CC BY
56
УДК 591.81
ДИНАМИКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА ГЕПАТОЦИТОВ ЭКТО-И ЭНДОТЕРМНЫХ ЖИВОТНЫХ
Е.И. АНТОНОВА, Д.И. БЕКОВА, Л.Е. САГАЛБАЕВА, О.Ю. ШПАК*
Сравнительный анализ выявил, что у амфибий в большей мере выражены показатели обеих фракций хроматина, в отличие от группы птиц. Распределение популяции гепатоцитов по фазам клеточного цикла носит неравномерный характер - у амфибий большее количество гиподиплоидных гепатоцитов и гепатоцитов в стадию G0-G1, тогда как у птиц в G2-M и S-стадии. Соотношение уровня митотической активности и количества гиподиплоидных гепатоцитов у птиц выше, тогда как соотношение показателей полиплоидизации и пролиферации ниже по сравнению с амфибиями, что объясняется различными стратегиями метаболизма организмов изучаемых групп животных.
Ключевые слова: амфибия, клеточный цикл, эндотермные животные.
Пространственная организация генома, радиальное расположение хромосом интерфазных ядер проявляет тканеспецифич-ность, эволюционный консерватизм у всех видов животных [11]. Изменения в архитектонике интерфазного ядра играют важную роль в видообразовании [5]. Известно, что основные регуляторные процессы реализуются через реорганизацию структуры хроматина, в основе которой лежит дифференциальное позиционирование различных районов хромосом как относительно друг друга, так и по отношению к ядерной оболочке, оказывая существенное влияние на экспрессию генов [4,5,11]. Размер генома определяет продолжительность жизни и специфическую биологию организма [8,15]. Генная плотность растет с увеличивающимися уровнями некодирующей ДНК. Сложность организации и размер генома эукариот является адаптивным проявлением генетического дрейфа в ответ на длительное сокращение размера популяции, которое сопровождалось увеличением размера организма [14]. Распределение участков гетеро- и эухроматина в интерфазных хромосомах упорядочено и, по-видимому, может служить видовым признаком [2,12,7].
Учитывая, что у амфибий наблюдается самая большая внутривидовая изменчивость и биологическая вариативность размера генома, по сравнению с другими видами позвоночных, а птицы -самые древние в филогенетическом отношении животные и в отличие от амфибий имеют самый компактный размер генома.
Цель исследования - изучение показателей клеточного цикла, количества и топографии хроматина гепатоцитов у экто - и эндотемных животных в условиях физиологической нормы.
Материалы и методы исследования. Эксперимент поставлен на амфибиях вида Rana terrestris Andrzejewski, 1832 (Rana arvalis Nilsson, 1842), и птицах вида Columba livia (forma domesti-ca) Gmelin, 1789. В обеих группах исследования проводились на 30 половозрелых особях самцах - амфибии трехлетки и голуби шести месяцев постнатального развития.
Мазки печени окрашивали по Фельгену в модификации G. Olson, в реактиве Шиффа. На препаратах определяли состояние обоих фракций хроматина (F - конденсированного, D - декон-денсированного): интегральную плотность - (DI, FI (у.е)), общую интегральную плотность (TI (у.е)), площадь распределения (DP, FP (мкм2)), площадь ядра (ТР (мкм2)), оптическую плотность (DM, FM (у.е)), среднюю оптическую плотность (T_SR (у.е)), периметр (DL, FL (мкм)), коэффициент округлости хроматина (DK, FK (мкм3)). Измерения параметров ДНК проводились на сканирующем микроскопе-фотометре «Люмам ПМ-11». В каждой группе у каждого животного количество ДНК было измерено в 200 ядрах. Во всех случаях исследовали только одноядерные гепатоциты [1]. Фотографирование и обработка препаратов проводилась на автоматизированном морфометрическом комплексе «Axioplan» («Karl Zeiss», Германия).
Статистическую обработку полученного материала осуществляли с помощью пакета прикладных программ ”STATISTICA-6” Р<0,05 [3]. Различия между независимыми выборками определяли с помощью критерия Mann-Whitney тест, многофакторного дисперсного анализа MANOV, по критерию Стьюдента (t).
Результаты и их обсуждение. В группах изучаемых видов животных выявлены видовые особенности в количестве, топографии хроматина гепатоцитов. Так, в группе амфибий пространст-
венно-топорграфическое распределение хроматина представлено (рис. 1): мелкозернистыми фракциями с равномерным распределением по всей площади ядра; сетчато-крупноглыбчатыми зонами, локализованными либо в центре ядра, либо диффузно и в области ядерной ламины; пикнотичными ядрами (сверкомпактизация).
Рис. 1. Ядра гепатоцитов амфибий вида Яапа 1егге$1п$. Окраска по Фельге-ну. Увеличение ок 10х об 90. Гетерогенность топографии хроматина гепатоцитов.
У птиц (рис. 2) такого разнообразия топографического распределения хроматина не выявлено. Хроматин в основном представлен перемежающимися сетчатыми структурами из мелко- и крупнозернистых агрегатов с различной локализацией.
Выявленные особенности отражают как отличие в общем содержании ДНК, так и отличия в содержании фракций эу- и гетерохроматина. В частности, интегральная оптическая плотность эухроматина (Э1) в 3 раза и гетерохроматина (П) в 2 раза выше у амфибий, по сравнению с группой птиц.
У амфибий большая интегральная оптическая плотность гетеро - и эухроматина определяет, соответственно, и большую общую интегральную плотность (Т1), которая в 3 раза выше, чем у птиц (рис. 3,5).
Нами выявлены особенности в уровне компактизации гетеро- и эухроматина (ЭМ, БМ). При этом все показатели выше в группе амфибий: а именно общая оптическая плотность (Т_8Я) в обеих фракциях на 17% (рис. 4, 6) и уровень компактизации гетерохроматина на 19%. Уровень оптической плотности эухромати-на у амфибий проявляет меньшие показатели в сравнении с гетерохроматиновой фракцией, но превышает на 14% показатель оптической плотности эухроматина, выявленный у птиц.
Показатели средней оптической плотности обеих фракций хроматина в гепатоцитах амфибий и птиц определяют показатели коэффициента округлости деконденсированного хроматина (ЭК), который примерно одинаков в обеих группах животных, но меньше, чем показатели коэффициента округлости гетерохроматиновой фракции (БК). При этом показатели коэффициента округлости гетерохроматина у амфибий на 5% больше, чем у птиц.
Площадь распределения эухроматина и гетерохроматина (ЭР, БР) в группе амфибий в 2 раза и в 1,7 раза соответственно больше, по сравнению с группой птиц. Таким образом, общая площадь ядер (ТР) у амфибий в 2,5 раза больше, чем у птиц.
т
Рис. 2. Ядра гепатоцитов птиц вида Со1ишЪа 1та. Окраска по Фельгену. Увеличение ок 10 х об 90. Гетерогенность топографии хроматина гепатоцитов.
* Омский Государственный Педагогический Университет, кафедра ботаники, цитологии и генетики, 644099 Омск, набережная Тухачевского,14
TI vs. T_SR T_SR = ,00747 + ,05797 * TI Correlation: r = ,66277
О Regression 24 2 8 95% confid.
TI
Рис. З. Амфибии вида Rana terrestris. Гистограмма распределения популяции гепатоцитов по клеточному циклу.
TI - интегральная оптическая плотность хроматина.
TI vs. T_SR T_SR = ,07484 + ,00532 * TI Correlation: r = ,22717
Рис. 4. Амфибии вида Rana terrestris. Двумерное распределение ядер гепа-тоцитов по TI - интегральной оптической плотности ДНК и T_RS - средней оптической плотности ДНК. Многофакторный дисперсный анализ MANOVA.
Периметр эухроматина и гетерохроматина (DL, FL) у птиц в 1,5 и 1,4 раза соответственно меньше, по сравнению с группой амфибий.
На основании частот интегральной оптической плотности обеих фракций хроматина ядер гепатоцитов изучаемых животных, можно распределить популяцию гепатоцитов по фазам клеточного цикла. Так, у амфибий 2,25% гепатоцитов являются гиподиплоид-ными, 88,8% в G0-G1 стадии, 1,75% в G2-M и в S-стадии - 7,5% (рис. 3, 4). В группе птиц количество гиподиплоидных гепатоцитов - 2%; на стадии G0-G1 - 77,2%, на стадии G2-M - 2,8%, на стадии S-периода клеточного цикла - 18% (рис. 5, б).
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
§
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 Normal
Upper Boundaries (x <= boundary)
Рис. 5. Птицы вида Columba livia. Гистограмма распределения гепатоцитов по клеточному циклу. TI - интегральная оптическая плотность хроматина.
Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что наибольшее количество гепатоцитов в G0-G1 стадии (2п2с) выявлено у амфибий. Причем характер распределения гепатоцитов по стадиям клеточного цикла определяется тем, что у амфибий выявлено минимальное количество гепатоцитов, находящихся в S, G2-M стадиях клеточного цикла, вследствие чего у данного вида организмов определен минимальный показатель ИП (индекс пролиферации). Тогда как у птиц в S-стадии и G2-M стадии клеточного цикла находится большее число гепато-цитов, и соответственно показатель ИП у данной группы животных выше.
Рис. 6. Птицы вида Columba livia. Двумерное распределение ядер гепатоцитов по TI - интегральной оптической плотности ДНК и T_RS - средней оптической плотности ДНК. Многофакторный дисперсный анал из
MANOVA.
Учитывая что, динамический баланс между гибелью и пролиферацией клеток в организме составляет основу тканевого гомеостаза, то в связи с этим нами выявлено, что соотношение уровня митотической активности и количество гиподиплоидных гепатоцитов (G2-M/D) составляет 0,8 у амфибий, у птиц - 1,4. Высокие показатели соотношения свидетельствуют о более интенсивных процессах регенерации, связанных с высоким уровнем метаболизма в группе птиц. Соответственно у данной группы животных выявлено большее количество гепатоцитов в М-стадии клеточного цикла, которые формируют своеобразный резерв гепатоцитов, «готовых» к пролиферации.
Установлено соотношение полиплоидизации и пролиферации (соотношение S/G2-M) из которого следует, что из общего количества гепатоцитов, находящиеся в S-стадии, у амфибий 18,9% вступают в G2-M-стадию. А у птиц этот показатель ниже -13,5%. Следовательно, у эктотермных животных, в отличие от эндотермных основной формой физиологической репарации является процесс формирования полиплоидных гепатоцитов за счет двуядерных форм, вследствие активации ацитокинетических митозов.
Выявленные нами наибольшие показатели в количестве, уровне компактизации ДНК, площадь ядер у амфибий отражают то, что увеличение в эволюции размера генома определяет низкую скорость метаболизма на клеточном и организменном уровнях, согласно толерантной стратегии метаболизма как признака устойчивости к гипоксии и реоксигенации данной группы животных [9,10]. В свою очередь, у птиц уменьшение размеров клетки соответственно уменьшение соотношения поверхности клетки к объему цитоплазмы облегчает процесс газового обмена, как адаптация к полету. Уменьшение в эволюции количества ДНК (соответственно, размера генома) в группе птиц способствует более эффективной реализации генетической информации в «сжатой форме», при этом проявляется обратная корреляция количества ДНК к интенсивности обмена веществ [13]. Следовательно, состояние хроматина и ядерный размер являются ключевыми параметрами, которые приспосабливают размер генома исследуемых групп животных к эво-люционно сформированным метаболическим стратегиям организма: амфибии - толерантная, птицы - резистентная [2,6,14]. Проведенный сравнительный анализ исследуемых показателей хроматина выявил различия практически во всех изучаемых показателях, в основе этого лежат эволюционные, адаптивные процессы, которые определяют стабильность существования вида согласно его экологической специализации.
Литература
1. Козинец, Г.И. Клетки крови. Современные технологии их анализа / Г.И. Козинец, В.М. Погорелов, Д. А. Шмаров, С.Ф. Боев, В.В. Сазонов.- М.: Триада-Фарм, 2002.- 171с.
2. Патрушев, Л.И. Экспрессия генов / Л. И. Патрушев.- М.: Наука, 2000.- 527 с.
3. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва.- М.: МедиаСфера, 2002.- 305 с.
4. Cockell, M. Nuclear compartments and gene regulation / M. Cockell, S. M. Gasser // Curr. Opin. Genet. Develop.- 1999.- Vol. 9.-P. 199-205.
5. Cremer, C. Arrange ments of macro-and microchromosomes
iI
iI
in chicken cells / C. Cremer, T. Cremer, I. Solovei. // Chromosome Res, 2001. -Vol. 9.- P. 569-584.
6. Dundr, M. Functional architecture in the cell nucleus [Text] / M. Dundr, T. Misteli // Biochem, 2001.- Vol. 356. P. 297-310.
7. Gerlich, D. Dynamics of chromosome positioning during the cell cycle / D. Gerlich, J. Ellenberg // Current Opinion in Cell Biology, 2003.- Vol. 15.- P. 664-671.
8. Gregory, T.R. Is small indel bias a determinant of genome size? / T.R. Gregory // Trends. Genet, 2003.- Vol. 19.- P. 485-488.
9. Hermes-Lima, M. Animal response to drastic changes in oxygen availability and physiological oxidative stress / M. Hermes-Lima, T. Zenteno-Savin // Comp. Biochem. Physiol, 2002.- Vol. 133.— P. 537-556.
10. Jackson, D. C. Acid-base balance during hypoxic hypome-tabolism: selected vertebrate strategies / D. C. Jackson // Resp. Phys. Neur, 2004.- Vol. 141.- P. 273-283.
11. Parada, L. A. Spatial genome organization / L. A. Parada,
S. Sotiriou, T. Misteli // Exp. Cell Res, 2004.- Vol. 296.- P. 64-70.
12. Saccone, S. Localization of the gene- richest and the gene-poorest isochores in the interphase nuclei of mammals and birds / S. Sac-cone, C. Federico, G. Bernardi // Gene, 2002.- Vol. 300.- P. 169-178.
13. Sharov, A. A. Genome increase as a clock for the origin and evolution of life / A. A. Sharov // Biol. Direct, 2006.- Vol. 1.- P. 17.
14. Vinogradov, A. E. A spiral of DNA: importance of to be the Rich collector of dust / A. E. Vinogradov // Nucleic. Acids. Res, 2003.- Vol. 31.- P. 1838-1844.
15. Zuckerkandl, E. Why so many noncoding nucleotides? The eukaryote genome as an epigenetic machine / E. Zuckerkandl // Gene-tica, 2002.- Vol. 115.- P. 105-129.
THE DYNAMICS OF CELLULAR CYCLE INDICES OF HEPATOCYTES OF ECTO- AND ENDOTHERMIC ANIMALS
YE.I. ANTONOVA, D.I. BEKOVA, L. YE. CAGALBAEVA, O.YU. SHPAK
Omsk State Pedagogical University, Chair of Botany Cytology and Genetics
The comparative analysis reveals that amphibians have more expressed rates of both chromatin fractions unlike birds. The distribution of the hepatocyte population according to cell cycle is uneven: phase G0-G1 for most part of hypodiploid hepatocyte at amphibians, whereas at birds it is into G2-M and S-phases. The correlation of mitotic activity and the number of hypodiploid hepatocytes among birds is higher than the same indices of polyploidy and proliferation which is much lower in comparison with amphibians. It is because of different lines of metabolism in studied animal groups.
Key words: amphibian, cellular cycle, endothermic animals.
УДК 612.028
ОСОБЕННОСТИ УСЛОВНОРЕФЛЕКТОРНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ С РАЗЛИЧНОЙ ТИПОЛОГИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТЬЮ НА ФОНЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ АНТИОКСИДАНТА
Т.А. БАТАЛОВА*
Исследованы поведенческие особенности трех типов лабораторных крыс под влиянием мексидола. Подтверждена ранее выдвинутая гипотеза о необходимости использования животных с низкими когнитивными способностями в экспериментах с использованием средств, оптимизирующих показатели поведенческой сферы.
Ключевые слова: время рефлекса, типы лабораторных крыс, мек-сидол, универсальная проблемная камера
Фундаментальная физиология поведения имеет прикладное значение для фармакологии поведения и психофармакологии. Одной из важных проблем этой отрасли знаний является выявление нейротропных свойств у разных веществ с помощью различных методов тестирования поведения животных в сложно организованной среде лабиринтов или проблемных камер. Основным недостатком существующих экспериментальных способов является отсутствие объективной количественной оценки качественных позитивных изменений стратегий поведения. Такие способы являются унифицированными методами оценки специфического нейротропного эффекта препаратов [1,2]. Предлагаемые нами устройства и методы [3,4] являются одной из попыток предложить количественное выражение такого качественного признака
* Амурская государственная медицинская академия, 675000, г. Благовещенск, Горького, 95, Ъа1а1оуа ta@mai1.ru
как уровень индивидуальных когнитивных способностей у крыс, или их квантификацию до и после назначения препарата.
Эффективность поисковых действий лимитирует присущий каждой особи уровень интегративной деятельности мозга, он детерминирован многими эндогенными и экзогенными факторами и имеет индивидуальный «потолок». Известные на сегодняшний день инструментальные способы регистрации поведенческих параметров не учитывают данные индивидуальные особенности, что нарушает объективность получаемых данных, а это, в свою очередь, снижает достоверность получаемых сведений при тестировании средств, влияющих на высшие функции мозга. Вопрос достоверного и всестороннего изучения когнитивных способностей на различных биологических моделях при применении физиологически активных соединений на сегодняшний момент остается до конца нерешенным. Исследования когнитивной сферы предъявляют ряд строгих требований к ее оценке и нуждаются в использовании такого комплекса поведенческих методических приемов, которые бы адекватно отражали эту оценку [5].
Вместе с тем существуют множество средств и способов, направленных на коррекцию поведенческих состояний. Последнее на сегодняшний день является проблемой первостепенного значения для большинства индустриально развитых стран мира, связанной со значительной распространенностью нервнопсихических расстройств. Это обусловлено темпом современного научно-технического прогресса и сопряжено с резким возрастанием комплекса эмоциональных и информационных нагрузок, неблагоприятно воздействующих на нервную систему.
Цель исследования - изучение показателей условнорефлекторной деятельности (времени выработки рефлексов, параметров поискового поведения) в универсальной проблемной камере у животных с различными поведенческими типами (выделенными согласно разработанной нами методики [5,6]) на фоне применения известного нейротропного средства-антиоксиданта мексидола.
Материалы и методы исследования. Исследования проводились на взрослых 72 беспородных крысах-самцах (по 24 особи из каждого поведенческого типа), содержащихся в стандартных условиях вивария. Содержание и все процедуры с экспериментальными животными проводились с учетом требований Общества защиты животных.
В каждой типологической группе крыс анализировалось влияние мексидола (70 мг/кг) на параметры условнорефлекторной деятельности лабораторных крыс с различными когнитивными способностями в универсальной проблемной камере (УПК) на фоне информационно-эмоционального стресса в структуре трех форм поведения: оборонительного (после предварительной выработки инструментального рефлекса активного избегания (ИРАИ)), пищевого (на фоне сформированного инструментального пищедобывательного рефлекса (ИПР)) и питьевого (с соответствующим выработанным питьевым инструментальным рефлексом(ПИР)). Время выработки инструментальных рефлексов, энергетические показатели поисковой активности (ВП -время поиска, ИП - интенсивность поиска) и параметры когнитивной сферы (КП - когнитивный показатель, КСОП - коэффициент стратегии ошибочных побежек) поисковой активности (ПА) у подопытных особей сравнивались с аналогичными параметрами у контрольных животных. Также проводился сравнительный анализ значений регистрируемых параметров поведения у подопытных особей на 1 и 5 сутки экспериментов.
Инструментальным устройством для исследования послужила универсальная проблемная камера, методика тестирования в которой описана в предыдущем нашем сообщении [7].
Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программы «Віовіаі» [8] по методам вариационной статистики с оценкой статистической значимости показателей и различий рассматриваемых выборок по ^критерию Стьюдента.
Результаты и их обсуждение. При выработке инструментальных рефлексов у крыс со средними когнитивными способностями время их возникновения имело достоверно значимую разницу между 1 и 5 сутками обучения в контрольной и подопытных группах (табл. 1). Время формирования ИРАИ на 5 сутки (в сравнении с 1 сутками) обучения было в 4,3 раза меньше (р<0,001) у контрольных особей и в 9,9 раза меньше у подопытных животных (р<0,001). При этом, время формирования ИРАИ в 1 сутки у подопытных крыс по сравнению с контролем (в этот же день)
