Дифференцированное определение каротиноидов современными методами Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

664.002.611:543.5

ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРОТИНОИДОВ СОВРЕМЕННЫМИ МЕТОДАМИ

Л. я. РОДИОНОВА, А. А. ФЕЛЬДМАН, Э. А. ШАФТАН

Краснодарский филиал Всесоюзного научно-исследовательского института потребительской кооперации Одесский технологический институт пищевой промышленности Всесоюзный научно-исследовательский институт табака и табачных изделий

Среди биологически активных компонентов плодов тыквы наибольшую роль играют каротиноиды. Для определения их качественного состава необходима разработка современных методов анализа. Исследования проведены по следующему плану: 1) извлечение суммы каротиноидов, 2) разделение на отдельные компоненты, 3) идентификация индивидуальных каротиноидов.

Применяли метод тонкослойной и колоночной хроматографии. Тонкослойная хроматография выполнялась на пластинах Силуфол фирмы «КАУ», на алюминиевой основе с крахмалом в качестве связующего вещества. Пластины Силуфол активировали в сушильном шкафу при 100—105° С в течение 80 мин и затем использовали для анализа.

Извлекали сумму каротиноидов из мякоти тыквы с помощью ацетона, который принадлежит к слабо полярным растворителям и при комнатной температуре легко извлекает из растительного материала все пластидные пигменты.

Навеску подготовленной средней пробы 1—2 г растирали в фарфоровой ступке с небольшим количеством промытого и прокаленного песка или измельченного стекла в присутствии безводного сернокислого натрия (для обезвоживания) и углекислого кальция (для стабилизации каротинов) и экстрагировали очищенным и перегнанным ацетоном, после чего фильтровали через стеклянный фильтр. Экстрагирование и фильтрование повторяли до тех пор, пока последние порции экстракта не стали бесцветными. Ацетоновый экстракт сушили обезвоженным сульфатом натрия, затем отфильтровывали и концентрировали в токе углекислого газа до объема 3 мл. Сконцентрированную пробу каротиноидов полностью наносили на подготовленную пластину Силуфол для разделения.

Анализ литературных данных по тонкослойной хроматографии показал, что отдельные углеводороды обладают различной подвижностью при использовании ряда систем растворителей. Нами применялись растворители: петролейный эфир:бензол:ледя-ная уксусная кислота:ацетон (40:10:2,5:2,5); гек-сан:серный эфир (30:70); хлороформ:ацетон (9:1); гексан:серный эфир (8:2).

Основные опыты по разделению компонентов каротиноидов проводили в первой и второй системе растворителей.

Для элюации каротиноидов с хроматограммы использовали растворители: хлороформ, петролейный эфир, гексан, метанол, этанол, бензин, бензол.

После разгонки пробы в определенной системе описывали хроматограмму, замеряли Щ полос, затем полученные- полоски соскабливали и элюировали подходящими растворителями, после чего снимали спектры на приборе Спекорд 40М. Все операции после разгонки пробы проводились по возможности с наименьшими затратами времени.

При наличии в пробе а-каротина он шел с фронтом растворителя и занимал верхнее положение, затем располагался Р-каротин, еще ниже у-каротин.

Остальные каротиноидные пигменты находилис ниже изомеров каротина.

Основным показателем для идентификации кар( тиноидов являются спектры поглощения их раствс ров в органических растворителях. Почти все каре тиноиды имеют три максимума поглощения в вр димой области спектра. Положение этих макм мумов определяется количеством двойных связе! Каждая новая двойная связь в системе сопряжег ных связей смещает максимум поглощения в стс рону больших длин волн 20—22 нм (2; 22; 161; 183]

Каротиноиды, имеющие эпоксигруппы, проявлял смесью: соляная кислота:метанол:эфир (1:9:1) (он дают голубые пятна). Спектральные данные и хре матографические характеристики обрабатывали п} тем сопоставления с литературными данными (7?1 спектральная характеристика), в результате чег проводили идентификацию [2, 4].

Полное разделение изомеров каротина тонкс слойной хроматографии подтверждено колоночно хроматографией [4]. Колонки заполняли воздушнс сухой гидроокисью кальция или окисью алюминю Окись алюминия в течение 2 ч прокаливали пр 200° С, а затем охлаждали при непрерывном поме шивании в течение 15—30 мин. Полученной окисы алюминия заполняли колонку диаметром 15 мм, вь сотой 10—15 см.

Бензольный элюат каротина, снятый с пласти Силуфол с определенным Щ, в количестве 2—3 м наносили на поверхность колонки и проявлял легким бензином до совершенно четкого разделени зон. Колонку подсушивали, выталкивали столби абсорбента, разрезали по границам проявившихс полос. Элюацию с окиси алюминия или гидроокис кальция проводили бензином и хлороформои Элюаты подвергали спектрофотометрированию н приборе Спекорд 40М. Полученные данные подтвер дили полное разделение изомеров каротина пр тонкослойной хроматографии.

Для количественного определения нужный каро тиноидный пигмент элюировали с пластины ТС) петролейным эфиром и снимали экстинцию на спект рофотометре, определяя количество по калибро вочной кривой, построенной на этом же прибор^ по (3-каротину (обладающему наибольшей А-вита

Таблица

Номер Предварительная

поло- Цвет полосы идентификация

сы

1 Желтый 0,11 виолоксантин

2 Желто-коричневый 0,27 флавоксантин

3 Бледно-желтый 0,37 не идентифицирован

4 Лимонно-желтый 0,56 лютеоксантин

5 Ярко-желтый 0,66 полиол

6 -»- 0,78 (3-каротин-моноэпокись

7 Яркий лимонно- 0,96 а-каротин-5,6 моно-

желтый эпокись

8 Ярко-оранжевый 0,99 а-каротин

Рис. 1

Рис. 2

Рис. 3

Таблица 2

Номер пятна Максимум поглощения X, нм, в растворителях Идентификация

хлороформе этаноле бензине

опыт литера- турные данные опыт литера- турные данные опыт литера- турные данные

1 480,0 482,0 472,0 471,0 виолоксантин

452,0 451,5 443,0 442,5 — —

425,0 424,0 420,0 417,5 — —

2 450,0 450,0 — — — ■ — флавоксантин

427,0 430,0 — — — —

417,0 417,0 — — — —

3 458,0 — — — — -- не идентифицирован

431,0 — — — — —

409,0 — — — — —

4 458,0 460,0 448,0 449,0 — — ■ лютеоксантин

432,0 433,0 424,0 425,0

409,0 409,0 406,0 406,0 — —

5 457,0 457,0 447,0 447,0 — — полиол (многоатомный спирт)

430,0 430,0 421,0 422,0

6 1 т ?84,0 — — — 478,0 478,0 Р-каротин моноэпокись, гидро-

456,0 — — — 446,0 447,0 ксикаротин

7 482,0 483,0 — — 470,0 471,0 а-каротин-5, 6 моноэпокись

454,0 454,0 — — 441,0 442,0

8 486,0 485,0 — — 477,0 478,0 а-каротин

455,0 454,0 — — 448,0 447,5

минной активностью). Например, при исследовании тыквы сорта Мраморная вида С. maxima D. смесь пигментов разделялась при хроматографировании на 8 полос.

После разделения и спектрофотометрирования -получены спектрограммы каротиноидов этого сорта тыквы. На рис. 1 приведена схема хроматограммы на~ пластине Силуфол тыквы сорта Мраморная. В табл. 1 дана характеристика /^/-полученных полос и их цвет.

На рис. 2, 3 приведены спектрограммы кароти-ноидных пигментов: 1 — виолоксантин, 2 — флаво-ксантин, 4 — лютеоксантин, 5 — полиол (многоатомный спирт), 6—p-каротин-моноэпокись, гидрокси-каротин, 7 — а-каротин-5, 6 моноэпокись, 8 — а-каротин, разделенных с помощью ТСХ (элюат хлороформ), а в табл. 2 — максимумы поглощения в различных растворителях и идентификация этих пигментов.

Сумма каротиноидных пигментов тыквы сорта Мраморная в количественном определении составляла 24-10“3%. Разделение с помощью ТСХ и количественное определение отдельных пигментов показало, что содержание а-каротина— 18-10 3%, а-каротина-5, 6 моноэпокись—1,2-10_3%, {3-каро-

тина моноэпокись — 2,4-10“3%. Остальные кароти-ноидные пигменты, идентифицированные в тыкве сорта Мраморная, составляли 10% от общей суммы.

ВЫВОД

Модифицированная нами методика позволяет определить качественный и количественный состав каротиноидных пигментов в свежем растительном сырье с высокой степенью точности и минимальными временными затратами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Снегирева И. А., Жванко Ю. Н., Родина Т. Г. Современные методы исследования качества пищевых продуктов,—М.: Экономика, 1976,—220 с.

2. С а в и н о в Б. Г. Спектрофотометрические исследования в ряду каротиновых красящих веществ//Укр. хим. ж.—1955.— С. 136—143.

3. Ш л а к А. А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев/Биохимические методы в физиологии растений.— М.: Наука, 19711?т-128 с.

4. Бах а но в а Н. В., Маслова Т. Г. и др. Пигменты пластид зеленых растений и методика их исследования,—М.— 1: Наука, 1964.— 120 с.

Кафедра биохимии и микробиологии

Поступила 16.12.89