CC BY
2
УДК 577.2
Димерные бисбензимидазолпирролы DB2Py(n) - АТ-сайт-специфичные лиганды: синтез, физико-химический анализ и исследования биологической активности
О. Ю. Сусова1*, С. Ш. Каршиева1, А. А. Костюков2, Н. И. Моисеева1, Е. А. Зайцева1, К. В. Калабина1, Е. Жусинайте4, К. Гильдеманн4, Н. М. Смирнов3, А. Ф. Арутюнян3, А. Л. Жузе3
1НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России, Москва, 115522 Россия 2Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва, 119334 Россия 3Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, 119991 Россия 4 Тартуский университет, Институт технологии, Тарту, 50411 Эстония *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 16.11.2023 Принята к печати 29.01.2024 DOI: 10.32607/actanaturae.27327 РЕФЕРАТ Бензимидазол является фундаментальным фармакофором при создании лекарств из-за его широкого спектра биологической активности. Синтезированы новые АТ-специфичные флуоресцентные молекулы бисбензимидазола DB2Py(n), содержащие пирролкарбоксамидный фрагмент антибиотика не-тропсина. С использованием спектров поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма показана способность бисбензимидазолпирролов к комплексообразованию с ДНК. Новая серия DB2Py(n) оказалась более токсичной на линиях опухолевых клеток человека и менее токсичной для неопухолевых клеток. Бисбензимидазолпирролы проникали в ядро клетки, воздействовали на фазу S-клеточного цикла, а также в низких концентрациях ингибировали эукариотическую топоизомеразу I в бесклеточной модели. Анализ пролиферации опухолевых клеток в режиме реального времени подтвердил усиление токсических свойств при димеризации бисбензимидазолпиррола. Согласно предварительным данным определения цитотоксичности бисбензимидазолпирролов на клеточной модели с фенотипом множественной лекарственной устойчивости мономерные соединения преодолевают множественную лекарственную устойчивость, в то время как димеризация молекулы приводит к снижению этого свойства до средних величин по сравнению с доксорубицином. Таким образом, новые цитотоксичные бис-бензимидазолпиррольные структуры представляют интерес для дальнейшего глубокого изучения их свойств и механизма действия в отношении опухолевых клеток человека, а также для дизайна новых АТ-специфичных лигандов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА бисбензимидазолпиррол, узкобороздочный лиганд, цитотоксичность, комплексообра-зование с ДНК, топоизомераза I, клеточный цикл, множественная лекарственная устойчивость. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДМФА - диметилформамид; МЛУ - множественная лекарственная устойчивость; Топо-I - эукариотическая топоизомераза I; ХЖКД - холестерическая жидкокристаллическая дисперсия; IC50 - концентрация соединения, вызывающая гибель 50% клеток.
ВВЕДЕНИЕ новые возможности для терапии социально зна-
Соединения, способные связываться с высокой кон- чимых заболеваний, в том числе злокачественных стантой с узкой бороздкой ДНК за счет образования новообразований. Быстрый рост устойчивости опу-водородных связей, представляют интерес в каче- холей к используемым протоколам лечения дела-стве средств, способных регулировать биологиче- ет необходимым поиск новых эффективных ДНК-скую активность. Применение бисбензимидазолов специфичных лигандов, что является важным в качестве лекарственных препаратов открывает направлением развития медицинской химии [1—4].
Мишенью ДНК-специфичных соединений на основе узкобороздочных лигандов служат АТ-пары нуклеотидов в структуре ДНК. Существует возможность подбора структуры лиганда под выбранный участок связывания на ДНК, а также исключение неспецифического связывания с ДНК благодаря комплементарным взаимодействиям между ДНК-специфичным лигандом и биомакромолекулой. В этом плане наиболее перспективны низкомолекулярные узкобороздочные лиганды. Такие соединения в значительной степени свободны от побочного мутагенного эффекта, характерного для низкомолекулярных соединений, интер-калирующих между парами оснований ДНК. Они способны модулировать экспрессию генов и ДНК-связывающих белков, проявляя таким образом противоопухолевые свойства.
Ранее мы получили на основе Hoechst 33258 ряд флуоресцентных водорастворимых АТ-специфичных димерных бисбензимидазольных узкобороздочных лигандов серий DB(n), DBP(n), DBA(n) и DBPA(n), где n равно количеству мети-леновых звеньев в линкере. Все вышеупомянутые соединения содержат в своей структуре два АТ-распознающих фрагмента, состоящих из двух бис-
бензимидазольных блоков [5-8]. При взаимодействии с ДНК каждый АТ-распознающий фрагмент образует бифуркационную (трехцентровую) водородную связь с О2-атомом тимина и/или ^-атомом аденина двух соседних АТ-пар, накрывая при этом участок размером примерно полторы пары оснований [9]. Все соединения фВ(п), DBP(n), DBA(n) и DBPA(n)) проникали через клеточную и ядерную мембраны, окрашивали ДНК и демонстрировали значительную активность в качестве ингибиторов ДНК-зависимых ферментов.
В работе проведен синтез и изучена биологическая активность новых узкобороздочных лигандов, содержащих в своей структуре АТ-распознающий пирролкарбоксамидный фрагмент, аналогичный фрагменту природного антибиотика нетропсина [10], не нашедшего применения в практике из-за высокой цитотоксичности. Новые лиганды МВ2Ру и МВ2Ру(Ас) (рис. 1) состоят из трех АТ-распознающих блоков - двух бензи-мидазольных и одного пирролкарбоксамидного, ковалентно связанных друг с другом, и димерных производных DB2Py(n) (рис. 1), являющихся продуктом димеризации МВ2Ру олигометиленовыми а,ю-дикарбоновыми кислотами различной длины
Рис. 1. Структурные формулы Hoechst 33258, нетропсина, мономерных MB2Py, MB2Py(Ac) и димерных ^единений DB2Py(n) . В MB2Py(Ac) бисбензимидазольный фрагмент выделен красным, а пирролкарбоксамидный фрагмент синим цветом
Х>
,, ' H2 - Pd/C N , , HCl, EtOH
<D
U
X-0
Реакция восстановления-ацилирования
H2 - Pd/C, Ac2O, AcOH
r41 ^
MB2Py(Ac)
92% i* ■
EtOH
Реакция восстановления
О
Н.СГ v
CH,
-NH Y^-j" s
MB2Py
93%
NH,
Реакция димеризации
1) HOOC(CH2)nCOOH, n = 4,5 HBTU, DIPEA, ДМФА
2) HCl, EtOH
CH,
I ° ° NK ^N-VH H H
<TV"H
" о / н,С
Рис. 2. Схема синтеза мономерных соединений MB2Py, MB2Py(Ac) и димерных DB2Py(4, 5)
DB2Py(n) X6HC!
n=4, 5 47%
X6HC!
о
(п - число метиленовых звеньев в линкере) с образованием симметричных соединений по типу «голова-к-голове». Использование гибкого линкера в димерных соединениях позволит молекуле связываться с двумя АТ-богатыми сайтами, находящимися на разных расстояниях друг от друга. Как показано нами ранее, димеризация мономерного лиганда серии DB(n) привела к увеличению аффинности к ДНК новой структуры [11].
Увеличение количества АТ-распознающих фрагментов в мономерной субъединице ведет к увеличению константы комплексообразования лиганд-ДНК и должно снижать ингибирующую концентрацию в отношении ДНК-зависимых ферментов. В данной работе описываются синтез и изучение биологической активности двух мономерных соединений - МВ2Ру и МВ2Ру(Ас), и димерных соединений DB2Py(n).
Синтез димерных бисбензимидазолпирролов DB2Py(4,5) осуществлен исходя из 6-[6-(4-метил-пиперазин-1-ил)-1Н-1,3-бензодиазол-2-ил]-2-(4-нитро-1-пропил-1Я-пиррол-2-ил)-1Я-1,3-бензо-диазола (I) (рис. 2), полученного в лаборатории ДНК-белковых взаимодействий Института молекулярной биологии РАН. Соединение (I) использовали для получения мономерного лиганда МВ2Ру(Ас) путем восстановления исходного соединения в токе водорода в ледяной уксусной кислоте в присутствии уксусного ангидрида на 10% палладии на угле в качестве катализатора. Мономерное соединение МВ2Ру получено аналогичным методом в присутствии соляной кислоты и этанола в качестве растворителя. Исходя из мономерного бис-
бензимидазолпиррольного блока MB2Py получены два димерных соединения DB2Py(n) путем его димеризации рядом алифатических нормальных а,ю-дикарбоновых кислот в присутствии HBTU в качестве конденсирующего агента и DIPEA как основания в ДМФА, отличающихся количеством метиленовых звеньев в линкере, n = 4, 5 (рис. 2).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали адипиновую и пимелино-вую кислоты, HBTU, DIPEA (Fluka, Швейцария), диоксан, ДМФА, ледяную AcOH, Ac2O, iPrOH, ацетон («Реахим», Россия). Растворы веществ в органических растворителях сушили над Na2SO4. Растворители упаривали на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса, как правило, при 30-50°С. Вещества высушивали в вакууме над P2O5 и NaOH. Температуры плавления определяли на приборе Boethius (Германия). Гидрирование проводили над 10% Pd/C (Merck, Германия) при атмосферном давлении и комнатной температуре до прекращения поглощения водорода. Чистоту полученных соединений определяли с помощью TCX на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck). Вещества на хроматограммах обнаруживали в УФ-свете по поглощению при 254 нм и/или по флуоресценции при 365 нм.
Спектры ХН-ЯМР регистрировали на спектрометре Avance III 300 MHz (Bruker, Германия), оснащенным криогенным зондом тройного резонанса TCI (Bruker Biospin Gmbh, Германия) в DMSO-d6 при 30°C.
Масс-спектры снимали на времяпролетном приборе AB SCIEX 4800 (AB SCIEX, США) в режиме регистрации положительных ионов (если специально не оговорено); матрица — 2,5-дигидроксибензойная кислота; N2 — лазер, 337 нм.
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Cary100 (Varian, США).
Спектры флуоресценции растворов измерены на спектрофлуориметре PTI (Photo Technology Intern., Канада). Использовали двухцепочечную ДНК тимуса теленка (Sigma).
Спектры КД регистрировали при помощи портативного дихрометра СКД-2 (изготовлен в Институте спектроскопии РАН, г Троицк). Использовали ДНК спермы лосося (Техномед-сервис, Россия), кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см.
Опухолевые клеточные линии человека
Использовали линии немелкоклеточного рака легкого A549, рака толстой кишки HCT-116, гепатокар-циномы Huh7, карциномы поджелудочной железы PANC-1, рака молочной железы SKBR3, MCF7, рака яичников SKOV3, остеосаркомы U2OS человека, первичную культуру глиобластомы человека Gbl13n, иммортализованную эпителиальную клеточную линию HBL-100 и ее устойчивую к доксорубицину сублинию HBL-100/D0X и линию клеток молочной железы MCF10A неопухолевого происхождения. В качестве контрольных лекарств использовали иринотекан, доксорубицин (Sigma), этопозид, пуро-мицин (InvivoGen).
Для опухолевых клеточных линий человека использовали среду DMEM (Sigma), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Южная Америка) и 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», Россия). Клетки неопухолевого происхождения MCF10A культивировали в среде DMEM/F12 (Sigma), содержащей 5% лошадиной сыворотки (Biosera, Южная Америка), 100 мг/мл эпидермаль-ного фактора роста (EGF), 1 мг/мл гидрокортизона и 10 мг/мл инсулина («ПанЭко»). Обе среды содержали пенициллин и стрептомицин 100 Ед/мл («ПанЭко»), все клетки культивировали при 370С, 5% СО2.
Цитотоксический эффект оценивали с помощью стандартного МТТ-теста (Microculture Tetrazolium Test), основанного на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-
тетразолиум бромида (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде (DMSO). IC50 - концентрация соединения, вызывающая 50% гибель клеток. Реагент МТТ был приобретен в «ПанЭко». Окраску регистрировали на спектрофотометре при длине волны 570 нм с помощью спектрофотометра (Multiskan FC, Thermo Fisher Scientific, США). Оптическую плотность в лунках, где клетки инкубировали без контроля, принимали за 100%. Показатели оптической плотности в лунках с каждой концентрацией контроля усредняли и вычисляли процент выживших клеток при той или иной концентрации препарата.
Измерение клеточного цикла с помощью проточной цитофлуориметрии
Клетки HCT-116 рассевали по 500 х 103 клеток на лунку в 6-луночном планшете и растили в среде DMEM (Gibco, США), содержащей 2 мМ L-глутамина («ПанЭко») и 1-кратный раствор антибиотика - антимикотика (Gibco) с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (Gibco) при 37°C и 5% CO2. Через 24 ч меняли среду на свежую с добавлением препаратов в концентрации 1 мкМ, оставляя контрольные лунки без препарата. Клетки инкубировали в течение 24 и 48 ч. Для анализа клетки промывали на чашках раствором Версена («ПанЭко») и 0.25% раствором трипсина-EDTA (Gibco). Подсчитывали концентрацию клеток и отбирали равные количества для анализа. Центрифугировали в течение 5 мин при 1200 об/мин, удаляли супернатант, промывали в 1 мл холодного PBS. Клетки ресуспендировали в 1 мл холодного 96% этанола и инкубировали ночь при +4°C. Затем центрифугировали (15 мин, 1900 об/мин), промывали 1 раз раствором холодного PBS. К осадку добавляли 1 мл 3.8 мМ раствора цитрата натрия в PBS, содержащего 500 мкг/мл иодида пропидия и 1 мкл РНКазы A (10 мг/мл) и инкубировали в течение ночи при температуре +4°C. Флуоресценцию ио-дида пропидия измеряли в канале FL2 с помощью проточного цитофлуориметра CytoFlex. Данные анализировали с помощью программы ModFit LT 3.2 (Verity Software).
Пролиферацию клеток, подвергнутых воздействию исследуемых соединений, определяли с использованием анализатора клеток в реальном времени (RTCA) xCELLigence (ACEA Biosciences, США). По 5000 клеток остеосаркомы человека U2OS высевали в лунки 16-луночного планшета с микроэлектронным биосенсором на дне каждой лунки (запатентованные Е-планшеты) и инкубировали
в течение 24 ч в приборе Roche xCELLigence RealTime Cell Analyser (RTCA) DP (Roche Diagnostics GmbH, Германия). При достижении клеточного индекса l среду удаляли с последующим добавлением либо одной среды (контроль), либо среды с различными концентрациями веществ (0.16, 0.8, 4, 20, 100, 500 мкM соответственно).
Способность соединений проникать в клеточное ядро определяли с использованием флуоресцентного микроскопа в ультрафиолетовом диапазоне длин волн. Живые клетки глиобластомы Gbll3n выдерживали в культуральной среде с соединениями в концентрации 2 мкM в течение 2 суток, хорошо промывали фосфатно-солевым буфером, фиксировали формальдегидом, фотографировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия). Ядра клеток фотографировали с помощью конфокального микроскопа ZEISS LSM 710 (Carl Zeiss AG).
Ингибирование каталитической активности эукариотической топоизомеразы I в реакции релаксации суперскрученной ДНК (ссДНК). Способность модулировать активность топоизо-меразы I ^опо-I) in vitro изучали с использованием набора Topoisomerase I Drug Screening kit (TopoGen, Inc., cat. № 1018-1, www.topogen. com). 1 ед. очищенной ^по-I из тимуса теленка (Fermentas, США) и исследуемые соединения в концентрации 2.5 и 5 мкM; 0.65 и 1.25 мкM инкубировали с 0.12 мкг суперскрученной плазмидной ДНК рНО^ (TopoGen) в реакционном буфере xl (10 мM Tрис-HCl pH 7.9, 1 мM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.1% BSA, 0.1 мM спермидин, 5% глицерин). Реакцию проводили в течение 30 мин при 37°С, останавливали внесением SDS до конечной концентрации 1%, обрабатывали протеиназой К с конечной концентрацией 50 мкг/мл в течение 30-60 мин при 37°С. Продукты реакции разделяли электрофоретически в 1% ага-розном геле с TАЕ-бyфером (2 M Tрис-основание, 0.05 M EDTA, 1.56 M уксусная кислота) при максимальной напряженности электрического поля 3-4 В^м и затем окрашивали водным раствором этидия бромида (0.5 мкг/мл). Визуализацию ДНК в геле регистрировали по флуоресценции в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны от 240 до 360 нм. В отсутствие ингибитора ^по-I релаксировала ссДНК с образованием ряда топои-зомеров. Эффект ингибирования ^по-I выявляли по способности исследуемых соединений задерживать реакцию релаксации ссДНК, т.е. по сохранению ссДНК. Исходная концентрация растворов бисбен-зимидазолпирролов в DMSO составляла 5 x 10-3 M.
Данные по выживаемости клеток обрабатывали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 8, кривые жизнеспособности сравнивали с использованием критерия Фишера (F-тест). Все эксперименты повторяли 3 раза, влияние на пролиферацию клеток в режиме реального времени тестировали дважды. Для представления данных выбирали наиболее удачный опыт, результаты которого не противоречили результатам таких же опытов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Синтез мономерных бисбензимидазолпирролов MB2Py, MB2Py(Ac) и димерных соединений DB2Py(4, 5)
Синтез MB2Py. Суспензию 0.1 г 10% Pd/C в 20 мл абсолютного этанола насыщали водородом до прекращения его поглощения. Затем добавили 0.3 мл концентрированной соляной кислоты и 0.20 г (0.41 ммоль) 6-[6-(4-метилпиперазин-1-ил)-1Н-1,3-бензодиазол-2-ил]-2-(4-нитро-1-пропил-1Н-пиррол-2-ил)-1Н-1,3-бензодиазол (I). Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре до прекращения поглощения водорода. Полученный раствор отфильтровывали от катализатора и образовавшегося осадка, твердый осадок целевого вещества смывали с фильтра водой 2 х 10 мл, воду упаривали при пониженном давлении. Выход MB2Py - 0.173 г (93%) в виде зеленого аморфного порошка. По данным ТСХ в системе гексан-этил-ацетат (3:1) полученное вещество гомогенно. Масс-спектр: 455.26 [M+H]+, рассчитано: 454.57 (C26H30N8).
Синтез MB2Py(Ac). Суспензию 0.15 г 10% Pd/C в 30 мл ледяной уксусной кислоты насыщали водородом до прекращения его поглощения. Затем добавляли 2 мл уксусного ангидрида и 0.35 г (0.72 ммоль) вещества (XII). Реакционную массу перемешивали в токе водорода комнатной температуры в течение 5 ч. Полученный раствор отфильтровывали от катализатора. Маточный раствор упаривали при пониженном давлении, образовавшееся масло трижды переупаривали с 30 мл изо-пропилового спирта. Выход MB2Py(Ac) 0.37 г (92.4%) в виде желтых кристаллов. По данным ТСХ в системе i-PrOH-NH4OH (5:1) полученное вещество MB2Py(Ac) гомогенно, т. пл. 219°С. Масс-спектр: m/z: 496.15 [M]+, 454.13 [M-NHAc]+, ра^читано: 496.26
(C28H32N8O).
Общий метод синтеза DB2Py(n). К раствору а,ю-алкилдикарбоновой кислоты (0.1 ммоль) в 2 мл абс.
А 0.20 -
300 350 400 450 Длина волны, нм
500
400 500
Длина волны, нм
600
А 25 20 .15 .10 05 00
300
2.0
350 400 450 Длина волны, нм
500
400 500 600
Длина волны, нм
Рис. 3. Спектры поглощения и флуоресценции свободного DB2Py(n) и комплекса с ДНК. A - спектры поглощения DB2Py(4) в отсутствие (1) и в присутствии ДНК (2-8); [DB2Py(4)] 4.06 х 10-6 М; 0.001 М какодилат натрия. [ДНК] 1 - 0; 2 - 0.25; 3 - 0.49; 4 - 0.98; 5 - 1.48; 6 - 2.45; 7 - 14.67; 8 - 121.9 х 10-6 М п.н. соответственно; длина оптического пути 1 см. Б - спектры поглощения DB2Py(5) в отсутствие (1) и в присутствии ДНК (2-8); [DB2Py(5)] 4.29 х 10-6 М; 0.001 М какодилат натрия. [ДНК] 1 - 0; 2 - 0.25; 3 - 0.49; 4 - 0.98; 5 - 1.48; 6 - 2.45; 7 - 14.67; 8 - 121.9 х 10-6 М п.н. соответственно; длина оптического пути 1 см. В - спектры флуоресценции DB2Py(4) в отсутствие (1) и в присутствии ДНК (2-6). [DB2Py(4)] 4.6 х 10-6 M; [ДНК] 1 - 0; 2 - 3; 3 - 6; 4 - 18; 5 - 30; 6 - 54 M п.н. соответственно. Буфер: 10 мМ PBS (рН 7.4). Длина волны возбуждения 320 нм, ширина щели 5 нм, кювета 10 х 10 мм, 22°С. Г - спектры флуоресценции DB2Py(5) в отсутствие (1) и в присутствии ДНК (2-6). [DB2Py(5)] 2.3 х 10-6 M; [ДНК] 1 - 0; 2 - 3; 3 - 6; 4 - 18; 5 - 54; 6 - 78 х 10-6 M п.н. соответственно. Буфер: 10 мМ PBS (рН 7.4). Длина волны возбуждения 320 нм, ширина щели 5 нм, кювета 10 х 10 мм, 22°С
ДМФА прибавили HBTU (0.25 мМ), DIPEA (0.50 мМ) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. К полученному раствору добавляли 0.10 г (0.2 ммоль) MB2Py перемешивали в течение еще 1 ч и оставляли реакционную массу на ночь. Растворитель упаривали при пониженном давлении, получившееся масло затирали с абс. г-PrOH. В образовавшуюся суспензию добавляли 0.5 мл 35% HCl в диоксане, выпавший осадок отфильтровывали, промывали 3 раза 80% водным ацетоном и 2 раза абс. г-PrOH. Твердый остаток в виде зеленого порошка высушивали в вакууме над NaOH/P2O5. По данным ТСХ в системе MeOH-TFA-H2O (5:1:2) продукт реакции гомогенен.
DB2Py(4)-6HCL Выход 55 мг (48%), т. пл. >350°С. Масс-спектр, 1019.57 [M+H]+, рассчитано М 1018.55 (C58H66N16O2). !H-NMR (300 MHz, DMSO-d6): 5 0.85 (6H, t, J = 7.4, 2(-CH3)), 1.65 (4H, m, (-CH2-CH2-)), 1.75 (4H, q, J = 7.2, 2 (-CH2CH2CH3)), 2.31 (4H, m, 2(-COCH2-)), 2.77 (4H, s, pip), 3.23 (4H, s, pip), 3.35 (6H, s, 2(N-CH3)), 4.54 (4H, t, J = 7.0, 2(N-CH2-)), 7.05-6.84 (4H, m, ArH), 7.10 (2H, s, ArH), 7.36-7.24 (2H, brs, ArH), 7.48 (2H, d, J = 8.6, ArH), 7.58 (2H, m, ArH), 7.97 (2H, m, ArH), 8.26 (2H, d, J = 36.2, ArH), 9.93 (2H, s, 2(-NHCO-)).
DB2Py(5)-6HCl. Выход 61 мг (47%), т. пл. >350°С. Масс-спектр, m/z: 1033.42 [M+H]+, рассчитано М 1032.57 (C59H68N16O2). !H-NMR (300 MHz, DMSO-d6):
ДА 2000
Л
-6000 -
-8000
250
Г
300 350
Длина волны, нм
400
ДА 2000
0
-6000 -8000
"Г
250 300 350
Длина волны, нм
400
Рис. 4. А - спектры КД ХЖКД ДНК в отсутствие (1) и присутствии (2-9) DB2Py(4); 0.3 М №С1; 170 мг/мл ПЭГ-4000; 0.002 М №-фосфат, [ДНК] 4.545 х 10-5 М п.н.; ^^(4)] 1 - 0; 2 - 0.41; 3 - 0.82; 4 - 1.63; 5 - 3.25; 6 - 4.87; 7 - 6.48; 8 - 8.08; 9 - 10.07 х 10-6 М соответственно. Длина оптического пути 1 см. Б - спектры КД ХЖКД ДНК в отсутствие (1) и в присутствии (2-8) DB2Py(5); 0.3 М №С1; 170 мг/мл ПЭГ-4000; 0.002 М №-фосфат, [ДНК] 4.545 х 10-5 М п.н.; ^^(5)] 1 - 0; 2 - 0.43; 3 - 0.86; 4 - 1.72; 5 - 3.44; 6 - 5.15; 7 - 6.85; 8 - 8.54 х 10-6 М соответственно. Длина оптического пути 1 см
8 0.87 (6Н, ^ J = 7.4, 2(-СН3)), 1.34 (2Н, т, -СН2-), 1.63 (4Н, т, -СН2-СН2-СН2-), 1.77 (4Н, q, J = 7.2, 2(-СН2СН2СН3)), 2.30 (4Н, т, 2(-СОСН2-)), 2.87 (8Н, brs, pip), 3.35 (6Н, s, (-NCH3)), 4.55 (4Н, ^ J = 7.2, ^ СН2-), 7.05 (2Н, brs, АгН), 7.24 (2Н, т, АгН), 7.42-7.28 (4Н, т, АгН), 7.75 (4Н, dd, J = 20.0, 8.6, АгН), 8.04 (2Н, d, J = 8.7, АгН), 8.45 (2Н, Ь^, АгН), 9.93 (2Н, s, 2(^НСО-)).
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Спектры поглощения и флуоресценции DB2Py(n)
Измерения интенсивности и максимумов поглощения DB2Py(4) и DB2Py(5) в отсутствие и в присутствии ДНК в разных концентрациях и сопоставление полученных спектров позволяют косвенно подтвердить способность новых димерных узкобороздочных лигандов образовывать комплексы с ДНК (рис. 3А,Б). При увеличении концентрации ДНК происходит падение интенсивности поглощения, что свидетельствует об образовании комплекса новых бисбензимидазолпирролов с ДНК. При дальнейшем увеличении концентрации ДНК происходит изменение положения максимума поглощения, характеризующееся сдвигом в длинноволновую область спектра (батохромный сдвиг), а также увеличением амплитуды полосы поглощения. Все это свидетельствует об образовании нескольких типов комплексов с ДНК в зависимости от концентрации лиганда.
В спектрах флуоресценции соединений DB2Py(4) и DB2Py(5) в присутствии ДНК наблюдается раз-
горание интенсивности флуоресценции при увеличении концентрации ДНК (рис. 3В,Г). Это свидетельствует об образовании комплекса данных соединений с ДНК. Разгорание флуоресценции обуславливается стабилизацией сопряженной структуры лиганда в узкой бороздке ДНК.
Спектры кругового дихроизма DB2Py(4) и DB2Py(5) в комплексе с ХЖКД Д НК
Спектры кругового дихроизма DB2Py(n) в холе-стерической жидкокристаллической дисперсии (ХЖКД) ДНК позволяют подтвердить образование комплексов полученных соединений с ДНК и их локализацию в одной из бороздок ДНК.
Сходная картина спектров КД в ХЖКД наблюдается для соединений DB2Py(4) и DB2Py(5) (рис. 4) -в области поглощения лигандов (300-400 нм) присутствует положительная интенсивная полоса, что свидетельствует об образовании комплексов, локализованных в одной из бороздок ДНК [12, 13]. Методом рентгеноструктурного анализа исходного соединения Hoechst 33258 получены данные, подтверждающие его локализацию в узкой бороздке ДНК [9], поэтому мы полагаем, что наши соединения являются узкобороздочными лигандами.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
Цитотоксичность в отношении опухолевых клеток человека
Цитотоксическую активность соединений изучали МТТ-методом на шести клеточных лини-
0
А549 НСТ-116
Соединение 1С5П, мкМ SD SE И2 1С5П, мкМ SD SE И2
МВ2Ру(Ас) 68.35 1.3Е+11 6.5Е+10 0.6736 10.13 3.546 1.773 0.9263
ВЕ»2Ру(4) 8.163 62.48 31.24 0.8911 7.343 1.4048 0.7024 0.9366
ЕВ2Ру(5) 15.45 3.202 1.601 0.923 22.32 6.14 3.07 0.8363
Иринотекан 39.95 39.64 19.82 0.9488 21.44 102.08 51.04 0.8267
Рис. 5. Цитотоксич-ность ('С50) мономерного идимерных бисбензимидазол-пирролов в сравнении с иринотеканом на различных опухолевых клеточных линиях человека. SD - стандартное отклонение, SE - стандартная ошибка,
R2 - коэффициент детерминации
Huh7 РА№С-1
Соединение С, мкМ SD SE И2 С, мкМ SD SE И2
МВ2Ру(Ас) 2.697 0.10548 0.05274 0.9061 0.8199 0.15072 0.07536 0.9802
ВЕ22Ру(4) 1.133 0.09772 0.04886 0.8728 1.105 0.2964 0.1482 0.9421
ЕВ2Ру(5) 2.745 0.11036 0.05518 0.9329 3.704 0.8638 0.4319 0.9407
Иринотекан 16.65 0.11536 0.05768 0.7239 7.064 4.46 2.23 0.8915
SKBR3 SKOV3
Соединение 1С5П, мкМ SD SE И2 1С5П, мкМ SD SE И2
МВ2Ру(Ас) 2.22 9.002 4.50 0.8045 3.887 3.11 1.555 0.9313
Е^2Ру(4) 4.754 6 3 0.947 1.694 1.0884 0.5442 0.9706
ЕВ2Ру(5) 3.549 2.54 1.27 0.8604 3.991 2,836 1.418 0.8711
Иринотекан 9.259 12.298 6.149 0.8491 1.318 5.15 2.575 0.8844
Таблица 1. Цитотоксичность мономерного и димерных бисбензимидазолпирролов в сравнении с ириноте-каном на первичной культуре клеток глиобластомы человека Gbl13n
Соединение 1С50, мкМ
МВ2Ру(Ас) >100
DB2Py(4) 12.67 ± 2.33
DB2Py(5) 8.78 ± 6.64
Иринотекан 10.02 ±0.7
тотоксичности мономерных и димерных бисбензи-мидазолпироллов в отношении линий Huh7, PANC-1, SKBR3, SKOV3.
Существует мнение о необходимости тестировать новые лекарства не только на линейных, но и на первичных клеточных культурах. На первичной клеточной культуре глиобластомы человека СЫ13п цитотоксическая активность димеров DB2Py(4), DB2Py(5) приблизительно в 10 раз превысила активность мономера МВ2Ру(Ас) и была сопоставимой с иринотеканом (табл. 1).
ях и одной первичной культуре опухолей человека. Определена полуингибирующая концентрация (1С50) на клетках немелкоклеточного рака легкого А549, рака толстой кишки НСТ-116, гепатокарци-номы Huh7, карциномы поджелудочной железы PANC-1, рака молочной железы SKBR3, рака яичников SKOV3 и на полученной нами ранее первичной культуре глиобластомы человека СЫ13п [14, 15]. Данные представлены на рис. 5. Показано, что линии Huh7, PANC-1 и SKBR3 обладают большей чувствительностью к воздействию новых соединений, чем к противоопухолевому средству ириноте-кан. Цитотоксичность димерных молекул DB2Py(4) и DB2Py(5) в отношении клеточной линии А549 была значительно выше (в 5-7 раз), чем у мономерной МВ2Ру(Ас) и иринотекана (в 2.8-3.8 раза). Однако не выявлено существенных различий в ци-
Тестирование селективности в отношении опухолевых клеток
Возможную селективность новых соединений в отношении опухолевых клеток определяли по уровню их цитотоксичности на опухолевых и трансформированных клеточных линиях.
В качестве модели использовали клеточную линию MCF7 рака молочной железы и условно нормальную линию эпителиальных клеток молочной железы - MCF10A. Протестированные клеточные линии были чувствительны к токсическому действию новых бисбензимидазолпирролов. Наиболее восприимчивой оказалась опухолевая линия MCF7 (рис. 6). Таким образом, наблюдалась некоторая, приблизительно двукратная, селективность в цито-токсическом действии соединений на клетки опухолевого происхождения. Однако мономер МВ2Ру(Ас)
МВ2Ру(Ас)
MCF10A MCF7
DB2Py(4)
100 101 Концентрация, мкМ
Н 00
е л к ь
+1
я л
о р
т н о к
с о м е а в
I О
.0 О4 ой
MCF10A MCF7
100 101 Концентрация, мкМ
Соединение МСП0А МСГ7 Г-тест
1С мкМ 50' SD SE И2 1С мкМ 50' SD SE И2
МВ2Ру(Ас) 4.316 0.750099 0.5304 0.9225 1.793 0.228678 0.1617 0.9856 *р<0.0001
ВВ2Ру(4) 4.355 0.932363 0.5383 0.9432 2.506 0.77388 0.4468 0.9702 *р<0.0001
'Статистически значимые отличия.
Рис. 6. Сравнение цитотоксичности новых бисбензимидазолпирролов в отношении клеток MCF10A (эпителиальные клетки молочной железы человека, условно нормальная клеточная линия) и на MCF7 (рак молочной железы). SD - стандартное отклонение, SE - стандартная ошибка, R2 - коэффициент детерминации, F-тест - статистический критерий
и димер DB2Py(4) демонстрировали сходные значения IC50 для протестированных клеточных линий. Можно предположить, что удвоение молекулы не повлияло на уровень цитотоксичности в отношении исследуемой пары клеточных линий.
Влияние новых соединений на пролиферацию клеточной линии остеосаркомы
Влияние мономера MB2Py(Ac) и димера DB2Py(5) на пролиферацию культивируемых клеток остеосаркомы U2OS сравнивали в режиме реального времени с использованием прибора RTCA. После внесения веществ в концентрации 0.16-500 мкМ рост клеток фиксировался в течение 74 ч. В качестве контрольного соединения использовали пуромицин, который в концентрации 10 мг/мл (21 мМ) вызывал полную гибель клеток (рис. 7А). Более низкие дозы MB2Py(Ac) (0.16, 0.8 и 4 мкМ) не влияли на пролиферацию U2OS (рис. 7Б). При концентрации 20 мкМ наблюдалось замедление пролиферации, в то время как 100-500 мкМ полностью останавливали деление клеток. Показано, что DB2Py(5) ингибировал рост клеток остеосаркомы зависимым от концентрации и времени способом (рис. 7В). Таким образом, димер был очевидно токсичнее мономера.
Оценка возможности преодоления новыми соединениями множественной лекарственной устойчивости (МЛУ)
Важным свойством потенциального препарата является его способность преодолевать множественную лекарственную устойчивость клеток, опосредованную действием АВС-транспортера P-гликопротеина (P-gp). Новые мономерные и димерные бисбензимидазолпирролы тестировали МТТ-методом на им-мортализованной, эпителиальной клеточной линии HBL-100 [16, 17] и на сублинии HBL-100/D0X, полученной из нее путем длительной инкубации с док-сорубицином. Показано, что 95% клеток HBL-100/ DOX сверхэкспрессируют белок P-gp, отвечающий за установление резистентности клетки к лекарствам, в том числе обладают перекрестной устойчивостью к паклитакселу и винбластину. Таким образом, сублиния HBL-100/D0X обладает фенотипом МЛУ, т.е. резистентностью не только к доксорубици-ну, но и к другим субстратам P-gp [18].
Сходное цитотоксическое действие мономеров на линию HBL-100 и ее устойчивую сублинию показано экспериментально - различия в величине IC50 не превышали 2 раз.
Представленные в табл. 2 данные показывают, что изучаемые нами бисбензимидазолпирролы не являются субстратами P-gp. К димеру DB2Py(4) устойчивость клеток HBL-100/D0X была выше в 9
Время, ч
Ф Пуромицин 10 мг/мл • 500 мкМ 100 мкМ ф 20 мкМ Ф 4 мкМ 0.8 мкМ 0.16 мкМ ф Не обработанные клетки РМБО 0.5%
Рис. 7. Влияние бисбензимидазолов MB2Py(Ac) и DB2Py(5) на пролиферацию клеток остеосаркомы в режиме реального времени. Кривые роста представляют собой зависимость клеточного индекса от времени. А - контроль: красная линия - влияние пуромицина (10 мг/мл), синяя - рост клеточной линии U2OS без воздействия химических соединений, зеленая - влияние 0.5% DMSO, Б - воздействие на клетки мономера MB2Py, В - воздействие димера DB2Py(5)
раз по сравнению с НВ^-100. Тогда как устойчивость клеток, сверхэкспрессирующих Р^р, к таким классическим субстратам Р^р, как доксорубицин и паклитаксел, возрастала в 50-100 и более раз. Можно заключить, что соединение ЕВ2Ру(4) является слабым субстратом Р^р. Таким образом, только мономерные бисбензимидазолпирролы МВ2Ру и МВ2Ру(Ас) способны полностью преодолевать МЛУ, ассоциированную со сверхэкспрессией Р^р.
Таблица 2. Цитотоксичность новых бисбензимидазолпирролов на чувствительной линии HBL-100 и ее устойчивой сублинии HBL-100/D0x с фенотипом МЛУ
Соединение HBL-100 HBL-100/D0x Индекс устойчивости*
С ± SD, мкМ 50
Доксорубицин 0.6 ± 0.3 34 ± 6 57
МВ2Ру 58 ± 18 125 ± 21 2.1
МВ2Ру(Ас) 18 ± 11 29 ± 11 1.5
БВ2Ру(4) 4 ± 4.5 37 ± 11 8.9
'Индекс устойчивости - отношение значений /С50 в устойчивой сублинии HBL-100 к /С50 чувствительной линии HBL-100/D0x.
Проникновение в клетку
Способность новых соединений проникать в течение 2 суток в клеточное ядро, где они, связываясь с ге-терохроматином, светятся яркими синими точками, подтверждена методом флуоресцентной микроскопии (рис. 8).
Таким образом, синтезированные соединения являются новыми перспективными флуоресцентными красителями, способными проникать через клеточную и ядерную мембраны и эффективно окрашивать ядра клеток.
Анализ клеточного цикла после воздействия исследуемых соединений
Влияние новых веществ на клеточный цикл изучали с использованием двух контрольных лекарств -этопозида и иринотекана. Этопозид останавливал клеточный цикл в митозе, что видно по накоплению клеток в фазе С2/М и согласуется с данными
[19]. Через 48 ч после обработки клеток этопозидом клеточная популяция в фазе С2/М увеличивалась с 47 до 70%. Иринотекан блокировал клеточный цикл в S-фазе, что приводило к уменьшению распределения клеточных популяций в других фазах
[20]. Клетки под воздействием иринотекана через 24 ч накапливались в S-фазе и, как следствие, через 48 ч - в фазе С0/С1. Видимо, накопление в С0/С1 происходило за счет клеток, успевших поделиться и перейти из митоза в фазу С0/С1. Через 48 ч наблюдалось незначительное увеличение доли клеток, находящихся в раннем апоптозе (рис. 9).
Количественное определение клеток, присутствующих в различных фазах клеточного цикла, показало, что новые бисбензимидазолпирролы оказывают одинаковое действие на клеточный цикл, сходное с действием иринотекана. Через 24 ч происходит увеличение клеточной популяции в S-фазе клеточного цикла до 62-67% по сравнению с контролем.
Через 48 ч происходит перераспределение клеточных популяций в сторону увеличения клеток
А
Рис. 8. Флуоресцентное окрашивание клеток глио-бластомы Gbl13n, инкубированных с мономерным и димерным бисбензимида-золпирролом в концентрации 2 мкМ в течение 48 ч. А - популяция окрашенных клеток бисбензимидазол-пирролом DB2Py(5). Слева - DAPI-фильтр, справа - фазово-контраст-ное изображение. Окрашивание MB2Py(Ac) выглядит сходным образом через 2 суток. Б - фото окрашенных ядер, полученное с помощью конфокального микроскопа
МВ.Ру^о)
ОВРу(5)
Б
А
<5^
с
О
с
80 70 60 50 40 30
20
т X
]
1 1,
I
Контроль Этопозид Иринотекан МВ2Ру(Ас) ...^0^1 Б ^2/М SubG1
ОВ2Ру(4)
I
ОВ2Ру(5)
Рис. 9. Влияние бис-бензимидазолпирро-лов на клеточный цикл на примере клеточной линии НСТ-116. А - инкубация с веществами в течение 24 ч. Б - инкубация с веществами в течение 48 ч
24 ч Контроль Этопозид Иринотекан МВ2Ру(Ас) DB2Py(4) DB2Py(5)
G0/G1 28.0 ± 1.6 12.4 ± 2.7 26.4 ± 3.7 29.8 ± 1.8 29.5 ± 0.8 32.2 ± 1.2
S 53.9 ± 3.4 42.9± 3.8 61.8 ± 3.5 62.9 ± 1.4 63.7 ± 3.2 61.2 ± 0.9
G2/M 18.1 ± 2.3 44.7 ± 6.2 11.8 ± 1.3 7.3 ± 1.7 6.8 ± 2.5 6.6 ± 1.6
SubG1 2.0 ± 0.8 4.3 ± 0.8 2.4 ± 0.8 2.5 ± 0.2 2.6 ± 0.8 2.6 ± 0.3
<5^
л
>
п о
С
80 70 60 50
40 30 20 10
Т1
I й__! 1
Контроль Этопозид Иринотекан МВ2Ру(Ас) пG0/G1пS и G2/M SubG1
"Г 1 т I 1 -г
||Г| 1 1 Ц|_1 I. 1
йВ2Ру(4) йВ2Ру(5)
Б
0
48 ч Контроль Этопозид Иринотекан МВ2Ру(Ас) DB2Py(4) DB2Py(5)
G0/G1 42.1 ± 6.2 19.7 ± 1.2 41.5 ± 0.9 48.8 ± 0.4 48.5 ± 1.7 50.6 ± 0.9
S 44.0 ± 3.2 9 ± 1 44.8 ± 0.8 41.9 ± 1.3 43.9 ± 3.1 40.0 ± 1.1
G2/M 13.9 ±3.2 71.3 ± 0.7 13.8 ± 1.7 9.3 ± 1.4 7.6 ± 1.6 9.4 ± 0.6
SubG1 2.1 ± 0.4 5.4 ± 0.9 6.9 ± 0.6 4.1 ± 0.4 2.2 ± 0.5 3.8 ± 0.5
А
Релаксированная ДНК
Топоизомеры
Суперскрученная ДНК
Б
Релаксированная ДНК
Топоизомеры
Суперскрученная ДНК
Топо-I 2.5 5 2.5 5 мкМ MB2Py(Ac) DB2Py(4)
Топо-I
0.65 1.25 MB2Py(Ac)
0.65 1.25 DB2Py(4)
мкМ
Рис. 10. Ингибирование Топо-1 из тимуса теленка мономером MB2Py(Ac) и его димером DB2Py(4). А - влияние веществ на активность Топо-1 в концентрации 2.5 и 5 мкМ, Б - в концентрации 0.65 и 1.25 мкМ
в фазе G0/G1. Таким образом, новые бисбензимида-золпирролы воздействуют на фазу синтеза (S) клеточного цикла.
DB2 Py(4) почти не индуцировал апоптоз. Остальные вещества индуцировали ранний апоптоз, но значения превышали контрольные всего в 2-3 раза.
Топоизомераза I - возможная мишень новых производных Hoechst 33258
Некоторые типы опухолей, такие, как рак молочной железы, рак яичников, рак прямой кишки, характеризуются повышенной активностью Топо-I, фермента, который играет ключевую роль в функционировании клетки, регулируя структуру ДНК в процессах транскрипции, репликации, рекомбинации и репарации. Топо-I может релаксировать (раскручивать) суперскрученные молекулы ДНК путем образования одноцепочечных разрывов с их последующим лигированием для релаксации сверхвитков. В настоящее время Топо-I является признанной мишенью при таргетной терапии опухолей [21-23].
Узкобороздочные лиганды, не связываясь ко-валентно с ДНК, не изменяя существенно ее кон-формацию, способны конкурировать с Топо-I за связывание по АТ-парам оснований. Эффект ин-гибирования Топо-I выявляли по способности исследуемых соединений задерживать реакцию релаксации ДНК in vitro.
Установлено, что исследуемые соединения (рис. 10) обладают Топо-ингибирующей активностью. При концентрации мономера и димера 5 и 2.5 мкМ, соответственно, наблюдалось сохранение су-перскрученной ДНК в реакции релаксации ДНК Топо-I (TopoGen) (рис. 10А). Наиболее эффективно каталитическую активность Топо-I ингибиро-вал димер DB2Py(4). В сравнении с MB2Py(Ac) уже при концентрации 0.65 мкМ DB2Py(4) фиксировалось сохранение ДНК (рис. 10Б).
ОБСУЖДЕНИЕ
Бензимидазол является фундаментальным фарма-кофором при создании лекарств из-за его широкого спектра биологической активности [24-27]. При моделировании новых флуоресцентных бисбензими-дазольных молекул мы предполагали, что введение в состав ранее полученных серий DB(n), DBA(n) АТ-специфичного пирролкарбоксамидного фрагмента, имеющего сродство к АТ-парам ДНК, позволит усилить их цитотоксичность. Два бисбензимидазоль-ных блока в составе новой молекулы несли флуоресцентные свойства и взаимодействовали с ДНК. Использование гибкого линкера в димерных соединениях DB2Py(n) позволит молекуле связываться с двумя АТ-богатыми сайтами, находящимися на разных расстояниях друг от друга. Полученные новые бисбензимидазолпирролы в комплексе с ДНК имеют планарную форму, изогеометричную узкой бороздке ДНК, что благоприятствует лучшему взаимодействию новых лигандов с ДНК.
С использованием спектров поглощения, флуоресценции и кругового дихроизма мы показали способность бисбензимидазолпирролов взаимодействовать с ДНК. Так как в основе новых соединений лежит молекула Hoechst 33258, известная своей локализацией в узкой бороздке ДНК, мы относим наши новые бисбензимидазолы к узкобороздоч-ным лигандам [28, 29]. Наличие в молекуле лиган-да двух бисбензимидазольных фрагментов ведет к значительному увеличению его аффинности к по-линуклеотиду, что дает экспериментальную основу для целенаправленного синтеза нового класса потенциальных противоопухолевых препаратов на основе димерных бисбензимидазолов.
Показана способность новых флуоресцентных соединений влиять на S-фазу клеточного цикла, проникать в ядро клетки, а также в низких концентрациях ингибировать Топо-I в бесклеточной модели. Новая серия бисбензимидазолпирролов оказалась более токсичной, чем ранее полученные серии
DB(n), DBA(n), в отношении опухолевых линий клеток человека и менее токсичной для клеточной линии неопухолевой природы. Небольшие, в 2 раза, но статистически значимые различия в цитоток-сичности мономера и димера продемонстрированы на паре линий клеток молочной железы человека -опухолевого и не опухолевого происхождения.
Ранее в нашей работе была показана способность бисбензимидазолпирролов индуцировать Bcl-xl-опосредованный апоптоз [30]. Известно, что не-тропсин влияет на активность эукариотических транскрипционных факторов [31, 32]. Мы полагаем, что наши новые соединения, содержащие в своей структуре фрагмент нетропсина, имеют сходный механизм действия. Эти предположения подтверждаются данными о связывании с ДНК и остановке клеточного цикла в фазе синтеза при нетоксичной концентрации бисбензимидазолпирролов.
Димеризация молекулы усиливает аффинность к ДНК, повышает Топо-1-ингибирующие свойства in vitro. Однако определение методом МТТ цито-токсичности новых соединений на линиях опухолевых клеток не выявило очевидного преимущества димерной молекулы, несмотря на способность проникать в ядро клетки. Тем не менее высокочувствительный тест на пролиферацию в режиме реального времени подтвердил усиление токсических свойств при димеризации бисбензимидазолпиррола.
Важными характеристиками новых соединений как потенциальных противоопухолевых средств являются селективность и преодоление МЛУ Одной из основных причин слабой эффективности современной химиотерапии является селекция опухолевых клеток с фенотипом МЛУ, способных выжи-
вать при длительном применении лекарственных средств. Наиболее известный механизм МЛУ характеризуется сверхэкспрессией белка Р^р, входящего в семейство ABC-транспортеров. Предварительное определение цитотоксичности бисбензимида-золпирролов на клеточной модели с фенотипом МЛУ показало, что димеризация молекулы приводит, по-видимому, к взаимодействию с белком Р^р и, как следствие, к росту устойчивости линии HBL-100/D0x к этому соединению (в среднем в 9 раз) по сравнению с доксорубицином (50-100 и более раз). Интерес представляет возможность непосредственного взаимодействия новых молекул с Р^р-транспортером.
Возможно, недооцененное преимущество димер-ных соединений в биологической активности связано с их большей склонностью к образованию агрегатов по сравнению с мономерными молекулами. Решение проблемы агрегации димерных молекул может привести к получению значительно более активных соединений.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Синтезированные новые цитотоксичные димерные бисбензимидазолпирролы DB2Py(n) представляются перспективными для дальнейшего глубокого изучения их свойств и механизма действия в отношении опухолевых клеток человека, а также для дизайна новых молекул. •
Данная работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 23-25-00373.
Авторы выражают благодарность А. Зайцеву за помощь в оформлении рукописи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Venugopal S., Kaur B., Verma A., Wadhwa P., Magan M., Hudda S., Kakoty V. // Chem. Biol. Drug Design. 2023. V. 102. P. 357-376.
2. Wu K., Peng X., Chen M., Li Y., Tang G., Peng J., Peng Y., Cao X. // Chem. Biol. Drug Design. 2022. V. 99. № 5. P. 736-757.
3. Tyagi Y.K., Jali G., Singh R. // Anticancer Agents Med. Chem. 2022. V. 22. № 19. P. 3280-3290.
4. Brishty S.R., Hossain M.J., Khandaker M.U., Faruque M.R.I., Osman H., Rahman S.M.A. // Front. Pharmacol. 2021. V. 12. P. 762807.
5. Ivanov A.A., Salyanov V.I., Strel'tsov S.A., Cherepanova N.A., Gromova E.S., Zhuze A.L. // Rus. J. Bioorg. Chem. 2011. V. 37. № 4. P. 530-541.
6. Koval V.S., Ivanov A.A., Salyanov V.I., Stomakhin A.A., Oleinikov V.A., Zhuze A.L. // Rus. J. Bioorg. Chem. 2017. V. 43. № 2. P. 167-173.
7. Koval V.S., Arutyunyan A.F., Salyanov V.L., Klimova R.R., Kushch A.A., Rybalkina E.Yu., Susova O.Yu., Zhuze A.L. // Bioorg. Med. Chem. 2018. V. 26. № 9. P. 2302-2309.
8. Koval V.S., Arutyunyan A.F., Salyanov V.I., Kostyukov A.A., Melkina O.E., Zavilgelsky G.B., Klimova R.R., Kushch A.A., Korolev S.P., Agapkina Y.Yu., et al // Bioorg. Med. Chem. 2020. V. 28. P. 115378.
9. Teng M.K., Usman N., Frederick C.A., Wang A.H. // Nucl. Acids Res. 1988. V. 16. P. 2671-2690.
10. Finlay A.C., Hochstein F.A., Sobin B.A., Murphy F.X. // J. Am. Chem. Soc. 1951. V. 73. № 1. P. 341-343.
11. Lisitsina E.S., Durandin N.A., Ivanov A.A., Strel'tsov S.A., Susova O.Yu., Shtil A.A., Zhuze A.L., Kuz'min V.A. // Mol. Biol. (Moskow). 2012. V. 46. P. 922-927.
12. Yevdokimov Yu.M., Skuridin S.G., Lortkipanidze G.B. // Liquid Crystals. 1992. V. 12. № 1. P. 1-16.
13. Gromyko A.V., Salyanov V.I., Strel'tsov S.A., Oleinikov V.A., Korolev S.P., Gottikh M.B., Zhuze A.L. // Rus. J. Bioorg. Chem. 2007. V. 33. № 6. P. 613-623.
14. Susova O., Poletaeva A., Lupatov A., Kholodenko I., Karamysheva A., Mitrofanov A.A., Naskhletashvili D., Nasedkina T., Bekyashev A. // Ann. Oncol. 2021. № 32. P. 519.
15. Ammour Y., Susova O., Krasnov G., Nikolaeva E., Varachev
V., Schetinina Y., Gavrilova M., Mitrofanov A., Poletaeva A., Bekyashev A., et al // Viruses. 2022. V. 14. № 11. P. 2433.
16. Gaffney E.V. // Cell Tissue Res. 1982. V. 227. P. 563-568.
17. Saint-Ruf C., Nardeux P., Estrade S., Brouty-Boye D., Lavialle C., Rhim J.S., Cassingena R. // Exp. Cell Res. 1988. V. 176. P. 60-67.
18. Rybalkina E.Y., Moiseeva N.I., Karamysheva A.F., Eroshenko D.V., Konysheva A.V., Nazarov A.V., Grishko V.V. // Chem. Biol. Interact. 2021. V. 1. № 348. P. 109645.
19. Chen H., Shan J., Chen D., Wang R., Qi W., Wang H., Ke Y., Liu W., Zeng X. // J. Cell. Physiol. 2018. V. 234. P. 1187111881.
20. Khader E.I., Ismail W.W., Mhaidat N.M., Alqudah M.A. // Int. J. Hlth Sci. (Quassim). 2021. V. 15. P. 34-41.
21. Pommier Y. // Nat. Rev. Cancer. 2006. V. 6. № 10. P. 789802.
22. Li T.-K. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001. V. 41. P. 53-77.
23. Pommier Y. // ACS Chem. Biol. 2013. V. 8. № 1. P. 82-95.
24. Verma S., Ravichandiran V., Ranjan N., Flora S.J.S. // Med. Chem. 2020. V. 16. № 4. P. 454-486.
25. Akhtar W., Khan M.F., Verma G., Shaquiquzzaman M.,
Rizvi M.A., Mehdi S.H., Akhter M., Alam M.M. // Eur. J. Med. Chem. 2017. V. 27. № 126. P. 705-753.
26. Shrivastava N., Naim M.J., Alam M.J., Nawaz F., Ahmed S., Alam O. // Arch. Pharm. Chem. Life Sci. 2017. V. 350. P.e 1700040.
27. Gao C., Li B., Zhang B., Sun Q., Li L., Li X., Chen C., Tan C., Liu H., Jiang Y. // Bioorg. Med. Chem. 2015. V. 23. № 8. P. 1800-1807.
28. Evdokimov Yu.M., Skuridin S.G., Lortkipanidze G.B. // Liquid Crystals. 1992. V. 12. № 1. P. 1-16.
29. Pjura P.E., Grzeskowiak K., Dickerson R.E. // J. Mol. Biol. 1987. V. 20. № 197. P. 257-271.
30. Ianevski A., Kulesskiy E., Krpina K., Lou G., Aman Y., Bugai A., Aasumets K., Akimov Y., Bulanova D., Gildemann K., et al. // Cancers (Basel). 2020. V. 12. P. 1694.
31. Belikov S.V., Grokhovsky S.L., Isaguliants M.G., Surovaya A.N., Gursky G.V. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2005. V. 23. № 2. P. 193-202.
32. Dickinson L.A., Gulizia R.J., Trauger J.W., Baird E.E., Mosier D.E., Gottesfeld J.M., Dervan P.B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. № 22. P. 12890-12895.
