CC BY
21Морфология. Патология
УДК 616.7
ДИНАМИЧЕСКОЕ ЗАСЕЛЕНИЕ БИОДЕГРАДИРУЕМОГО НОСИТЕЛЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРОЙ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ
СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК
© 2019 М.С. Божокин1, Д.Б. Вчерашний2, Л.Л. Бейлинсон2, Е.М. Литвинов2, В.Л. Косьмин2, С.В. Новосельцев3, В.Н. Круглов4
1ФГБУ «Российский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Санкт-Петербург 2 ФГБУН «Физико-технический институт им. А.Ф. Иоффе» Российской академии наук, Санкт-Петербург 3Частная АНО ДПО «Северо-Западная академия остеопатии и медицинской психологии», Санкт-Петербург 4Частное учреждение образовательная организация высшего образования «Медицинский университет «Реавиз», Самара
Травмы и заболевания, приводящие к дефектам опорно-двигательного аппарата, затрагивают миллионы пациентов во всем мире. Для восстановления повреждённых участков хрящевой и костной ткани, зачастую недостаточно собственных регенеративных возможностей организма. Это приводит к необходимости дорогостоящих оперативных вмешательств. Одним из способов замещения костных и хрящевых дефектов, а также эффективного восстановления повреждённого связочного аппарата является применение клеточно-инженерных конструкций (КИК). Клеточно-инженерная конструкция из биодеградируемого полимера (матрицы, скаффолда) и культуры аутологичных (или аллогенных) клеток может быть безопасно трансплантирована в область повреждения. Затем, скаффолд биодеградирует, а клеточная культура синтезирует необходимое количество внеклеточного матрикса, который замещает участок костного или хрящевого дефекта. В данной работе описано работоспособное устройство для динамического заселения клеточной культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга на всю глубину биодеградируемой полимерной матрицы.
Ключевые слова: клеточно-инженерная конструкция, биодеградируемый полимер, аллогенные клетки, ме-зенхимальные мультипотентные стромальные клетки.
Введение. Травмы и заболевания, приводящие к дефектам опорно-двигательного аппарата, затрагивают миллионы пациентов во всем мире. Для восстановления повреждённых участков хрящевой и костной ткани, зачастую недостаточно собственных регенеративных возможностей организма. Это приводит к необходимости дорогостоящих оперативных вмешательств [1]. Несмотря на большой набор методик, имеющихся в арсенале современной травматологии и ортопедии, задача восстановления повреждённых участков хрящевой ткани в полном объёме до сих пор не решена. В настоящее время разрабатываются перспективные способы замещения костных и хрящевых дефектов, а также эффективного восстановления повреждённого связочного аппарата [2].
Одной из таких методик является применение клеточно-инженерных конструкций (КИК) [3]. Состоящий из биодеградируемого полимера (матрицы, скаффолда) и культуры аутоло-
гичных (или аллогенных) клеток, данный объект может быть безопасно трансплантирован в область повреждения. Далее, скаффолд биодеградирует, а клеточная культура синтезирует необходимое количество внеклеточного матрикса, который замещает участок костного или хрящевого дефекта. Применение таких конструкций является перспективным в травматологии и ортопедии, поскольку в ткани, выполняющей механические функции, основную роль выполняет именно внеклеточный матрикс, а функции клеточных элементов вторичны.
В настоящее время описано несколько устройств для динамического заселения КИК [4]. Однако они не лишены целого ряда недостатков. К примеру, предложенный Ковалевым А.В. биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций не позволяет эффективно населять и культивировать плотные КИК, т.к. в его основе лежит послойное нанесение клеточных элементов за счет распыления [5].
В этой работе описано работоспособное устройство для динамического заселения клеточной культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга (ММСК) на всю глубину биодеградируемой полимерной матрицы.
Культивирование клеток. Культуру клеток ММСК выделяли из бедренных костей половозрелых крыс. После высевания на адгезивный культуральный пластик, (Sarstedt, Германия), ММСК культивировали в течение двух недель до третьего пассажа. Использовали питательную среду состава 80 % DMEM (Биолот, Россия), 10 % FBS (Биолот, Россия) и смеси антибиотиков стрептомицин-пенициллин (Биолот, Россия) в концентрации 25 мкг/мл со сменой среды каждые трое суток культивирования. Клетки пересеивали при достижении 80 % плотности монослоя. Подтверждение культуры ММСК проводили методом проточной цито-метрии с использованием моноклональных антител CD45 и CD90, коньюгированных с флю-орохромами флуоресцеин (FITC), фикоэритрин (PE) на проточном цитофлуориметре - сортировщике клеток BD FACS Aria III (BD Biosciences, США) c помощью программного обеспечения FACSDiva7 (Denovosoftware, США).
Приготовление биодеградируемых матриц. Биодеградируемые матрицы для культивирования клеток готовили методом лиофильной сушки с добавлением коллагена в концентрации 0,1 мг/мл. Приготовленные матрицы стерилизовали в 70 % растворе этанола в течение 20 мин., промывали PBS и облучали УФ в течение 4 ч.
Совмещение биодеградируемой матрицы и культуры клеток. Для совмещения би-одеградируемого носителя (матрицы) и культуры клеток, было разработано специальное устройство (патент RU 190863 U1). Общий вид показан на рис. 1. Корпус выполнен из нержавеющей стали марки 12х18Н10Т, применяемой для медицинских изделий. Перед началом работы изделие стерилизовали путем нагрева до 130 °C в течение 30 минут, после чего в ростовую камеру помещали матрицу. После этого, с помощью насоса, сверху закачивали питательную среду с культурой ММСК в концентрации 0,5^ 106 клеток в 1 мл. Затем аппарат герметизировали, и через электромагнитный клапан с внешним управлением подавали азот высокой чистоты с избыточным давлением 0,1 мПа.
Для увеличения эффективности заселения матрицы применяли многократную фильтрацию культуры клеток. Количество ММСК определяли с помощью счетчика клеток (Countess®, Thermofisher США). Контроль проводили трижды: до заселения, после первой прокачки и после второй прокачки. Таким образом, достигали заданной стандартной концен-
трации клеточной культуры в растворе перед первой фильтацией - 0,5 •Ю6 клеток в 1 мл с объёмом фильтруемой среды - 5 мл.
Рис. 1. (А) Общий вид устройства для совмещения культуры ММСК и биодеградируемого носителя под действием избыточного давления газа. (B) Схема устройства: 1 - крышка, 2 - корпус, 3 - заужение ростовой камеры, 4 - полость ростовой камеры, 5 - канал, 6 - электромагнитный клапан, 7 - полое соединение, 8 - заглушка, 9 - датчик измерения концентрация О2, 10 - перистальтический насос
Исследования структуры КИК. Оценку эффективности применения разработанного устройства проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и гистологически на четвертые сутки после заселения КИК. Кроме того, выполняли СЭМ нативных полилактидных матриц.
Для проведения СЭМ анализа КИК обезвоживали спиртами восходящей концентрации, затем поверхностно модифицировали слоем золота и палладия толщиной 5 нм. Под действием разности потенциалов до 30 кВ, пучок, направленный на образцы, отклонялся, детектировался, и происходила пространственная (объёмная) визуализация (до 0,4 нанометра) деструктивных и пролиферативных изменений полилактидных матриц и КИК. Методика позволяет получить информацию о структуре, распределению клеточных элементов, архитектонике носителя и некоторых других свойствах приповерхностных слоёв КИК и полилактидных матриц. Исследования проводили на микроскопе Jeol JSM 6390LA (Япония) совместно с ФГБУН «Ботанический институт им. В.Л. Комарова».
Для гистологических исследований КИК фиксировали в 10 % формалине (рН 7,5), обезвоживали спиртами возрастающей концентрации и заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5-7 мкм получали с помощью санного микротома Leica (Германия). Окраску проводили гематоксилином - эозином (Био-Витрум, Россия) по стандартной методике. Микроскопическое исследование и фотодокументирование проводили с помощью светового микроскопа Nikon E-50i (Япония), оснащенного цифровой камерой «Nikon DS-Fi1» (Япония).
Результаты. Использую методику проточной цитометрии, была подтверждена принадлежность исследуемой культуры клеток к популяции ММСК. По результатам проведённых гистологических исследований выявлено заселение клеточной культуры по всей поверхности биодеградируемой матрицы и на всю её глубину (рис. 2).
Рис. 2. Микрофотография области матрицы с клетками. Световая микроскопия, Х100, окраска гемотоксилин и эозин. 4 сутки культивирования. В прямоугольнике выделена область поперечной фильтрации
с максимальным содержанием клеток
Однако распределение данной клеточной культуры в объеме самой полилактидной матрицы оказалось неравномерным. Так, по центру КИК плотность распределения клеточной культуры была визуально больше, чем по окружности. На СЭМ фотографиях также визуализируются клетки, равномерно распределенные на поверхности КИК (рис. 3).
Рис. 3. Сканирующая электронная микроскопия опытной клеточно-инженерной конструкции. 4 сутки наблюдения. Контрольный штрих указан на рисунке. КИК с добавлением клеточной культуры динамическим методом заселения. Увеличение Х100 слева (А) и Х300 справа (В).
Выделенная область (А) показана с большим разрешением (В)
В ходе гистологической проводки отмечена деградация образцов нативной матрицы, что не позволило получить качественные срезы, провести окраску и микроскопию. При анализе снимков СЭМ нативной полилактидной матрицы, без заселения клеточной культуры, четко видна волокнистая структура (рис. 4), которая не определяется на снимках, сделанных на 4 сутки после заселения.
Рис. 4. Сканирующая электронная микроскопия матрицы без клеток. Контрольный штрих указан на рисунке. Увеличение Х17 слева (А) и Х650 справа (В). 4 сутки наблюдения. Выделенная область слева (А) показана справа (В) с большим увеличением
Заключение. Выделенная по стандартизованному протоколу клеточная культура из костного мозга была подтверждена методом проточной цитометрии, что свидетельствует об адекватном выборе данной методики и согласуется с литературными данными [6].
Применение разработанного устройства позволяет заселить клеточную культуру на всю глубину, однако гистологическое исследование тестируемых образцов выявило неравномерность заселения КИК клеточными элементами. По-видимому, это обусловлено наибольшим давлением, которое создается в центральном дренажном отверстии в разработанном устройстве. Плотность и равномерность распределения клеточной культуры зависит как от свойств матрицы (размер пор, их связанность), так и от технических условий динамического заселения: количества этапов фильтрации, давления, объёма фильтруемой среды, концентрации клеток. Данные параметры требуют отработки на этапе создания скаффолда для конкретной области применения, что может позволить стандартизировать получаемые по разработанному алгоритму КИК.
Деградация образцов, наблюдаемая при изготовлении гистологических препаратов КИК и нативной матрицы, может быть обусловлена гидролизом полилактидной мембраны под действием компонентов гистологической проводки (органические растворители). Этот процесс был более выражен на образцах нативной матрицы, что не позволило провести их гистологическое исследование. По мнению авторов, пролиферирующая клеточная культура в составе КИК синтезировала внеклеточный матрикс на поверхности волокон матрицы, защищая их от прямого воздействия компонентов проводки. В пользу данного предположения свидетельствуют различия в поверхностной структуре матриц, выявленные с помощью СЭМ на одинаковых сроках наблюдения (4 суток) (рис. 3В, рис. 4В). Проверка данной гипотезы требует дополнительных исследований. Понимание молекулярных механизмов пролиферации клеточной культуры необходимо для прогнозирования их поведения в экспериментальных исследованиях in vivo, поэтому данный вопрос активно изучается в настоящее время [7]. К примеру, Park H. и соавт. показали, что пролиферация клеточной культуры, помещённой в биодеградируемый скаффолд из поликапролактона, зависит от состава и строения последнего [8]. Из литературных данных известно, что маркером пролиферации клеток соединительной ткани в норме и патологии может служить количественный анализ синтеза белка внеклеточного матрикса [9].
Таким образом, разработано оригинальное устройство для создания КИК путем динамического заселения клеточной культурой биодеградируемого носителя на всю глубину. Полученные результаты позволяют предположить возможность создания стандартных условий для заселения, что приведет к получению КИК с заданными свойствами. Воспроизводимые образцы КИК позволят провести репрезентативные исследования пролиферативных свойств клеточной культуры в динамике. Отдельной задачей является необходимость изучения состава вновь синтезированного клеточного матрикса и его зависимости от характеристик матрицы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Морфофункциональная характеристика хондрорегенераторного процесса в экспериментальном локальном дефекте поверхности суставного хряща I М.С. Божокин и др. II Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2017. - № 8-2. - С. 302-306.
2 Возможности современных клеточных технологий для восстановления поврежденного суставного хряща (аналитический обзор литературы) I М.С. Божокин, С.А. Божкова, Г.И. Нетылько II Травматология и ортопедия России. - 2016. - Т. 22. - № 3. - С. 122-134.
3 Результаты замещения поверхностного дефекта гиалинового хряща крысы клеточно-инженерной конструкцией в эксперименте I М.С. Божокин и лр. II Труды Карельского научного центра Российской академии наук. - 2018. - № 4. - С. 13-22.
4 Зависимость заполнения стромальными клетками костного мозга трехмерной матрицы от способа посева клеток и типа модификации поверхности матрицы I Ю.А. Нащекина и др. II Цитология. - 2014. - Т. 56. -№ 4. - С. 283-290.
5 Биореактор для выращивания тканеинженерных конструкций I А.В. Ковалев II Патент на изобретение 2482180. Заявка: 2011129288I10 Россия, 2013.
6 Применение проточной цитометрии для оценки качества биомедицинских клеточных продуктов I Г.А. Трусов и др. II Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2018. - Т. 18. - № 1. - С. 16-24.
7 Увеличение синтеза коллагена II типа при облучении культуры мезенхимальных мультипотентных стро-мальных клеток низкоинтенсивным лазерным излучением длиной волны 633 нм I Е.М. Литвинов и др. II Вестник медицинского института «РЕАВИЗ»: реабилитация, врач и здоровье. - 2019. - № 4 (40). - С. 35-38.
8 Chondrogenic, hypertrophic, and osteochondral differentiation of human mesenchymal stem cells on three-dimensionally woven scaffolds I Larson B.L., Yu S.N., Park H., Estes B.T., Moutos F.T., Bloomquist C.J., Wu P.B., Welter J.F., Langer R., Guilak F., Freed L.E., J Tissue Eng Regen Med. 2019 Aug;13(8):1453-1465.
9 Синтез агрекана и коллагена II типа in vitro хондроцитами из разных зон коленного сустава больных гонарт-розом I Е.И. Щелкунова и др. II Электронный журнал «Современные проблемы науки и образования». -2016. - № 6.
Рукопись получена: 25 октября 2019 г. Принята к публикации: 4 ноября 2019 г.
