные клетки; иммуносу-прессоры; кортикостероиды; ФНО-а; ИФН-y; ИЛ-2; ИЛ-5; ИЛ-8; ИЛ-12; ИЛ-15; язвенный колит.
SUMMARY
Chronic inflammation in IBD is accompanied by an imbalance in the production of TX1 and Th2 cytokines. Imbalance of cytokine profile is important pathogenetic value at chronic inflammatory process, since the formation of a defective immune response to pathogenic agent promotes recurrence of the disease. Analysis of the dynamics of proinflammatory cytokines allows to estimate the activity of the inflammatory process, and effectiveness of the therapy.
Increased levels of proinflammatory cytokines: TNF-а, IFN-y, IL-2, IL-5, IL-8, IL-12, IL-15 in serum of patients with IBD, indicating their possible involvement in the mechanisms of development of CD and UC. The increase in the content of these cytokines was accompanied by increased activity of disease that can be used to diagnose IBD activity.
Keywords: aohn's disease; infliximab; mesenchymal stromal cells; immunosuppressive medication; corticosteroids; TNF-а; IFN-y; IL-2; IL-5; IL-8; IL-12; IL-15; ulcerative colitis.
<3
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК): язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК) — имеют много общего как в патогенезе, так и клинической картине. Этиология обоих заболеваний до сих пор неизвестна, а их естественное течение и ответ на лечение часто непредсказуемы. Патогенез гранулематозного воспаления при БК опосредован двумя факторами: во-первых, нарушение клеточного
иммунитета и дисбалансом Тх1 и Тх2 типов с преимущественной активацией Тх1 типа, во-вторых, с нарушением баланса про- и противовоспалительных цитокинов в слизистой оболочке (СО) кишки с преобладанием провоспалительных медиаторов преимущественно макрофагального происхождения и дефицитом противовоспалительных регуля-торных цитокинов [1-4]. В нормальной слизистой
оболочке содержание клеточных субпопуляций, а соответственно и соотношение про- и противовоспалительных цитокинов сбалансировано, что обеспечивает адекватный иммунный ответ на антигенное раздражение [4; 5]. Группу цитокинов с про-воспалительным действием составляют цитокины: интерлейкин (ИЛ)-1(3, ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15, ФНО-а, инферферон-у (ИФН-у). К противовоспалительным цитокинов относятся: ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, трансформирующий фактор роста-1в (ТФР-ф) [6; 7]. Патогенетические механизмы воспалительных и аутоммунных заболеваний разделяют по доминирующему субклассу активированных Т-лимфоцитов в очаг поражения и соответственно по профилю вырабатываемых ими цитокинов [8]. Так, ревматоидный артрит и БК ассоциированы с Т-хелперным иммунным ответом 1-го типа, при котором основными регуляторными медиаторами являются ИЛ-2 и ИФН-у. Среди цитокинов в воспалительным действием одним из наиболее активных является ФНО-а. Его считают ключевым в процессе воспаления при ревматоидном артрите, БК и других аутоиммунных заболеваниях [8; 9].
В развитии воспаления при язвенном колите задействованы многочисленные механизмы тканевого и клеточного повреждения. Бактериальные и тканевые антигены вызывают стимуляцию Т- и В-лимфоцитов. При обострении язвенного колита обнаруживается дефицит иммуноглобулинов, что способствует проникновению микробов, компенсаторной стимуляции В-клеток с образованием иммуноглобулинов М и О. Дефицит Т-супрессоров приводит к усилению аутоиммунной реакции. Усиленный синтез иммуноглобулинов М и О сопровождается образованием иммунных комплексов и активацией системы комплемента, который обладает цито-токсическим действием, стимулирует хемотаксис нейтрофилов и фагоцитов с последующим выделением медиаторов воспаления, которые и вызывают деструкцию эпителиальных клеток. В-клеточная реакция и повышенное образование и аутоан-тител представляют собой вторичную — защитную реакцию, призванную очистить пораженный орган от клеток, подвергшихся апоптозу. Среди медиаторов воспаления прежде всего следует назвать цитокины ИЛ-16, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-15, которые влияют на рост, движение, дифференциацию и эффекторные функции многочисленных клеточных типов, вовлеченных в патологический процесс при язвенном колите. Помимо патологических иммунных реакций повреждающее действие на ткани оказывают активный кислород и протеазы; отмечается апоптоза, т. е. механизма клеточной смерти. Хотя роль цитокинов при язвенном колите не столь изучена, как при болезни Крона, но есть данные, что при уже развившемся колите происходит модифицированная реакция Т-2-лимфоцитов, для которой характерно накопление таких цитокинов, как ИЛ-5 и ИЛ-10, но не ИЛ-4. Напротив, в работах, изучавших цитокины слизистой и модель с двойным выключением
в геноме мышей, подчеркивается важность интерлейкина-4 как ключевого фактора в патогенезе активного колита. Важная роль в патогенезе язвенного колита отводится нарушению барьерной функции слизистой оболочки кишечника и ее способности к восстановлению. Считается, что через дефекты слизистой оболочки в более глубокие ткани кишки могут проникать разнообразные пищевые и бактериальные агенты, которые затем запускают каскад воспалительных и иммунных реакций [10].
Внутриклеточные бактерии и вирусы активируют дендритные клетки, макрофаги и натуральные киллеры, что приводит к продукции ИЛ-12 и ИФН-у. В присутствии этих цитокинов Тх0-клетки начинают превращаться в Тх1-клетки [11].
Цитокиновое звено играет значительную роль в реализации хронического воспаления. В патогенезе ВЗК доказана важная роль провоспалительных цитокинов, которые являются новыми мишенями для современной биологической и стандартной терапии. Однако включение биологических агентов в стандартное лечение позволяет добиться лишь временной ремиссии патологического процесса, что связано с недостаточной изученностью изменений в иммунной системе у больных с ВЗК до начала терапии, а также на ее фоне.
Целью нашего исследования явились определение динамики провоспалительных цитокинов в сыворотке крови при воспалительных заболеваниях кишечника и оценка их значения в патогенезе заболевания в зависимости от методов лечения.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Обследовано 44 больных ВЗК с хроническим непрерывно рецидивирующим течением, находившихся на лечении в отделении патологии кишечника ЦНИИГ, из них 29 больных язвенным колитом (ЯК) (19 мужчин, 10 женщин) и 15 — с болезнью Крона (БК) (7 мужчин, 8 женщин). Возраст больных составлял 17-68 лет, средний возраст — 37,4 ± 2,0 (М ± а).
Диагноз верифицирован данными клинических, лабораторных, гистологических и инструментальных методов исследования. Больные в зависимости от проводимой терапии разделены на три группы. I группа — больные, которым проводилась индукционная и поддерживающая терапия инфликсимабом в дозе 5 мг/кг массы тела по рекомендуемой схеме (п = 16), II группа — больные язвенным колитом (п = 14), которым проводилась комплексная противовоспалительная терапия с введением культуры МСК Больным данной группы за 2-3 дня до введения МСК отменяли иммуносупрессоры (азатиоприн), снижали дозу кортикостероидов до 15-20 мг/сут, которую постепенно снижали до полной отмены (при отсутствии рецидива заболевания) в течение 6-8 недель,
Б >
ст
Б о
I- Е
IX
V о.
га е 2|
а га
Б
га
й Ш
т 5 X
5
<
г^. г^.
СО
дозу аминосалицилатов оставляли на уровне 2,0 г/ сут. III группа получала стандартную противовоспалительную терапию препаратами 5-АСК (5-ами-носалициловой кислоты) в среднесуточной дозе 3,0-4,0 г/сут, глюкокортикостероидами (ГКС) в дозе 0,5-0,75 мг/кг/сут (n = 14). Концентрацию ФНО-а, ИФН-y, ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15 определяли в сыворотке крови больных иммуноферментным методом с применением тест-систем «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург), BioSource (Австрия), Bender MedSystems (Австрия). Статистическая обработка данных проводилась с использованием компьютерной программы Statistica 6.0, достоверность полученных величин определяли при помощи критерия Уилкоксона.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Причиной рецидивирующего течения ВЗК является дисбаланс Т- и В-звеньев иммунной системы. В результате проведенного исследования было установлено, что уровень цитокинов в исследуемых образцах сыворотки крови варьировал в широких пределах. Так, в наших исследованиях у больных с длительным тяжелым течением язвенного колита и болезни Крона, частыми обострениями, выраженной активностью заболевания, получающих иммунодепрессантную терапию (иммуносупрес-соры, кортикостероиды), показатели иммунного статуса, в том числе и цитокинового, были резко снижены. Содержание как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов у пациентов данной группы в ряде случаев снижалось до 11 пг/мл и ниже. У больных с впервые установленным диагнозом ВЗК концентрация сывороточных цитокинов составляла 340-790 пг/мл; а у больных с длительным анамнезом при отсутствии иммунодепрессантной терапии — 90-240 пг/мл.
В каскаде провоспалительных цитокинов ключевое значение принадлежит фактору некроза опухоли-а (ФНО-а), обладающему воспалительной и иммунорегуляторной активностью. Этот цитокин синтезируется моноцитами, макрофагами и Т-клетками, дендритными клетками, Т- и В-лимфоцитами, нейтрофилами, NK-клетками, кератиноцитами, астроцитами, эндотелиальными и гладкомышечными клетками и имеет широкий спектр биологических эффектов. Он повышает экспрессию клеточных и сосудистых молекул адгезии-1, которые участвуют в миграции лимфоцитов в зону воспаления, активирует лимфоциты и пролиферацию фибробластов, стимулирует синтез простаглан-динов, лейкотриенов, оксида азота и матриксных металлопротеиназ.
В сыворотке крови здоровых доноров биологически активный ФНО-а определяется в очень низких концентрациях (0-5 пг/мл). Он обусловливает выраженную потерю массы тела — кахексию, развитие септического шока, сопровождающегося
лихорадкой, коллапсом и ДВС-синдромом. ФНО-а вместе с ИЛ-1, ИЛ-6 вынуждает печень продуцировать белки острой фазы, такие как С-реактивный белок, действуют на гипоталамус как эндогенный пептид, вызывая жар и приводя к перемещению нейтрофилов из костного мозга в кровь (лейкоцитоз). ФНО-а вместе с ИЛ-1 повышает проницаемость сосудов, облегчает миграцию клеток в ткань, увеличивает экспрессии молекул адгезии на лейкоцитах и клетках эндотелия. В отношении воспалительных заболеваний толстой кишки ФНО-а обладает способностью направлять циркулирующие воспалительные клетки в очаг воспаления, что вызывает отек, инициирует коагуляцию и играет важную роль в образовании гранулемы [7; 12; 13]. Повышение его продукции приводит к увеличению продукции других провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6 и др.); прохождение этих субстанций через печень приводит к повышению концентрации СРБ, фибриногена и других протеинов, отражающих интенсивность воспалительного процесса, и к снижению уровня альбумина, трансферрина.
При хронических воспалительных заболеваниях тонкой и толстой кишки индивидуальные колебания в содержании ФНО-а были в пределах 30-1100 пг/мл. Уровень данного цитокина при болезни Крона в среднем составил 190, при язвенном колите — 230 пг/мл, достигая у отдельных больных при обострениях заболевания 650-1100 пг/мл. Максимальные значения данного цитокина были отмечены при впервые выявленном заболевании. У больных с частыми рецидивами, непрерывным и рецидивирующим течением заболевания, получавших иммуносупрессивную терапию, уровень ФНО-а не превышал 90 пг/мл.
Самое крупное достижение в фармакотерапии воспалительных заболеваний кишечника связано с разработкой группы препаратов, объединяющихся общим термином — «биологические» агенты, или биологические модификаторы иммунного ответа (biologies). Самый обширный и длительный клинический опыт накоплен в отношении препарата инфликсимаб (Ремикейд®) — химерных монокло-нальных антител к ФНО-а. Согласно международным рекомендациям инфликсимаб необходимо применять в первую очередь у больных ВЗК, «резистентных» к «стандартным» базисным противовоспалительным препаратам.
Содержание ФНО-а в сыворотке крови у больных, получавших ИНФЛ, до лечения составило 165,1 ± 52,4 пг/мл, что достоверно различалось по сравнению с группой получавших МСК и СТ (31,4 ± 15,7 и 26,3 ± 13,7 пг/мл соответственно) (р < 0,001). Это обусловлено тем, что в данную группу включались больные с наибольшей продолжительностью и высокой активностью заболевания, которые оказались рефрактерными к терапии препаратами 5-АСК и ГКС, а также иммуносупрессорами. ФНО-а является одним из наиболее активных провос-палительных цитокинов и считается ключевым в
патогенезе БК и ЯК. При воспалении этот цитокин стимулирует Т1-хелперы и макрофаги, индуцирует системные реакции острой фазы с повышенным синтезом ИЛ-1, -2, -6, -8. Их значительное повышение у больных ВЗК может быть обусловлено выраженностью острофазового ответа, а также коррелирует с активностью ЯК и БК.
Результаты исследований представлены в табл. 1. Показатель уровня ФНО-а в группе, получавших ИНФЛ, после проведенной терапии достоверно снизился более чем в 4 раза по сравнению с исходным уровнем — до 33,7 ± 6,5 пг/мл. Концентрация ФНО-а у больных, получавших МСК и стандартную терапию (СТ), как в стадии обострения заболевания, так и в период ремиссии сохранялась в пределах нормальных значений, имея тенденцию к снижению. Изученные иммунологические параметры коррелировали с клиническим течением заболевания. Нами выявлена прямая корреляция между исходными значениями уровня ФНО-а и клинической активностью ЯК (индекс Рахмилевича) (г = 0,6, р < 0,05) (рис. 1), а также индексом Беста (г = 0,88, р < 0,01) (рис. 2).
Интерферон-у (ИФН-у — «иммунный интерферон») продуцируется Т-лимфоцитами и NK. Среди Т-лимфоцитов продуцентами ИФН-у являются ци-тотоксические Т-лимфоциты (СБ8+) и хелперные Т-клетки (СБ4+). ИФН-у стимулирует дифференци-ровку Тх0 в Тх1. Иммунный ИФН-у вместе со своим антагонистом ИЛ-4 поддерживает баланс Тх1/Тх2. Важнейшей функцией ИФН-у является его участие в опосредовании взаимосвязей между лимфоцитами и макрофагами и в регуляции соотношения клеточной и гуморальной составляющей иммунного ответа. Являясь основным продуктом Тх1-клеток, ИФН-у снижает секреторную активность Тх2-клеток. В результате всех этих гуморальных взаимодействий ИФН-у усиливает развитие клеточного иммунитета и подавляет проявления гуморального иммунного ответа. ИФН-у, как ИФН-а и -в, обладает противоопухолевым и противовирусным действием [8; 11].
Повышение концентрации ИНФ-у от 70 до 3200 пг/мл (в контроле — 42,8 пг/мл) при заболеваниях органов пищеварения в наших исследованиях имело место у подавляющего большинства больных.
Как показали результаты настоящего исследования, концентрация ИФН-у в стадии обострения в группах больных ВЗК, получавших инфликси-маб и МСК, была незначительно выше, чем у больных, получавших СТ. Наибольший его уровень отмечался в группе больных, получавших МСК, а наименьший — в группе больных, получавших стандартную противовоспалительную терапию препаратами 5-АСК и ГКС. После проводимой терапии отмечалось достоверное снижение продукции ИФН-у (с 125,8 ± 45,9 до 69,3 ± 28,7 пг/мл) в группах больных, которым проводилась трансплантация МСК. Достоверное повышение уровня ИФН-у с 30,1 ± 9,6 до 47,7 ± 22,3 пг/мл выявлено у больных с ВЗК, получавших СТ, а также в группе больных,
получавших инфликсимаб (с 86,9 ± 28,4 до 136,6 ± 42,3 пг/мл) (табл. 2).
Интерлейкин-2. ИЛ-2 является про-воспалительным цитокином, описанным в 1976 году как фактор роста Т-лимфоцитов, в 1983-м клонирован ген ИЛ-2, включающий 4 экзона. ИЛ-2 вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, главным образом Тх1. Основными его клетками мишенями являются активированные Т- и В-лимфоциты и NK-клетки. ИЛ-2 может также повышать синтез 1§М, 1§О, 1§А. Повышение спонтанной продукции ИЛ-2 может быть при лимфопро-лиферативных и аутоиммунных заболеваниях. Снижение индуцированной продукции ИЛ-2 клетками крови может быть следствием иммунодефицитных состояний различной этиологии, в первую очередь Т-клеточного иммунодефицита. Таким образом, ИЛ-2 представляет собой фактор и дифференци-ровки Т-лимфоцитов и МК-клеток, в меньшей степени — В-лимфоцитов, продуцируемых активированными Т-хелперами. Он является важным медиатором иммунитета (особенно клеточного) и участвует в реализации иммунной защиты и противоопухолевой резистентности [8; 13].
При анализе уровня изучаемых ИЛ-2 во всех сравниваемых группах больных ВЗК в стадии обострения отмечалась повышенная концентрация противовоспалительного ИЛ-2. У данных больных повышение уровня ИЛ-2 сопровождалось ухудшением клинической картины (появление болевого синдрома, увеличение частоты стула) и лабораторных показателей.
В период обострения ЯК и БК установлена прямая зависимость между уровнем ИЛ-2 и степенью активности заболевания. Повышение уровня ИЛ-2 при обострении БК находилось в более тесной связи, чем при ЯК, — г = 0,88 (р < 0,01) и г = 0,7 (р < 0,01) соответственно (рис. 3 и 4).
После проведения трансплантации МСК снижение уровня ИЛ-2 не носило достоверного характера (р = 0,764), а в группе больных, которые получали системную иммуносупрессивную терапию, уровень ИЛ-2 достоверно снизился с 279,6 ± 58,8 до 288,2 ± 50,9 пг/мл (р < 0,001). В группе больных ВЗК, получавших инфликсимаб, выявлено увеличение продукции провоспалительного ИЛ-2, однако оно было статистически недостоверным (р = 0,313) (табл. 3).
Интерлейкин-5. ИЛ-5 является провоспали-тельным цитокином. ИЛ-5 продуцируется клетками Тх2 класса. Основные клетки-мишени ИЛ-5 — В-лимфоциты и эозинофилы. Эти клетки несут высоко- и низкоаффинные рецепторы для ИЛ-5, число которых на клеточной поверхности клетки значительно возрастает после активации. Способность ИЛ-5 поддерживать пролиферацию В-клеток реализуется на более поздних стадиях активации, чем
Б >
СТ
Б о
I- Е
IX
о
^ а
га е 2|
а га
Б
га
й <и т 5 X
5
<
о
Таблица 1
УРОВЕНЬ ФНО-А В СЫВОРОТКЕ КРОВИ В СРАВНИВАЕМЫХ ГРУППАХ ВЗК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИДА И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ТЕРАПИИ
№ Группы больных До лечения, пг/мл После лечения, пг/мл Р
1 Группа больных, получавших ИНФЛ (п = 16) 165,1 ± 52,4 33,7 ± 6,5 < 0,001
2 Группа больных, получавших МСК (п = 14) 31,4 ± 15,7* 22,2 ± 11,4 0,08
3 Группа больных получавших стандартную терапию (п = 14) 26,3 ± 13,7 28,6 ± 15,0 0,7
Примечание: * — р < 0,001 в сравнении между ИНФЛ и МСК. Таблица 2
УРОВЕНЬ ИФН-Г В СЫВОРОТКЕ КРОВИ В СРАВНИВАЕМЫХ ГРУППАХ ВЗК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИДА И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ТЕРАПИИ
№ Группы больных До лечения, пг/мл После лечения, пг/мл Р
1 Группа больных, получавших инфликсимаб (п = 16) 86,9 ± 28,4 136,6 ± 42,3 < 0,001
2 Группа больных, получавших МСК (п = 14) 125,8 ± 45,9* 69,3 ± 28,7 < 0,001
3 Группа больных получавших стандартную терапию (п = 14) 30,1 ± 9,6 47,7 ± 22,3 0,009
Примечание: * — р < 0,05 в сравнении между ИНФЛ и МСК. Таблица 3
УРОВЕНЬ ИЛ-2 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ В СРАВНИВАЕМЫХ ГРУППАХ ВЗК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИДА И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ТЕРАПИИ
№ Группы больных До лечения, пг/мл После лечения, пг/мл Р
1 Группа больных, получавших инфликсимаб (п = 16) 158,1 ± 45,4 175,3 ± 49,3 0,313
2 Группа больных, получавших МСК (п = 14) 294,3 ± 55,5* 288,2 ± 50,9 0,764
3 Группа больных получавших системные кортикостероиды (п = 14) 279,6 ± 58,8 192,8 ± 49,1 < 0,001
Примечание: * — р < 0,001 в сравнении между ИНФЛ и МСК.
сэ
СО
действие ИЛ-4 и ИЛ-1. Это действие осуществляется в кооперации с ИЛ-2 (ИЛ-5 усиливает экспрессию рецепторов для ИЛ-2). ИЛ-5 способствует диффе-ренцировке В-лимфоцитов в плазматические клетки, особенно в продуценты ];М. ИЛ-5 повышает образование ];А и менее значительно — синтез ];М, ];С1 и ]££. Стимулируя выработку секреторного 1;А, ИЛ-5 способствует проявлению местной иммунной защиты слизистых оболочек кишечника. ИЛ-5 является ростовым и дифференцировочным фактором эозинофилов, способствует вовлечению этих клеток в воспалительные реакции, антипаразитарную и противоопухолевую защиту. Таким образом, ИЛ-5 — продукт Тх2-клеток, обладающий относительно «узким» спектром действия. Он является ростовым и дифференцировочным фактором В-лимфоцитов и эозинофилов, усиливает синтез 1;А и тем самым способствует развитию местного иммунитета слизистых оболочек, стимулирует эозинофилы к участию в защите от паразитарных инфекций и опухолевого роста [8].
Динамика ИЛ-5 на фоне проводимой противовоспалительной терапии ВЗК представлена в табл. 4. Концентрация ИЛ-5 в период обострения в группе больных, получавших МСК и стандартную противовоспалительную терапию, была выше, чем у больных, которые получали ИНФЛ, причем наибольший его уровень отмечался в группе больных, получавших СТ. Наименьший уровень ИЛ-5 в группе больных, получавших инфликсимаб, может быть связан с тем, что в данную группу включались больные ЯК и БК с более тяжелым течением заболевания. В свою очередь, увеличение продолжительности заболевания, частоты рецидивов, высокая активность процесса требовали более частого применения высоких доз иммуносупрессоров. Следовательно, уменьшение уровня концентрации некоторых цитокинов, в частности ИЛ-5, можно расценить как результат угнетения функциональной, в том числе и цитокин-продуцирующей, активности иммунокомпетентных клеток, развитием вторичного иммунодефицита,
Scatterplot: Индекс Рахмилевича vs.OHO-Cl (Casewise MD deletion) ФНО-а=-7,805+ 7,2956* Индекс Рахмилевича Correlation: г = ,60775
/
7 8
Индекс Рахмилевича
^iX, 95% confidence
Б >
СТ
So
I- Е ft
о
v a
(0 E
S =
а
ID
Б ID
и
<U T
s
X
s
<
Рис. 1. Корреляция индекса клинической активности язвенного колита (Рахмилевича) с исходным уровнем ФНО-а сыворотки крови (г = 0,6, р < 0,05)
180
160
140
120
100
О X
© 80
60
40
20
Scatterplot: CDAI vs.CDHO- a(Casewise MD deletion) ФНО - a = 17,892 + ,26373 * CDAI Correlation: r = ,88254
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
CDAI ^ 95% confidence
Рис. 2. Корреляция индекса клинической активности болезни Крона (СПА1) с исходным уровнем ФНО-а сыворотки крови (г = 0,88, р < 0,01)
Scatterplot: CDAI vs. ИЛ-2 (Casewise MD deletion) ИЛ-2 =-141,5+ 1,7129* CDAI Correlation: r = ,90085
<N i
600
500
400
300
200
100
100
450
X 95% confidence
Рис. 3. Корреляция индекса клинической активности болезни Крона (СПА1) с исходным уровнем ИЛ-2 сыворотки крови (г = 0,1 р < 0,01)
Scatterplot: Индекс Рахмилевича vs. ИЛ-2 (Casewise MD deletion) ИЛ-2 =-41,10+13,341* Индекс Рахмилевича Correlation: г = ,70893
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
о
/
• /
: о - ^^ о -О ^^^ _
^ С
^^ с о ■ ■ о ■ О
^ • / о
7 8 9
Индекс Рахмилевича
12
10 _П_
рЖ, 95% confidence
13
CN
со
Рис. 4. Корреляция индекса клинической активности болезни Крона (СВА1) с исходным уровнем ИЛ-2 сыворотки крови (г = 0,7, р < 0,01)
а также ингибирующим эффектом интенсивной терапии антибактериальными препаратами, кор-тикостероидами, иммуносупрессорами.
После проводимой терапии отмечалось достоверное снижение продукции ИЛ-5 в группах больных, которым проводилась системная трансплантация МСК, и у больных, получавших СТ, с 43,7 ± 13,1 до 28,4 ± 3,7 и с 54,8 ± 8,7 до 30,8 ± 3,6 пг/ мл соответственно (р < 0,001). В группе больных, получавших инфликсимаб, несмотря на проводимую терапию, выявлено достоверное увеличение продукции ИЛ-5 с 30,6 ± 4,2 до 38,1 ± 3,2 пг/мл (р < 0,001).
Интерлейкин-8. ИЛ-8 является провоспали-тельным цитокином. ИЛ-8 — низкомолекулярный провоспалительный цитокин, является хемокином и играет роль хемоаттрактанта для нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов и эозинофилов. У здоровых людей в сыворотке крови ИЛ-8 выявляется крайне редко. ИЛ-8 вызывают миграцию нейтрофилов и базофилов в очаг воспаления и их дегрануляцию, выделение супероксидного радикала. Регулируют подвижность лейкоцитов [7; 8].
В результате проведенных исследований у больных ВЗК во всех сравниваемых группах больных ВЗК в стадии обострения отмечалась повышенная концентрация противовоспалительного хемокина ИЛ-8, причем наибольший его уровень отмечался в группе больных, получавших инфликимаб и стандартную терапию (СТ) (табл. 5).
Данное повышение содержание ИЛ-8 сопровождалось увеличением активности ВЗК. После проводимой терапии во всех сравниваемых группах больных ВЗК отмечалось снижение уровня ИЛ-8, но только в группе больных, получавших системные иммуносупрессо-ры, снижение ИЛ-8 носило достоверный характер: с 189,4 ± 40,1 до 148,8 ± 35,8 пг/мл (р = 0,008).
Интерлейкин-12. ИЛ-12 является провоспали-тельным цитокином. ИЛ-12 образуется макрофагами, дендритными клетками и В-лимфоцитами под влиянием стимуляции бактериальными продуктами. ИЛ-12 — индуктор цитотоксических клеток и стимулятор выработки цитокинов. В присутствии большого количества ИЛ-12 Т-клетки превращаются в клетки Тх1, секретирующий ИФН-у и ИЛ-2 и способствует преимущественно развитию Т-клеточного воспалительного ответа. ИЛ-12 служит посредником между макрофагами и лимфоцитами, врожденным и приобретенным иммунитетом. Это проявляется в его способности регулировать соотношение клеточного и гуморального иммунитета через стимуляции диф-ференцировки Т-хелперов в направлении Тх1. ИЛ-12 стимулирует активность МК-клеток (естественных киллеров), пролиферацию этих клеток, обусловливает дифференцировку цитотоксических Т-лимфоцитов (оба эффекта осуществляются с участием ИФН-у). С активацией Тх1- и МК-клеток связанно противоопухолевое действие ИЛ-12 (его клинические испытания прошли успешно). ИЛ-12 способствует активации В-лимфоцитов, особенно В1-клеток, что находит отражение в повышении уровня аутоантител. ИЛ-12
проявляет супрессорную активность в ряде иммунологических систем, в частности подавляет выработку 1§Е. Костномозговой гемопо-эз под влиянием ИЛ-12 несколько подавляется вплоть до развития анемии. Таким образом, ИЛ-12 служит связующим звеном между макрофагами и лимфоцитами, способствуя повышению активности Тх1- и цитотоксических клеток, тем самым от вносит решающий вклад в обеспечение противовирусной и противоопухолевой защиты [8].
Было установлено, что в исследуемых образцах сыворотки крови у больных ВЗК, получавших ИНФЛ, в стадии обострения отмечалась повышенная концентрация противовоспалительного ИЛ-12. Уровень ИЛ-12 в данной группе был повышен в 2 раза и более, в среднем 145,5 ± 27,0 пг/мл. После терапии ИНФЛ отмечалось статистически достоверное снижение содержания ИЛ-12 с 145,5 ± 27,0 до 28,8 ± 9,4 пг/мл (р < 0,001). Данное снижение сопровождалось клиническим улучшением течения как ЯК, так и БК, а также уменьшением активности воспалительного процесса. Содержание ИЛ-12 в сыворотке крови у больных, получавших МСК, до лечения составило
71.2 ± 10,1 пг/мл, что было достоверно ниже по сравнению с группой получавших ИНФЛ (145,5 ± 27,0 пг/мл) (р < 0,001). После системной трансплантации МСК уровень ИЛ-12 составил 28,1 ± 8,8 пг/мл. В группе получавших СТ, несмотря на проводимое лечение больных ВЗК, концентрация ИЛ-12 достоверно повысилась с 53,8 ± 17,9 до 94,5 ±
45.3 пг/мл (р < 0,05) (табл. 6). Изученные иммунологические параметры коррелировали с клиническим течением заболевания как в период обострения, так и период ремиссии заболевания, что подтверждает точку зрения об участии ИЛ-12 как одного из основных участников воспалительного каскада при ВЗК (рис. 5-8).
Интерлейкин-15. ИЛ-15 является провоспали-тельным цитокином, вырабатывается макрофагами. По своему действию на Т-лимфоциты он сходен с ИЛ-2. ИЛ-15 поддерживает пролиферацию активированных Т-клеток, дифференцировку цитотоксических Т-лимфоцитов, активирует МК-клетки. ИЛ-2 и ИЛ-8 способствуют их дальнейшему созреванию [8; 12].
На фоне проводимой противовоспалительной терапии ИНФЛ отмечалось достоверное снижение концентрации ИЛ-15 с 59,3 ± 16,0 до 45,5 ± 15,2 пг/ мл (р = 0,013). Данное снижение сопровождалось уменьшением клинической активности как ЯК, так и БК. Анализ уровня ИЛ-15 у больных, получавших МСК, демонстрирует достоверное снижение с 111,4 ±
42.5 в стадии обострения заболевания до 62,8 ±
22.6 пг/мл в период ремиссии (р < 0,001). На фоне проводимой СТ препаратами 5-АСК и ГКС уровень ИЛ-15 практически не изменился: до начала терапии он составил 55,8 ± 9,0 пг/мл, после — 55,2 ± 6,5 пг/ мл (р = 0,73).
Б >
СТ
Б о
I- Е
IX
о
^ а
га е 2|
а га
Б
га
й <и т 5 X
5
<
т
со
Таблица 4
УРОВЕНЬ ИЛ-5 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ В СРАВНИВАЕМЫХ ГРУППАХ ВЗК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ
ВИДА И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ТЕРАПИИ
№ Группы больных До лечения, пг/мл После лечения, пг/мл Р
1 Группа больных, получавших инфликсимаб (п = 16) 30,6 ± 4,2 38,1 ± 3,2 < 0,001
2 Группа больных, получавших МСК (п = 14) 43,7 ± 13,1* 28,4 ± 3,7 < 0,001
3 Группа больных получавших системные кортикостероиды (п = 14) 54,8 ± 8,7 30,8 ± 3,6 < 0,001
Примечание: * — р < 0,001 в сравнении между ИНФЛ и МСК. Таблица 5
УРОВЕНЬ ИЛ-8 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ В СРАВНИВАЕМЫХ ГРУППАХ ВЗК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИДА И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ТЕРАПИИ
№ Группы больных До лечения, пг/мл После лечения, пг/мл Р
1 Группа больных, получавших инфликсимаб (п = 16) 208,4 ± 59,4 190,8 ± 35,6 0,317
2 Группа больных, получавших МСК (п = 14) 167,9 ± 28,9 157,5 ± 34,4 0,39
3 Группа больных получавших системные кортикостероиды (п = 14) 189,4 ± 40,1 148,8 ± 35,8 0,008
Таблица 6
УРОВЕНЬ ИЛ-12 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ В СРАВНИВАЕМЫХ ГРУППАХ ВЗК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИДА И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ТЕРАПИИ
№ Группы больных До лечения, пг/мл После лечения, пг/мл Р
1 Группа больных, получавших инфликсимаб (п = 16) 145,5 ± 27,0 28,8 ± 9,4 < 0,001
2 Группа больных, получавших МСК (п = 14) 71,2 ± 10,1* 28,1 ± 8,8 < 0,001
3 Группа больных получавших системные кортикостероиды (п = 14) 53,8 ± 17,9 94,5 ± 45,3 < 0,05
Примечание: * — р < 0,001 в сравнении между ИНФЛ и МСК.
Таблица 7
УРОВЕНЬ ИЛ-15 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ В СРАВНИВАЕМЫХ ГРУППАХ ВЗК В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИДА И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ТЕРАПИИ
№ Группы больных До лечения, пг/мл После лечения, пг/мл Р
1 Группа больных, получавших инфликси-маб (п = 16) 59,3 ± 16,0 45,5 ± 15,2 0,013
2 Группа больных, получавших МСК (п = 14) 111,4 ± 42,5* 62,8 ± 22,6 < 0,001
3 Группа больных получавших системные кортикостероиды (п = 14) 55,8 ± 9,0 55,2 ± 6,5 0,73
Примечание: * — р < 0,001 в сравнении между ИНФЛ и МСК.
180 160 140 120 100 80 60 40 20
Scatterplot: Индекс Беста vs. ИЛ-12 (Casewise MD deletion) ИЛ -12 = 20,894 + ,27033 * Индекс Беста Correlation: г = ,87946
о
у
о о -
о° о ^^ о
о о /i --О о^^ ^ о
СГ о о
о
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Индекс Беста
Ж 95% confidence
Б >
ст
So
I- Е ft
о
^ а
га е 2 =
a
га ■&
Б
га
й <и т S X
S
<
Рис. 5. Корреляция индекса клинической активности болезни Крона (CDAI) с исходным уровнем ИЛ-12 сыворотки крови (г = 0,87, р < 0,01)
80
70
60
50
40
30
Scatterplot: Индекс Рахмилевича vs. ИЛ-12 (Casewise MD deletion) ИЛ-12 = -15,60+ 8,3522* Индекс Рахмилевича Correlation: г = ,69577
20
7 8
Индекс Рахмилевича
9
10
11
^95% confidence
Рис. 6. Корреляция индекса клинической активности язвенного колита (Рахмилевича) с исходным уровнем ИЛ-12 сыворотки крови (г = 0,69, р < 0,01)
1-Л
СО
Scatterplot: Индекс Беста vs. И/1 -12 (Casewise MD deletion) ИЛ-12 = 16,535 + ,33651 * Индекс Беста Correlation: г = ,60353
40
60
80
100 120 Индекс Беста
140
160
180
95% confidence
Рис. 7. Корреляция индекса клинической активности болезни Крона (СПА1) в период ремиссии с уровнем ИЛ-12 сыворотки крови (г = 0,6, р < 0,05)
Scatterplot: Индекс Рахмилевича vs. ИЛ-12 (Casewise MD deletion) ИЛ -12 = 10,191 + 9,5907 * Индекс Рахмилевича Correlation: г = ,69191
70
60
50
40
гч
I
30
20
10
1 / о ^
8 У / ^---- —
■ __ - - - "о
..... о
с ^^ ^ б
лг '
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Индекс Рахмилевича
3,5
4,0
4,5
Ж 95% confidence
<3 СО
Рис. 8. Корреляция индекса клинической активности язвенного колита (Рахмилевича) в период ремиссии с уровнем ИЛ-12 сыворотки крови (г = 0,69, р < 0,05)
При анализе полученных результатов было установлено, что содержание цитокинов с различными функциональными свойствами максимально повышено у пациентов с впервые выявленным заболеванием; но снижается при терапии 5-АСК, ин-фликсимабом и достигает минимальных значений при длительном применении иммуносупрессоров. Базисная терапия при хронических воспалительных заболеваниях кишечника сопровождается у большинства больных достоверным снижением увеличенного содержания сывороточных цитокинов по сравнению с уровнем, предшествующим лечению. Эти данные отражают положительную динамику заболевания, улучшение показателей клинической, биохимической, морфологической активности, иммунного статуса, эффективность применяемой терапии. Стойкое продолжающееся повышение уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15, ИНФ-у, ФНО-а) на фоне проводимой терапии свидетельствует об отсутствии выраженных позитивных изменений, прогрессировании воспалительных, иммунопатологических процессов. Следовательно, обострения хронических воспалительных заболеваний тонкой и толстой кишки сопровождаются многократным увеличением в сыворотке крови содержания широкого спектра провоспалительных цитокинов, отражающим динамику патологического процесса.
ВЫВОДЫ
1. Выполненные исследования свидетельствуют об увеличении уровней провоспалительных
цитокинов: ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-15 в сыворотке крови больных ВЗК, указывая на возможное участие этих цитокинов в механизмах развития этих заболеваний.
2. С нарастанием активности воспалительного процесса отмечалось повышение уровней провоспалительных цитокинов, что согласуется с литературными данными [10; 14; 15], так как повышение содержание этих цитокинов сопровождалось увеличением активности заболеваний, и может быть использовано для диагностики активности ВЗК.
3. Анализ динамики уровня провоспалительных цитокинов позволяет оценить как активность воспалительного процесса, так и эффективность проводимой терапии.
4. Несмотря на селективность действия инфликсимаба на ФНО-а, диапазон его биологического действия намного шире, а лечебный потенциал выше, чем у стандартных базисных препаратов. Терапия инфликси-мабом, снижая уровень ФНО-а, приводит к достоверному снижению других провоспалительных цитокинов, способствуя тем самым уменьшению воспалительной активности ВЗК.
5. Трансплантация МСК также снижает уровень большинства провоспалительных цитокинов, уменьшая тем самым интенсивность иммунопатологических процессов одновременно с позитивной динамикой клинической картины заболевания.
Б >
CT
So
I- E ft
о
va
Л E 2 =
а
ID
Б ID
s/
û <u т s
X
s
<
ЛИТЕРАТУРА
1. Насонов Е.Л. Нарушение иммунитета при аутоиммунных заболеваниях // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. —
1999. — Т. IX, № 4, прил. 7. — С. 43-48.
2. Насонов Е.Л. Фактор некроза опухолей-a новая мишень для противовоспалительной терапии ревматоидного артрита // РЖМ. —
2000. — Т. 8, № 17. — С. 718-722.
3. Rutgeerts P. A critical assessment of new therapies in inflammatory bowel disease // J. Gastroenterol. Hepatol. — 2002. — Vol. 17, suppl. — S177 QR.
4. Targan S.R. Biology of inflammation in Crohn's disease: mechanism of action of anti — TNF-a therapy // Scand. J. Gastroenterol. — 2000. — Vol. 14, Suppl. C. — 13C.
5. Papadakis K.A., Targan S.R. Role of cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel disease // Ann. Rev. Med. — 2000. — Vol. 51. — P.
289-298.
6. Ricart E., Panccione R., Loftus E., Tremain W. Infliximab for Crohn's disease in clinical practice at the Mayo Clinic: the first 100 patients // Am. J. Gastroenterol. — 2001. — Vol. 96. — P. 722-729.
7. Воробьев А.А., Быков А.С., Караулов А.В. Иммунология и аллергология: учебное пособие для студентов медицинских вузов. — М.: Практическая медицина, 2006. — 288 с.
8. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. — М.: Медицина, 1999. — 608 с.: ил. (Учеб. лит. для студ. мед. вузов). ISBN 5-225-02755-5)
9. Van Deventer S.J. H Tumor necrosis factor and Crohn's disease // Gut. — 1997. — Vol. 40, № 4. — P. 443-448.
10. Фарелл Р., ПепперкорнМ. Язвенный колит // Межд. мед. журн. — 2003. — Т. 5, № 1.
11. Койко Р., Саншайн Д., Бенджамини Э. Иммунология: учебное пособие; пер. с англ. — М.: Академия, 2008. — 368 с.
12. Бурместер Г.-Р., Пецутто А., с участием Улрихса Т., Айхер А. Наглядная иммунология // Наглядная медицина; пер. с англ. — М., 2009.
13. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии диагностика заболеваний иммунной системы // Руководство для врачей. — М., 2009. — 345 с.
14. Белоусова Е.А., Морозова Н.А., Никитина Н.В. Инфликсимаб (ремикейд) в лечении рефрактерных форм болезни Крона // РМЖ. — 2005. — Т. 7, № 1. — С. 28-32.
15. Белоусова Е.А. Биологическая стратегия в лечении воспалительных заболеваний кишечника // Фарматека. — 2006. — № 6 (121).
со
