Научная статья на тему 'Сравнительный анализ трехмерных полилактидных скаффолдов различной пористости, предназначенных для восстановления хрящевой ткани'

Сравнительный анализ трехмерных полилактидных скаффолдов различной пористости, предназначенных для восстановления хрящевой ткани Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

CC BY
307
65
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
РЕГЕНЕРАТИВНАЯ МЕДИЦИНА / REGENERATIVE MEDICINE / ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ / TISSUE ENGINEERING / ПОЛИЛАКТИДНЫЕ СКАФФОЛДЫ / POLYLACTIC SCAFFOLDS / СУСТАВНОЙ ХРЯЩ / ARTICULAR CARTILAGE / МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КОСТНОГО МОЗГА / BONE MARROW MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS / ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ МАТРИКС / EXTRACELLULAR MATRIX / ХОНДРОГЕННАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА / CHONDROGENIC DIFFERENTIATION / ДИМЕТИЛМЕТИЛЕНОВЫЙ СИНИЙ / DIMETHYLMETHYLENE BLUE

Аннотация научной статьи по биотехнологиям в медицине, автор научной работы — Копелев П. В., Нащекина Ю. А., Александрова С. А.

Создание тканеинженерных конструкций имеет большое практическое значение в разработке новых методов терапии хряща. Отработана методика получения трехмерных полилактидных скаффолдов с порами различного диаметра. Проведен сравнительный анализ скаффолдов по признакам: количество жизнеспособных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга в процессе культивирования; выработка клетками белков внеклеточного матрикса в процессе хондрогенной дифференцировки. Сделан выбор в пользу скаффолдов с диаметром пор 0.04 0.14 мм для дальнейшего использования в восстановительной терапии хрящевой ткани.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биотехнологиям в медицине , автор научной работы — Копелев П. В., Нащекина Ю. А., Александрова С. А.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Comparative analysis of 3d poly(l,l-lactic) scaffolds with various porosity for cartilage tissue regeneration

Development of tissue-engineered constructions has a great practical importance for the creation of new experimental methods for cartilage therapy. The technique of three-dimensional polylactic scaffolds with different pore size creation was developed. Comparative analysis of following scaffold attributes was performed: the number of viable multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow during cultivation; production of extracellular matrix proteins during the chondrogenic differentiation. The scaffolds with a pore diameter of 0.04-0.14 mm was prefered for further cartilage tissue engineering.

Текст научной работы на тему «Сравнительный анализ трехмерных полилактидных скаффолдов различной пористости, предназначенных для восстановления хрящевой ткани»

БИТ 2018 Том 2 № 3(7)

УДК 57.085.23, 57.089.67

Сравнительный анализ трехмерных полилактидных скаффолдов различной пористости, предназначенных для восстановления хрящевой ткани

Копелев П.В.1,2, Нащекина Ю.А.1, Александрова С.А.1

1ФГБУН «Институт цитологии» РАН, Санкт-Петербург,

2ФГАОУ ВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра

Великого», Санкт-Петербург

Comparative analysis of 3d poly(l,l-lactic) scaffolds with various

porosity for cartilage tissue regeneration

Kopelev P.V.12, Naschekina Y.A.1, Alexandrova S.A.1

1FSFIS "Institute of Cytology" RAS, Saint-Petersburg, 2FAEI HE "Peter the Great Saint-Petersburg Polytechnic University", Saint-Petersburg

Аннотация

Создание тканеинженерных конструкций имеет большое практическое значение в разработке новых методов терапии хряща. Отработана методика получения трехмерных полилактидных скаффолдов с порами различного диаметра. Проведен сравнительный анализ скаффолдов по признакам: количество жизнеспособных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга в процессе культивирования; выработка клетками белков внеклеточного матрикса в процессе хондрогенной дифференцировки. Сделан выбор в пользу скаффолдов с диаметром пор 0.04 -0.14 мм для дальнейшего использования в восстановительной терапии хрящевой ткани.

Ключевые слова: регенеративная медицина, тканевая инженерия, полилактидные скаффолды, суставной хрящ, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга, внеклеточный матрикс, хондрогенная дифференцировка, диметилметиленовый синий.

Abstract

Development of tissue-engineered constructions has a great practical importance for the creation of new experimental methods for cartilage therapy. The technique of three-dimensional polylactic scaffolds with different pore size creation was developed. Comparative analysis of following scaffold attributes was performed: the number of viable multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow during cultivation; production of extracellular matrix proteins during the chondrogenic differentiation. The scaffolds with a pore diameter of 0.04-0.14 mm was prefered for further cartilage tissue engineering.

Keywords: regenerative medicine, tissue engineering, polylactic scaffolds, articular cartilage, bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells, extracellular matrix, chondrogenic differentiation, dimethylmethylene blue.

Введение

В настоящее время остеоартроз является самой распространенной формой поражения суставов и причиной ухудшения качества жизни миллионов людей по всему миру. Самостоятельная регенерация хрящевой ткани затруднена вследствие отсутствия кровеносных сосудов в суставах, а также малым количеством хондроцитов в составе хрящевой ткани. Особое место среди разработок технологий по восстановлению хрящевой ткани занимают клеточные технологии, в частности, создание трехмерных конструкций из скаффолда и клеток. В качестве скаффолдов для восстановления хрящевой ткани используются

различные материалы, в том числе поли-лактид, который отвечает всем требованиям, предъявляемым к материалам для тканевой инженерии [1]. Ранее в нашей лаборатории были изготовлены трехмерные полилактидные скаффолды с размером пор от 0.15 до 0.3 мм в диаметре в исследованиях in vitro была показана их биосовместимость и нетоксичность для разных типов клеток, в частности, хондроцитов и мульти-потентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костного мозга [2, 3].

Кроме состава материала скаффолда, на функционирование клеток большое влияние может оказывать его топология поверхности и трехмерная организация. В

БИТ 2018 Том 2 № 3(7)

формировании хрящевой ткани важную роль играют межклеточные взаимодействия. Формирование плотных контактов между хондробластами, вызывающих развитие хондрогенных узелков и сфероидов, является обязательным этапом формирования хрящевой ткани [4]. Считается, что этот этап необходим для запуска экспрессии специфических белков внеклеточного матрикса (ВКМ). Поэтому важно создать условия для возможности формирования сфероидов внутри скаффолда с помощью взаимосоединяющихся пор определенного диаметра.

Цель настоящей работы состояла в создании трехмерных полилактидных скаф-фолдов с порами различного диаметра и проведении их сравнительного исследования по количеству жизнеспособных ММСК костного мозга кролика при росте в составе скаффолдов и выработке клетками ВКМ в ходе хондрогенной дифференцировки.

Материалы

ММСК костного мозга были получены из костного мозга новорожденного кролика породы Шиншилла (питомник «Раппо-лово»). Культивирование производили в ростовой среде аМЕМ (Lonza, Швейцария) с 10% сыворотки эмбрионов коров (СЭК) (HyClone, США) в инкубаторе с 5 % СО2 при температуре 37°С. Индукцию дифференци-ровки в хондрогенном направлении проводили заменой ростовой среды на индукционную - StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit (Life Technologies, США), с последующим культивированием в ней в течение 4 недель.

Трехмерные скаффолды для культивирования клеток изготавливали из поли^^)лактида (Sigma, США) с характеристической вязкостью 1.49 дл/г.

Методы

Скаффолды изготавливали методом выщелачивания [5]. Поли^^)лактид растворяли в хлороформе (трихлорметане) (Вектон, Россия). Далее 1.65 мл раствора с концентрацией полимера 20 мг/мл наливали в стеклянные формы диаметром 30 мм и высотой 15 мм. Затем раствор полимера покрывали до прекращения впитывания солью (NaCl), предварительно разделенной на фракции с помощью трех сит с сетками 0.04, 0.14, 0.5 мм. Оставляли сушиться на воздухе на 1 сут до полного удаления растворителя. После этого скаффолды выдерживали 1 сут в 100 мл воды SQ, затем про-

мывали проточной водой до полного вымывания кристаллов соли. После вымывания соли скаффолды высушивали в ламинарном боксе в течение 2 сут. В результате были изготовлены три варианта скаффол-дов диаметром 30 мм и высотой 1.5 мм, из которых вырезали кружки диаметром 5 мм для проведения опытов. Полученные скаффолды стерилизовали в озонаторном шкафу и затем дополнительно УФ-светом в ламинарном боксе в течение 1 -2 ч. Перед посевом клеток скаффолды выдерживали 30 мин в 70%-ном этаноле для смачивания, затем промывали 2 раза фосфатно-соле-вым буфером. Скаффолды размещали в лунках 96-луночного планшета, ММСК сажали по 75 тыс. клеток в лунку на поверхность скаффолда в 200 мкл хондрогенной среды.

Прижизненные наблюдения за культурой клеток осуществляли с помощью инвертированной световой микроскопии на микроскопе Nikon Eclipse TS100. Для визуализации клеток на непрозрачных трехмерных скаффолдах проводилась конфокальная микроскопия на микроскопе ZOE Fluorescent Cell Imager (Bio-Rad, США) с предварительной окраской ядер клеток красителем DAPI FluoroShield (Vector Laboratories, США).

Для оценки количества жизнеспособных клеток использовали колориметрический метод - МТТ-тест [6]. По истечении срока культивирования производили смену ростовой среды на среду с 10% МТТ (0,5 мг/мл) и инкубировали 2 ч до формирования кристаллов формазана. Скаффолды с клетками переносили в новые 96-луночные планшеты, в каждую лунку добавляли по 300 мкл раствора диметилсульфоксида (ДМСО) и экстрагировали формазан в течение 20 мин при постоянном покачивании планшета. Раствор окрашенного ДМСО переносили в чистые лунки и определяли оптическую плотность (ОП) с помощью анализатора иммуноферментных реакций УНИПЛАН (АИФР-01) (Пикон, Россия) при длине волны 570 нм и референсной - 620 нм. Для определения количества клеток использовали калибровочную кривую, построенную по ОП известного количества клеток. По полученным данным вычисляли среднее количество жизнеспособных клеток и ошибку среднего.

Выявление характерного для хрящевой ткани ВКМ проводили колориметрическим

Таблица 1

Сопоставление фракций кристаллов соли с размером полученных пор

Варианты ПЛ скаффолдов 1 2 3

Размер сетки сита, мм 0.5 0.14 0.04

Фракции кристаллов соли, диаметр, мм 0.5 - 1.2 0.14 - 0.5 0.04 - 0.14

Поры скаффолда, диаметр, мм 0.5 - 0.6 0.28 - 0.43 0.04 - 0.14

Вариант 1 Вариант 2 Вариант 3

Рис.1. Трехмерные ПЛ скаффолды. Световая микроскопия, ув. х100.Над стрелкой указан диаметр

поры.

методом после окрашивания диметилмети-леновым синим (ДМС). ДМС представляет собой катионный краситель, который специфически связывается с сульфатирован-ными гликозаминогликанами (хондроитин сульфат, кератин сульфат и гепарансуль-фат и др.) [7]. Рабочий раствор ДМС готовили по следующей методике: к 200 мл SQ воды добавляли 19 мл 0.1 М соляной кислоты, 0.474 г хлорида натрия, 0.608 г глицина и 3.2 мг порошка ДМС. Перемешивали, полученный раствор фильтровали.

ВКМ выявляли отдельно в культураль-ной среде и непосредственно на клетках. Затем, суммируя полученные значения, определяли общее количество ВКМ в лунках. Выявление ВКМ в среде: из лунок отбирали пробы объемом 100 мкл, добавляли к ним по 2.5 мл раствора ДМС. ОП измеряли на спектрофотометре ПЭ-5400 УФ (ЭКРОС, Россия) на длине волны 525 нм. Количество ВКМ рассчитывали с использованием калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям хондроитин сульфата. Выявление ВКМ на клетках: ММСК на скаффолдах промывали фосфатно-соле-вым буфером и лизировали 1 сут при 57°С в 200 мкл буфера, содержащего 1 мг/мл протеиназы К, 1 ммоль/л йодоцетамида в 50 ммоль/л Т^рН 7.4, а также 10 мкг/мл пеп-статина А, растворенного в 95%-ном этаноле. Затем отбирали 100 мкл пробы и окрашивали по методике, приведенной выше. Для расчета среднего количества и

ошибки среднего общего количества ВКМ в лунке использовали значения 4 лунок. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием программы Microsoft Office Exœl 2016. Результаты

Создание трехмерных скаффолдов с различным диаметром пор

Были изготовлены трехмерные поли-лактидные скаффолды с тремя разными значениями диаметра пор с целью выбрать наиболее подходящий для дифференци-ровки ММСК в хондрогенном направлении. Диаметр пор измеряли с помощью объект-микрометра (ОМО, ГОСТ 7513-56) и светового микроскопа Nikon Eclipse TS-100 (Рис. 1). Результаты измерений представлены в таблице 1.

Анализ распределения ММСК по ПЛ скаффолдам

Через 4 недели культивирования ММСК в хондрогенной среде, посаженных на изготовленные ПЛ скаффолды, проводили анализ формирования сфероидов и распределения клеток по внутренней поверхности скаффолдов с помощью флуоресцентной микроскопии. Можно видеть (рис. 2.), что во всех вариантах опыта ММСК сформировали сфероиды. Можно отметить разный характер сформировавшихся сфероидов.

БИТ 2018 Том 2 № 3(7)

Вариант 1

Вариант 2

Вариант 3

Рис. 2. Сфероиды ММСК в хондрогенной среде, 4 недели культивирования после посева на ПЛ скаффолды с разным размером пор. Конфокальная микроскопия, ядерный краситель DAPI.

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

III

2 недели

I

4 недели

Вариант 1 Вариант 2 Вариант 3

Рис. 3. Количество жизнеспособных клеток на разных сроках культивирования в составе ПЛ скаффолдов. МТТ-тест. Варианты скаффолдов обозначены разным цветом.

Так, при росте клеток в составе скаффолдов с самыми крупными порами, формировались крупные, рыхлые (без четкой организации) сфероиды (рис. 2а). У скаффолдов с порами среднего размера (рис. 2б) встречались сфероиды меньшего размера, более компактные. Границы сфероидов выглядели более четко. У скаффолдов с порами самого маленького размера (рис. 2в) формировались самые компактные сфероиды. Кроме роста клеток в составе сфероидов, можно было наблюдать распределе-

ние клеток по поверхности материала, выстилание внутренних и внешних поверхностей пор у всех вариантов скаффолдов.

Определение количества жизнеспособных клеток

С помощью МТТ-теста было проведено определение количества жизнеспособных клеток при культивировании их в составе ПЛ скаффолдов в разное время. На рис. 3 можно видеть, что после 2-недельного куль-

Рис. 4. Количество наработанного клетками ВКМ при культивировании на ПЛ скаффолдах. Варианты скаффолдов обозначены разным цветом.

тивирования во всех вариантах опыта обнаруживается примерно одинаковое количество клеток. Однако через 4 недели количество клеток возрастает, причем в первых двух вариантах - в несколько раз.

Анализ наработки внеклеточного матрикса

Выявление характерного для хрящевой ткани ВКМ было проведено колориметрическим методом через 2 и 4 недели культивирования ММСК в составе ПЛ скаффолдов в хондрогенной среде. Полученные данные представлены на гистограмме (Рис. 4).

Можно видеть, что уже к двум неделям культивирования наблюдаются отличия по количеству наработанного ВКМ. Больше всего его обнаружено при росте ММСК на скаффолдах со средним и маленькими размером пор (варианты 2 и 3). Через 4 недели культивирования количество белков ВКМ выросло во всех вариантах, но наибольшее количество выявлено при росте клеток на скаффолдах с диаметром пор 0.04 - 0.14 мм (вариант 3).

Обсуждение

Использование трехмерных скаффол-дов позволяет максимально приблизиться к имитации микроокружения естественного хряща. Изделия из полилактида обладают сниженной адгезивностью для клеток, что способствует спонтанному объединению клеток в сфероиды. При культивировании в 3D условиях увеличивается способность ММСК собираться в сфероиды и дифференцироваться в хондрогенном направлении, при этом усиливается выработка ВКМ.

Размер пор скаффолда может оказывать влияние на качество сфероидов, их динамику функционирования в составе скаф-фолда. При нормальном хондрогенезе клетки собираются в группы, объединяются плотными контактами в сфероиды и вырабатывают внеклеточный матрикс в огромном количестве, являющийся основой хрящевой ткани. Поэтому важно создать условия, при котором будет наблюдаться максимальная наработка ВКМ.

В ходе настоящей работы была разработана методика создания трехмерных по-лилактидных скаффолдов с порами различного диаметра и проведено их сравнительное исследование по количеству жизнеспособных ММСК костного мозга кролика при росте в составе скаффолдов и выработке клетками ВКМ в ходе хондрогенной диффе-ренцировки.

Были изготовлены трехмерные ПЛ скаффолды диаметром 30 мм и высотой 1.5 мм с разным размером пор: вариант 1 - 0.5 - 0.6 мм, вариант 2 - 0.28 - 0.43 мм, вариант 3 - 0.04 - 0.14 мм (в диаметре).

Анализ жизнеспособности клеток при росте в составе пор проводился с помощью флуоресцентной (конфокальной) микроскопии, которая позволяет визуализировать клетки на трехмерных образцах небольшой толщины, и с помощью МТТ-теста, который позволяет вычислить общее количество клеток без учета их распределения. Во всех вариантах опыта были отчетливо видны сформировавшиеся сфероиды из ММСК,

что свидетельствует о хондрогенной диф-ференцировке. Результаты анализа жизнеспособности ММСК через 2 и 4 недели культивирования в составе скаффолдов позволили сделать вывод о том, что все варианты ПЛ скаффолдов не ингибируют жизнеспособность клеток (не являются токсичными), обладают адгезивностью для ММСК и не препятствуют пролиферации клеток во время культивирования. Можно отметить, что динамика пролиферативной активности при росте ММСК в составе скаффолдов с наименьшим размером пор (вариант 3) является самой низкой. Это может быть связано с процессами, которые происходят во время дифференцировки, во время которой пролиферативная активность клеток, как правило, снижается.

Важным критерием для оценки скаф-фолдов является способность усиливать или ослаблять способность ММСК к диффе-ренцировке. О степени хондрогенной диф-ференцировки клеток можно судить по выработке ими ВКМ. Количество ВКМ было определено с помощью колориметрического метода по выявлению сульфатиро-ванных гликозаминогликанов, которые спе-

цифически окрашиваются диметилметиле-новым синим. Определяли ВКМ как в составе скаффолда (на поверхности скаф-фолда и клеток), так и ВКМ, который попал в среду культивирования. Было выявлено, что через 4 недели культивирования количество белков ВКМ выросло во всех вариантах, но наибольшее количество выявлено при росте клеток на скаффолдах с наименьшим размером пор - 0.04 - 0.14 мм в диаметре (вариант 3).

Сопоставляя данные, полученные разными методами, можно отметить, что наибольшее количество ВКМ наблюдается в варианте скаффолдов с самыми малыми порами, в то время как количество клеток в этом варианте меньше, чем в остальных. Такая динамика сходна с явлениями, наблюдающимися в нативном хряще, где клетки пролиферируют слабо, их основная их цель - выработка большого количества ВКМ.

Можно заключить, что вариант ПЛ скаффолда с размером пор 0.04 - 0.14 мм в диаметре является наиболее перспективным для создания трехмерного тканеинже-нерного эквивалента хрящевой ткани.

Список литературы

1. Hutmacher D.W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage // Biomaterials.2000. Vol. 21, pp. 2529-2543.

2. Нащекина Ю.А., Никонов П.О., Михайлов

B.М., Пинаев Г.П. Зависимость заполнения стромальными клетками костного мозга трёхмерной матрицы от способа посева клеток и типа модификации поверхности матрицы // Цитология. 2014. Т.56, № 4, С. 283-290.

3. Копелев П.В., Нащекина Ю.А., Александрова

C.А. Оценка жизнеспособности хондроцитов кролика при культивировании на полилактидных скаффолдах, предназначенных для тканевой инженерии хрящевой ткани // Бюллетень инновационных технологий. 2017. Т.1, № 2, С. 31-35.

4. Anderer U., Libera J. In vitro engineering of human autogenous cartilage // J Bone Miner Res. 2002. Vol. 17, pp. 1420-1429.

5. Hou Q., Grijpma D.W., Feijen J. Porous polymeric structures for tissue engineering prepared by a coagulation, compression moulding and salt leaching technique // Biomaterials. 2003. Vol. 24(11), pp. 1937-1947. doi: 10.1016/S0142-9612(02)00562-8.

6. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J Immunol Methods. 1983. Vol. 65(1-2), pp. 55-63.

7. Coulson-Thomas V.J., Gesteira T.F. Dimethylmethylene Blue Assay (DMMB). Bioprotocol. 2014. Vol. 4(18), doi: 10.21769/BioProtoc. 1236.

Поступила в редакцию 12.07.2018

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Сведения об авторах:

Копелев Павел Владимирович - студент магистратуры кафедры Медицинская Физика Санкт-Петербургского политехнического университета имени Петра Великого; старший лаборант-исследователь Лаборатории Клеточных Биотехнологий Центра Клеточных Технологий Института Цитологии РАН. Email: paxa94@bk.ru

Нащекина Юлия Александровна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Группы Тканевой Инженерии Центра Клеточных Технологий Института Цитологии РАН. E-mail: ulychka@mail.ru

Александрова Светлана Алексеевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник Лаборатории Клеточных Биотехнологий Центра Клеточных Технологий Института Цитологии РАН. E-mail: alekssvet2205@gmail.com

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 14-50-00068 «Стволовые клетки - основа клеточных технологий»

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.