CC BY
205
https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-504-515 | (сс) ]
I
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПОДГРУПП А И А АНТИГЕНА А СИСТЕМЫ АВ0: БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОСНОВА И СЕРО ЛОГИЧЕСКАЯ СТРАТЕГИЯ
Головкина Л. Л., Каландаров Р. С., Стремоухова А. Г., Калмыкова О. С., Пушкина Т. Д., Сурин В. Л., Пшеничникова О. С., Николаева Т. Л., Оловникова Н. И.*
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 125167 Москва, Россия
Лаборатория трансфузиологической иммуногематологии Лаборатория безопасности гемотрансфузий Лаборатория генной инженерии Лаборатория физиологии кроветворения
BY 4.0
Введение. Определение слабых вариантов антигена А и их дифференциация необходимы для правильного подбора эритроцитсодержащих сред при гемотрансфузиях. Для этого в сочетании с реактивами анти-А, которые одинаково реагируют с антигенами А] и А2 применяются селективные реактивы анти-А], реагирующие только с антигеном А]. Поскольку внутри самих подгрупп наблюдается вариабельность экспрессии антигена А, а установленного стандарта для реагентов и методик не существует, трактовка полученных результатов зачастую вызывает затруднения. Цель: создать стратегию определения вариантов антигена А с применением доступных реагентов в реакции агглютинации.
Методы. Сравнение эффективности четырех анти-А]- и двух анти-Н-реагентов проведено на 23 образцах крови с группой А2 и А2В и контрольных образцах А] и А]В. Использовались два типа анти-А]-реагентов: лектин Doly-chos biflorus и моноклональные антитела. Все реагенты предназначались для реакции прямой агглютинации. Принадлежность эритроцитов к подгруппе А2 была подтверждена генетическим анализом.
Результаты. Показано, что анти-А]-реагенты не взаимодействовали с эритроцитами А2В, но часто реагировали с эритроцитами А2. Сила реакции с эритроцитами А2 сильно варьировала и была слабее, чем с А]-эритроцитами, однако вызывала затруднения в установлении подгруппы. Одновременное тестирование с реагентом анти-Н позволяло сделать однозначный вывод о принадлежности крови к подгруппе: сильная реакция указывала на А2, отрицательная или слабая — на А]. У двух доноров было отмечено расхождение результатов серологических и молекулярных методов исследования: серологически была определена подгруппа А3, генотипирование выявило аллель АВ0*Ау В обоих случаях прямое секвенирование показало комбинацию мутантных аллелей, которая дает фенотип А3. При использовании коммерческих наборов для генотипирования методом полимеразной цепной реакции следует учитывать, что праймеры подобраны к наиболее часто встречающимся вариантам и не могут выявить все мутации гена АВ0.
Заключение. Надежная диагностика подгруппы А2 серологическими методами возможна с использованием лектина или моноклональных антител анти-А] в сочетании с анти-H моноклональным реагентом.
Ключевые слова: антиген А, подгруппы А1 и А2, лектин анти-А1, моноклональные антитела анти-А1, моноклональные антитела анти-Н Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование: исследование не имело спонсорской поддержки.
Для цитирования: Головкина Л.Л., Каландаров Р.С., Стремоухова А.Г., Калмыкова О.С., Пушкина Т.Д., Сурин В.Л., Пшеничникова О.С., Николаева Т.Л., Оловникова Н.И. Дифференциация подгрупп А1 и А2 антигена А системы АВ0: биологическая основа и серологическая стратегия. Гематология и трансфузиология. 2019; 64(4): 504-515. https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-504-515
DIFFERENTIATION OF THE A AND A2 SUBGROUPS OF THE AB0 SYSTEM: BIOLOGICAL BACKGROUND AND SEROLOGICAL STRATEGY
Golovkina L. L., Kalandarov R. S., Stremoukhova A. G., Kalmykova O. S., Pushkina T. D., Surin V. L., Pshenichnikova O. S., Nikolaeva T. L., Olovnikova N. I*
National Research Center for Hematology, 125167, Moscow, Russian Federation
Laboratory for Transfusion Immunohematology
Laboratory for Blood Transfusion Safety
Laboratory for Genetic Engineering
Laboratory for Physiology of Hematopoiesis
Introduction. The identification of weak variants of the A antigen, as well as their differentiation, is necessary for the proper selection of erythrocyte-containing media for blood transfusions. To this end, selective anti-A] reagents that react only with the A] antigen are used in combination with anti-A reagents reacting equally with the A] and A2 antigens. Given that the expression of the A antigen varies within the subgroups and there is no established standard for reagents and procedures, the interpretation of the obtained results presents difficulties.
Aim. To develop a strategy for identifying the variants of the A antigen using available reagents in an agglutination reaction. Methods. We compared the effectiveness of four anti-A] and two anti-H reagents using 23 blood samples (groups A2 and A2B) and control samples (groups A] and A]B). Two types of anti-A] reagents were employed: Dolychos biflorus lectin and monoclonal antibodies. All of the reagents were designed for direct agglutination reactions. Belonging of the erythrocytes to the A2 subgroup was confirmed using genetic analysis.
Results. It is shown that anti-A] reagents did not interact with A2B red blood cells and often reacted with A2 red blood cells. The strength of the reaction with A2 red blood cells varied greatly and was weaker than with A] red blood cells; however, it hindered the subgroup identification. Simultaneous tests conducted using an anti-H reagent allowed the authors to draw an unambiguous conclusion about blood belonging to a subgroup: a strong reaction indicated the A2 subgroup, whereas a negative or weak reaction indicated the A] subgroup. A discrepancy was noted between the results obtained for two donors using serological and molecular methods: the A3 subgroup was identified serologically, whereas genotyping revealed the AB0*A] allele. In both cases, direct sequencing showed a combination of mutant alleles giving the A3 phenotype. When using commercial kits to perform genotyping analysis through a polymerase chain reaction, it should be taken into consideration that primers are matched to the most common variants and cannot detect all mutations of the AB0 gene. Conclusion. Reliable identification of the A2 subgroup through serological methods is possible when using lectin or monoclonal anti-A] antibodies in combination with a monoclonal anti-H reagent.
Keywords: A antigen, A! and A2 subgroups, anti-A! lectin, monoclonal anti-A! antibodies, monoclonal anti-H antibodies Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest. Financial disclosure: the study had no sponsorship.
For citation: Golovkina L.L., Kalandarov R.S., Stremoukhova A.G., Kalmykova O.S., Pushkina T.D., Surin V.L., Pshenichnikova O.S., Nikolaeva T.L., Olovnikova N.I. Differentiation of the A and A2 subgroups of the AB0 system: Biological background and serological strategy. Russian Journal of Hematology and Transfusiology (Gematologiya i transfuziologiya). 2019; 64(4):504-515 (in Russian). https://doi.org/10.35754/0234-5730-2019-64-4-504-515
Введение
Современная концепция безопасности предполагает, что лицам со слабыми вариантами антигена А (А2, А3 и др.), нуждающимся в частых трансфузиях эритро-цитсодержащих компонентов, следует переливать донорские эритроциты, не содержащие антиген А1 Подобный подход обусловлен тем, что при трансфузии эритроцитов А больным с антигеном А или другими слабыми вариантами возможно образование аллоиммунных анти-А -антител, а если такие антитела уже присутствуют, то существует риск развития посттрансфузионных реакций и осложнений [1—3]. У лиц с ослабленной экспрессией антигена А в крови могут присутствовать природные анти-А -антитела (экстраагглютинины). Анти-А-экстраагглютинины имеют 1—2 % лиц с подгруппой Аи 25 % лиц с подгруппой А2В [4]. Иногда анти-А можно обнаружить в сыворотке лиц с другими слабыми подгруппами антигена А. Экстраагглютинины анти-А могут вызывать расхождения в результатах АВ0 тестирования и пробы на индивидуальную совместимость. Реципиентам с иррегулярными анти-А^антителами рекомендуется переливать эритроциты, не несущие антиген А [5]. На практике это правило часто распространяют на всех реципиентов с подгруппой А , особенно нуждающихся в частых трансфузиях эритроцитсо-держащих компонентов. Экстраагглютинины анти-А имеют, как правило, низкие титр и авидность, поэтому их не всегда можно обнаружить при исследовании сыворотки со стандартными эритроцитами в процессе перекрестного АВ0-тестирования. В связи с этим проблема своевременного выявления больных со слабыми вариантами антигена А остается актуальной.
Антиген А характеризуется высоким полиморфизмом, т.е. представлен различными вариантами (подгруппами), которые кодируются разными аллелями гена АВ0*А. Генетические основы системы АВ0, а также молекулярно-генетические события, приводящие к формированию разнообразных аллельных вариантов гена АВ0*А, подробно освещены в обзорах [6—10]. Две основные подгруппы антигена А — это А и А2. Частота встречаемости подгрупп А1 и А2 различна в разных популяциях. У лиц европеоидной расы среди групп А и АВ около 80—88 % принадлежат к А или А В, а остальные 12—20 % — к А2 или А2В [11, 12]. Частота встречаемости антигена Асреди лиц группы А составляет 14,7—17,8 %; частота фенотипа А В среди лиц группы АВ составляет 23,5—26,2 % [13]. Выраженный дисбаланс существует и в других популяциях [14]. Одной из причин такого дисбаланса может быть разное фенотипическое проявление аллеля А(К101) в группах А и АВ: гетерозиготный генотип A(R101)/0 экспрессируется как А-фенотип, а гетерозиготный генотип A(R101)/В — как А2В-фенотип, что приводит к возрастанию частоты А2В по сравнению
с Аа [15].
Важнейшим различием между А и А фенотипами является существенная разница в количестве экспрессиру-емых на эритроците эпитопов антигена А. На эритроцитах А их около 106, что примерно в четыре раза больше, чем на эритроцитах А2 [16]. Подгруппы слабее А2 (A3, Ax, Am, Ael) встречаются редко и характеризуются дальнейшим уменьшением числа сайтов антигена А на эритроцитах. Подгруппы часто обнаруживают либо по очень слабой агглютинации, либо по расхождению между результатами прямого и обратного тестирования эритроцитов при перекрестном определении группы АВ0.
Помимо количественных, у эритроцитов А и А есть качественные различия. У лиц с группами крови А или А В могут вырабатываться анти-А -антитела, однако никогда не бывает наоборот. Это означает, что эритроциты А отличаются от А отсутствием какой-то структуры. Серологическое разделение было подтверждено генетически, когда было показано существование двух различных ферментов [17]. Фермент А2-гликозилтрансфераза обладает более низкой активностью и имеет болееузкую субстратную специфичность по сравнению с ферментом А1-гликозилтрансферазой.
Эритроциты А1 и А2 одинаково сильно реагируют с современными реагентами анти-А в методе прямой агглютинации. Различие между А - и А2-эритроцитами может быть установлено путем тестирования с ан-ти~А~лектином и моноклональными антителами ан-ти-А . Эти реагенты вызывают агглютинацию эритроцитов А1 и А1В, не реагируют с эритроцитами А2В, но могут вызывать слабую агглютинацию эритроцитов А2. Установленного стандарта для реагентов и метода не существует, поэтому нередки несоответствия в результатах, полученных с применением различных реагентов и в разных лабораториях [20].
Целью настоящей работы было создать стратегию определения вариантов антигена А с применением доступных реагентов в реакции агглютинации.
Материалы и методы
В исследовании использовали образцы крови доноров, полученные в отделении заготовки крови ФГБУ «НМИЦ гематологии» МЗ РФ после получения информированного согласия; все тесты проводили после завершения иммуносерологического тестирования и исследования на патогены. Материалом исследований были образцы крови 23 человек со слабым вариантом антигена А, из которых у 16 человек была группа крови А2, у 5 — группа A2B, у 2 — серологически была определена группа A3, а также 12 образцов крови с антигеном А в качестве контроля (из них у 6 человек была группа крови А и у 6 — группа AB).
Применяли следующие методы.
Перекрестное определение группы крови системы АВ0 в реакции агглютинации на плоскости с ис-
пользованием Эритротест Цоликлонов анти-А (сер. 423R и 433F) и анти-В (сер 424R) (ООО «Гематолог», Москва) и стандартных эритроцитов групп А1, В, 0 (BioRad, США). Активными компонентами Цоликлонов являются моноклональные антитела класса IgM мыши: клоны А-90/16 и Birma (Цоликлон анти-А вариант R), клоны А-90/16, А-86/3 и 9113D10 (Цоликлон анти-А вариант F), клон В-85/2-В8 (Цоликлон анти-В вариант R).
Определение подгруппы антигена А в реакции агглютинации на плоскости с использованием монокло-нального реагента Цоликлона анти-А1 (сер. 261) (клоны 1Е3 и 5Е6), Эритротест анти-А: лектина (сер. 259), Цоликлона анти-Нкра (сер. 735) (клон Н-89/8) (ООО «Гематолог», Москва); анти-А1 лектина (сер. 020317В), анти-Н (А2) (сер. 080517С) (клон 10934C11) (ImuMed Antitoxin, Германия); анти-А:-лектина (сер. 118100201) (Bio-Rad, США). Силу реакции оценивали по 4-кре-стовой системе через 5 мин после смешивания эритроцитов с реагентом в соответствии с таблицей 1.
ДНК-анализ генаАВ0*А выполняли двумя методами: полимеразной цепной реакцией (ПЦР) и прямым сек-венированием. Геномную ДНК выделяли с помощью реактивов фирмы BAG (Германия) по методике производителя и по стандартной методике депротеинизации фенолом после лизиса с протеиназой К. Концентрацию и чистоту ДНК определяли на спектрофотометре. Одна оптическая единица (OD) соответствовала концентрации ДНК 50 нг/мкл. Чистота ДНК, определяемая по отношению показателей при 260 и 280 нм (OD 260/280), составляла 1,6—1,8, концентрация конечной ДНК - 50-100 нг/мкл.
ПЦР проводили с помощью праймеров для выявления вариантов генов системы АВ0 (AB0-variant kit) фирмы BAG (Германия). Детекцию полученных результатов осуществляли посредством электрофореза продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий (1мкг/мл) в TBE-буфере. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом све-
те (к = 310 нм) при помощи транс-иллюминатора в виде полос ярко-оранжевого цвета. Наличие полос амплификации внутреннего положительного контроля свидетельствовало о корректности проведенной ПЦР Прямое секвенирование проводили по методу Сэнгера с помощью набора реактивов ABIPRISM®BigDyeTMT erminatorv.3.1. У всех образцов секвенировали экзоны 6 и 7 гена АВ0*А.
Результаты
В работе представлены результаты исследования образцов эритроцитов со слабыми вариантами антигена А с помощью различных реагентов — анти-А:-лек-тина, анти-А1-моноклональных антител и дополнительного реагента — анти-Н-моноклональных антител для демонстрации возможности дифференцирования подгрупп антигена А серологическими методами. Принадлежность эритроцитов к той или иной подгруппе была подтверждена генетическим тестированием.
Детальные результаты исследований показаны в таблице 2. Результаты реакции с Цоликлонами анти-А и анти-В приведены для демонстрации групповой принадлежности (столбцы 1—3). Группу АВ0 подтверждали перекрестным тестированием, то есть реакцией сыворотки со стандартными эритроцитами А, В, 0 (данные не приведены). Цоликлоны анти-А с индексами R и F отличались по составу и содержали продукты различных клонов. Оба реагента одинаково активно реагировали с подгруппами А1, А2 и А3 (столбцы 1—2), что соответствовало требованиям к реагентам для рутинного тестирования.
В таблице 2 приведено сравнение четырех различных анти-А -реагентов, три из которых представляли собой раствор лектина DoLichos biflorus (столбцы 5—7) и один реагент, Цоликлон анти-А , был смесью двух моноклональных антител (столбец 4). Результаты эксперимента и лабораторная практика показали, что все анти-А -реагенты не взаимодействовали
Таблица 1. Оценка силы реакции гемагглютинации Table 1. Strength of haemagglutination reaction
Сила реакции Strength of agglutination Вид агглютинации Agglutination type
4+ Полная агглютинация, т.е. один плотный агглютинат Complete agglutination, i.e. one solid agglutinate
3+ Смесь нескольких крупных и средних агглютинатов Several large and medium agglutinates
2+ Смесь средних и мелких агглютинатов A mixture of medium-sized and small agglutinates
] + Мелкие агглютинаты Small agglutinates
+/- Очень мелкая агглютинация на фоне свободных эритроцитов (смешанная агглютинация) Weak granularity in the red cell suspension (mixed-field)
- Отсутствие агглютинации No agglutination
3»
—I
о о
Таблица 2. Результаты серологического и генетического определения подгруппы антигена а; сравнение эффективности и специфичности анти-А1 реагентов Table 2. The results of the serological and genetic determination of the subgroup of antigen A; comparison of the efficacy and specificity of anti-Al reagents
Результаты анализа (сила агглютинации) Test results (agglutination strength)
Эритроциты донора/ больного Red blood cells of donor/patient (№)
10742
Эритротест Цоликлон анти-А (R) Erythrotest Zoliclone
Эритротест Эритротест Цоликлон Цоликлон
анти-А (F) Erythrotest Zoliclone
анти-В Erythrotest Zoliclone
Эритротест Цоликлон анти-А1 moho Erythrotest Zoliclone
Anti-A (R) Anti-A (F) Anti-B Anti-A 1 mono
4+
4+
Эритротест анти-А1 лектин Erythrotest Anti-A 1
3+
Bio-Rad Anti-AI Lectin
2+
ImuMed Anti-A1 Lectin
2+
Эритротест Цоликлон анти-Нкра Erythrotest Zoliclone Anti-H)
4+
ImuMed Anti-H
4+
ДНК-анализ генов ABO
DNA analysis of ABO genes
A202
110812
4+
4+
2+
2+
4+
4+
a20'
11338
4+
4+
1-2+
4+
4+
a20'
11271
4+
4+
2+
3+
3+
4+
4+
a20'
11293
4+
4+
2+
2+
4+
4+
a20'
11655
4+
4+
4+
4+
a20'
11675
4+
4+
2+
2+
4+
4+
a20'
11564
4+
4+
2+
3+
3+
4+
4+
a20'
1370
4+
4+
2-3+
2-3+
4+
4+
А2Ок
1349
4+
4+
2-3+
2-3+
4+
4+
А2Ок
1372
4+
4+
3+
2+
4+
4+
А2Ок
11620
4+
4+
2+
2+
4+
4+
А2Ок
11912
4+
4+
1-2+
1-2+
4+
4+
А2Ок
1878
4+
4+
2+
2+
4+
4+
А2Ок
112155
4+
4+
1-2+
1-2+
4+
4+
А2Ок
112126
4+
4+
1-2+
1-2+
4+
4+
А2Ок
110718
4+
4+
4+
a2b'
a2b
110828
4+
4+
4+
a2b'
a2b
11625
3+
3+
4+
a2b'
A2B
1378
11595
112067 111800
4+
медленно
4+
+2 +2
4+
медленно
4+
+2 +2
4+
4+
4+ 4+
4+ 4+
A2B'
нд
np
a101 a101
a2b
a2b
Аз A,
AßO-группа AB0 blood group < < < < < < a'v a'v a'v a'v a'v СО <
о ДНК-анализ генов Aß0 DNA analysis of AB0 genes ч: а. х с X с X с X с X с X с X с X с X с X с X с со <
о ImuMed Anti-Н 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
00 Эритротест Цоликлон анти-Нкра Erythrotest Zoliclone Anti-H) +1 +1 +1 + + + 1 1 1 +1 +1 1
к ImuMed Anti-A1 Lectin + + + + + + + + + + + +
ч> Bio-Rad Anti-A1 Lectin + + + + + + + + + + + +
ю Эритротест анти-А1 лектин Erythrotest Anti-A1 lectin + + + + + + + со + со + со + со + со + со
"t Эритротест Цоликлон анти-А1 моно Erythrotest Zoliclone Anti-A 1 mono + со + со + со + со + со + со + CN + CN + со + CN + CN + со
го Эритротест Цоликлон анти-В Erythrotest Zoliclone Anti-B 1 1 1 1 1 1 + + + + + +
CN Эритротест Цоликлон анти-А (F) Erythrotest Zoliclone Anti-A (F) + + + + + + + + + + + +
- Эритротест Цоликлон анти-А (R) Erythrotest Zoliclone Anti-A (R) + + + + + + + + + + + +
Эритроциты донора/ больного Red blood cells of donor/patient (№) 111668 111617 111607 111667 111586 111616 112033 112164 112117 111649 111659 111350
a о
О
О I;
v с
о -5
0 I
X <1
Ü Ü ?
1 °
® с
I о
о a.
о с
a
* I
с эритроцитами А2В, но часто реагировали с эритроцитами А • Лектины анти-А производства фирм BioRad и ImuMed (Antitoxin) вызывали крупную агглютинацию А - и АВ-эритроцитов, но также явно реагировали (на 1+ — 2+) с большинством образцов эритроцитов А2. Эта реакция была существенно слабее, чем с А -эритроцитами, однако могла ввести в заблуждение, особенно при отсутствии положительных (А1) и отрицательных (А2) контрольных образцов (эритроцитов А нет в доступных панелях стандартных эритроцитов). Моноклональный реагент анти-А; реагировал с А2-эритроцитами более избирательно: сила реакции с эритроцитами А2 было слабой (на 1+), но он менее активно реагировал и с эритроцитами А и А1В — агглютинация начинала формироваться позднее, и сила реакции была не выше 3+.
Реакция с двумя анти-Н-моноклональными реагентами разных производителей была идентичной (столбцы 8—9): отрицательной или слабой с эритроцитами А и ярко выраженной со всеми образцами А .
На рисунке 3 показано на примере четырех образцов эритроцитов А, А, АВ и А В, как выглядит реакция на плоскости с набором реагентов, необходимых для установления подгруппы антигена А.
В серологическое исследование были включены образцы крови доноров, которым был проведен АВ0 (столбец 10) ДНК-анализ с использованием праймеров
фирмы BAG для выявления вариантных антигенов А, который подтвердил наличие аллеля АВ0*А2 у 21 донора эритроцитов. В двух случаях серологически была определена подгруппа А3 (на плоскости наблюдалась замедленная агглютинация на 2+ на фоне свободных эритроцитов, в гелевом методе отмечали расслоение эритроцитов в пробирке), однако генотипирование выявило аллель АВ0*А1. Прямым секвенированием ДНК доноров этих образцов эритроцитов были идентифицированы аллели АВ0*А2.05 и АВ0*А2.06.
Обсуждение
Антигены групп крови систем АВ0 являются углеводами (карбогидратами), то есть структурами, которые формируются в результате биохимических процессов с участием гликозилтрансфераз. Гены всех углеводных антигенов, в том числе А и В, кодируют гликозилтрансферазы — ферменты, которые переносят конкретные сахара на углеводную цепь-предшественник и формируют соответствующий антиген [21]. Предшественником для синтеза антигенов А и В является антиген Н, к которому А-гликозилтрансфераза присоединяет N-ацетилгалактозамин (GalNAc), а В-гликозилтрансфераза присоединяет галактозу (Gal) (рис. 1). На эритроцитах группы 0 присутствует большое количество антигена Н, неконвертированного в А- и/или B-антигены. Синтез А- и/или В-антигенов
А тип 4 A type 4
Рисунок 1. Структура антигенов А и В, типы олигосахаридных Н-цепей предшественников. GINAc — N-ацетилглюкозамин; Gal — галактоза; Fuc — фукоза; GalNAc — N-ацетилгалактозамин. Типы цепей 2-4 являются эндогенными, тип 1 (не показан) может адсорбироваться на эритроциты из плазмы. Типы цепей различаются не только составом, но и положением гликозидной связи между сахарами (а или ß; 1-3, 1-4). Полисахаридные цепи соединены с протеинами (P) или сфинголипидами (S) мембраны эритроцита
Figure 1. Structure of the A and B antigens; types of oligosaccharide precursor H-chains/ GINAc — N-acetylglucosamine; Gal — galactose; Fuc — fucose; GalNAc — N-acetyl-galactosamine. Chain types 2-4 are endogenous, type 1 (not shown) can be adsorbed onto red blood cells from plasma. The types of chains differ in composition, as well as in the position of the glycosidic bond between sugars (a or ß; 1-3, 1-4). Polysaccharide chains are linked to the proteins (P) or sphingolipids (S) of the erythrocyte membrane
приводит к снижению количество антигена Н на поверхности эритроцита. Таким образом, экспрессия антигенов А и/или В и экспрессия антигена Н обратно пропорциональны.
Углеводные Н-цепи имеют различное биохимическое строение. На эритроцитах могут присутствовать четыре типа Н-цепей, на которых формируются соответственно 4 типа антигена А [22—24] (рис. 1). Нумерация подгрупп антигена А (А1, А2, А3) и цифровые обозначения типов углеводной цепи (типы 1, 2, 3, 4) не связаны между собой. Тип 1 Н-цепей синтезируется эпителиальными клетками и является предшественником растворимых антигенов, которые обнаруживаются в слюне или плазме у лиц-«секреторов». На эритроциты такие антигены адсорбируются из плазмы. Эндогенные эритроцитарные типы Н-цепей — это типы 2, 3 и 4. На эритроцитах А экспрессируются все типы антигена А. На А - и А2В-эритроцитах присутствует антиген А, представленный на Н-цепях типа 2. Показано, что ключевым отличием фенотипов А и А2 является различная экспрессия антигена А типов 3 и 4: тип 3 отсутствует на эритроцитах А2В и слабо выражен на эритроцитах А , тип 4 полностью отсутствует на эритроцитах А и А2В [25] (рис 2). Эти отличия связаны с тем, что активная А -гликозилтрансфераза эффективно конвертирует Н вещество в А антиген и переносит Оа1МАе на Н-цепь любого типа, в то время как А2-гликозилтрансфераза имеет субстратные ограничения и не способна прикреплять иммунодоминант-ные сахара на Н-цепи типа 3 и 4.
Основным реагентом, используемым для дифференциации подгрупп, является анти-А -лектин. Он представляет собой экстракт из семян бобового растения БоИсЬоё Ь'фогил. Экстракт реагирует с обеими подгруппами А эритроцитов, но при нужном разведении проявляет преимущественно анти-А -активность. Другой анти-А^диагностикум, Цоликлон анти-А:, представляет собой комбинацию двух моноклональ-ных анти-А:-антител. Как показывают данные, представленные в таблице 2, и лектины, и моноклональные антитела могут вызывать агглютинацию некоторых образцов эритроцитов А2, причем сила агглютинации варьирует. Было установлено, что анти-А^монокло-нальные антитела, входящие в состав Цоликлона, реагируют с антигеном А, экспрессированном на Н-цепях типа 3 и 4 [25]. Эти структуры присутствуют на эритроцитах А1, а на эритроцитах А2 их либо очень мало, либо они не обнаруживаются вообще (рис. 2). Зная эпитопную специфичность анти-А:-моноклональных антител, можно предполагать, что Цоликлон анти-А выявляет на эритроцитах А2 слабо экспрессирован-ные детерминанты антигена А типа 3, создавая видимость неспецифической реакции. Такая проблема не возникает при тестировании эритроцитов группы А2В, поскольку сильная В-трансфераза конкурирует со слабой А2-трансферазой и утилизирует общие Н-предшественники.
Полезным реагентом для подтверждения подгруппы является анти-Н-реагент. Активная А^глико-зилтрансфераза превращает в антиген А существен-
Рисунок 2. Количественные и качественные различия А!- и А2-эритроцитов.
Высота столбцов демонстрирует относительное количество H- и А-антигенных детерминант на мембранах эритроцитов. Сильная А^трансфераза активно утилизирует молекулы Н-антигена (верхняя панель), превращая их в антиген А, в то время как трансфераза А2 оставляет существенное количество антигена Н, не конвертированного в антиген А (нижняя панель). Эр — эритроциты
Figure 2. Quantitative and qualitative differences between A ] and A2 red blood cells. The height of the columns denotes the relative amount of H and A antigenic determinants on the membranes of red blood cells. The strong A ] transferase actively utilizes the molecules of the H antigen (upper panel) turning them into the A antigen, while the A2 transferase leaves a significant amount of the H antigen not converted to the A antigen (bottom panel). RBCs — red blood cells
Эритроциты
Red blood cells
Реагенты:
Reagents:
1. Анти-А1 моно («Гематолог»)
1. Anti-AI mono ("Hematolog Ltd")
2. Анти-А1 лектин («Гематолог»)
2. Anti-AI lectin ("Hematolog Ltd")
3. Анти-А1 лектин ("BioRad")
3. Anti-A! lectin ("BioRad")
4. Анти-А1 лектин ("ImuMed Antitoxin"
4. Anti-A! lectin ("ImuMed Antitoxin")
5. Анти-Н моно («Гематолог»)
5. Anti-H mono ("Hematolog Ltd")
6. Анти-Н моно ("ImuMed Antitoxin")
6. Anti-H mono («ImuMed Antitoxin»)
Цоликлон анти-А («Гематолог»)
Zoliclone anti-A ("Hematolog Ltd")
Цоликлон анти-В («Гематолог»)
Zoliclone anti-B ("Hematolog Ltd
Рисунок 3. Реакция агглютинации на плоскости эритроцитов А]; А]В, А2 и А2В с реагентами анти-А, анти-В, анти-А! и анти-Н (фото). В рядах 1-4 показана реакция агглютинации эритроцитов с различными анти-А] реагентами. Отчетливо видно, что анти-А] лектины агглютинируют эритроциты А2, однако сила агглютинации заметно слабее, чем с эритроцитами А]. Ряды 5-6 демонстрируют, что анти-Н реагенты сильно реагируют с эритроцитами А2 и практически не реагируют с эритроцитами А]. Ряды 7-8, агглютинация с цоликлонами анти-А и анти-В, приведена для подтверждения группы крови
Figure 3. Slide agglutination of A ] AIB, A2 and A2B red blood cells using anti-A, anti-B, anti-Al and anti-H reagents (photo). Rows 1-4 show the agglutination of red blood cells using various anti-A ] reagents. The figure clearly shows that anti-A] lectins agglutinate A2 red blood cells; however, the strength of agglutination is noticeably weaker than with A ] red blood cells. Rows 5-6 demonstrate that anti-H reagents strongly react with A2 red blood cells and practically do not react with A] red blood cells. in rows 7-8, the agglutination reaction using anti-A and anti-B Zoliclons is given to confirm the blood group
но больше молекул Н, чем А2-гликозилтрансфераза. Таким образом, содержание антигена Н на эритроцитах А ниже, чем на эритроцитах А2, и поэтому анти-Н-реа-генты практически не агглютинируют А-эритроциты, но дают сильную реакцию с А2-эритроцитами. В таблице 2 и на рисунке 3 видно, как четко различают подгруппы антигена А все анти-Н-реагенты. Реагент компании ImuMed называется анти-Н (А2), однако мишенью антител является антиген Н, а дополнительная подпись в скобках (А2) — это скорее указание к применению. В настоящей работе были использованы только моноклональные анти-Н-реагенты. Экстракт из Шех еигораеш) также выявляет антиген Н и может применяться с той же целью.
Таким образом, в рутинной практике для дифференциации подгрупп А1 и А2 в большинстве случаев достаточно двух реагентов: анти-А и анти-А . Моноклональные реагенты анти-А одинаково надежно выявляют А и А и четко реагируют с эритроцитами А , а реагенты анти-А при необходимости позволят дифференцировать А1 от А2 и более слабых подгрупп. Моноклональный реагент Цоликлон анти-А: явля-
ется адекватной заменой лектину анти-А:. В случае сомнительного результата реакции эритроцитов с ан-ти-А:-реагентом следует провести тестирование с реагентом анти-Н: сильная реакция укажет на А2, отрицательная или слабая — на А1.
У двух доноров в настоящем исследовании было отмечено расхождение результатов серологических и молекулярных методов: серологически была определена подгруппа А , генотипирование методом ПЦР выявило аллель АВ0*А1. Прямое секвенирование ДНК показало сочетание мутантных аллелей, которое проявляет себя как фенотип А [26]. Праймеры наборов A-variant Type (фирмы BAG) подобраны к наиболее часто встречающимся вариантам и не могут выявить все мутации гена АВ0. За очевидными результатами гено-типирования могут маскироваться мутантные аллели, что и наблюдалось в двух образцах.
Очевидно, что поиск генетических разновидностей антигена А представляет интерес для исследования эволюции гена, описания новых или редких вариантов [27], но в практической трансфузиологии генетическое типирование каждого реципиента со сла-
бым антигеном А затруднительно и нерационально. Кроме того, результаты генетического анализа позволяют лишь предсказать наличие антигена; окончательное решение принимается на основе данных серологического исследования, как в приведенном выше случае. Тем не менее в литературе предлагается использовать ДНК-анализ как подтверждающий
тест в тех случаях, когда у здоровых доноров со слабой подгруппой антигена А не совпадают результаты перекрестного АВО-типирования, и компонент крови при этом бракуют. Авторы считают, что уточнение группы с помощью ДНК-анализа позволит избежать нерациональной отбраковки таких компонентов [28].
Литература
1. Дашкова Н.Г., Рагимов А.А., Асоскова Т.К. Значение изоантигена А2 и имунных анти-А1 антител в трансфузиологии. Анестезиология и реаниматология. 2009; 6: 62-4.
2. Helmich F., Baas I., Ligthart P. et al. Acute hemolytic transfusion reaction due to a warm reactive anti-A1. Transfusion. 2018; 58: 1163-70. DOI: 10.1111/trf. 14537
3. Jaben E.A., Jacob E.K., Tauscher C. et al. Clinically significant anti-A( 1) in a presumed АВ0-identical hematopoietic stem cell transplant recipient: a case report. Transfusion. 2013; 53: 202-5. DOI: 10.1111/j.1537-2995.2012.03696.x
4. Reid M.E., Lomas-Francis C. The blood group antigen factsbook. 2nd ed. Academic Press, 2004.; DOI: 10.1016/B978-0-12-586585-2.X5000-8
5. Order of the Ministry of Health of the Russian Federation (Ministry of Health of Russia) April 2, 2013, N 183n, Moscow: "On approval of the rules for the clinical use of donated blood and (or) its components".
6. Yamamoto F. Molecular genetics of АВ0. Vox Sang. 2000; 78: 91-103.
7 Seltsam A., Hallensleben M., Kollmann A., Blasczyk R. The nature of diversity and diversification at the АВ0 locus. Blood. 2003; 102: 3035-42. DOI: 10.1182/blood-2003-03-0955
8. Prager M. Molecular genetic blood group typing by the use of PCR-SSP technique. Transfusion. 2007;47:54-9. DOI: 10.1111/j.1537-2995.2007.01311.x
9. Olsson M.L., Chester M.A. Polymorphism and recombination events at the АВ0 locus: a major challenge for genomic АВ0 blood grouping strategies. Transfus Med. 2001; 11: 295-313.
10. Chen D.P., Sun C.F., Ning H.C. et al. Genetic and mechanistic evaluation for the weak A phenotype in Ael blood type with, IVS6 + 5G>A АВ0 gene mutation. Vox Sang. 2015; 108: 64-71. DOI: 10.1111/vox.12196
11. Technical manual. Ed. Mark E. Brecher. 15th ed., Bethesda, AABB, 2005.
12. Донсков С.И., Мороков В.А. Группы крови человека. Руководство по иммуносерологии. М.: Бином; 2014.
13. Трансфузиология. Национальное руководство. Под ред. А.А. Рагимова, 2-е изд. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2018.
14. Shastry S., Bhat S. Imbalance in A(2) and A(2)B phenotype frequency of АВ0 group in South India. Blood Transfus. 2010; 8: 267-70. DOI: 10.2450/2010.0147-09
15. Ogasawara K., Yabe R., Uchikawa M. et al. Different alleles cause an imbalance in A2 and A2B phenotypes of the АВ0 blood group. Vox Sang. 1998; 74: 242-7
16. Economidou J., Hughes-Jones N.C., Gardner B. Quantitative measurements concerning A and B antigen sites. Vox Sang. 1967; 12: 321-8.
17. Schachter H., Michaels M.A., Tilley C.A., Crookston M.C., Crookston J.H. Qualitative differences in the N-acetyl-D-galactosaminyltransferases produced by human A1 and A2 genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1973; 70: 220-4. DOI: 10.1073/pnas.70.1.220
18. Storry J.R., Olsson M.L. Genetic basis of blood group diversity. Br J Haematol. 2004; 126: 759-71. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2004.05065.x
19. Yamamoto F., McNeill P.D., Hakomori S. Human histo-blood group A2 trans-ferase coded by A2 allele, one of the A subtypes, is characterized by a single
References
1. Dashkova N.G., Ragimov A.A., Asoskova T.K. Significance of the isoantigen A2 and immune anti-A1 antibodies in transfusiology. Anesteziologiya i Reanima-tologiya. 2009; 6: 62-4 (In Russian).
2. Helmich F., Baas I., Ligthart P. et al. Acute hemolytic transfusion reaction due to a warm reactive anti-A1. Transfusion. 2018; 58: 1163-70. DOI: 10.1111/trf. 14537
3. Jaben E.A., Jacob E.K., Tauscher C. et al. Clinically significant anti-A(1) in a presumed AB0-identical hematopoietic stem cell transplant recipient: a case report. Transfusion. 2013; 53: 202-5. DOI: 10.1111/j.1537-2995.2012.03696.x
4. Reid M.E., Lomas-Francis C. The blood group antigen factsbook. 2nd ed. Academic Press, 2004.; DOI: 10.1016/B978-0-12-586585-2.X5000-8
5. Order of the Ministry of Health of the Russian Federation (Ministry of Health of Russia) April 2, 2013, N 183n, Moscow: "On approval of the rules for the clinical use of donated blood and (or) its components".
6. Yamamoto F. Molecular genetics of AB0. Vox Sang. 2000; 78: 91-103.
7. Seltsam A., Hallensleben M., Kollmann A., Blasczyk R. The nature of diversity and diversification at the AB0 locus. Blood. 2003; 102: 3035-42. DOI: 10.1182/blood-2003-03-0955
8. Prager M. Molecular genetic blood group typing by the use of PCR-SSP technique. Transfusion. 2007;47:54-9. DOI: 10.1111/j. 1537-2995.2007.01311.x
9. Olsson M.L., Chester M.A. Polymorphism and recombination events at the AB0 locus: a major challenge for genomic AB0 blood grouping strategies. Transfus Med. 2001; 11: 295-313.
10. Chen D.P., Sun C.F., Ning H.C. et al. Genetic and mechanistic evaluation for the weak A phenotype in Ael blood type with, IVS6 + 5G>A AB0 gene mutation. Vox Sang. 2015; 108: 64-71. DOI: 10.1111/vox.12196
11. Technical manual. Ed. Mark E. Brecher. 15th ed., Bethesda, AABB, 2005.
12. Donskov S.I., Morokov V.A. Human blood groups. Immunoserology manual. Moscow: Binom; 2014 (In Russian).
13. Transfusion. National Standart. Ed. AA Ragimov. Second ed. Moscow: GEO-TAR-Media; 2018 (In Russian).
14. Shastry S., Bhat S. Imbalance in A(2) and A(2)B phenotype frequency of AB0 group in South India. Blood Transfus. 2010; 8: 267-70. DOI: 10.2450/2010.0147-09
15. Ogasawara K., Yabe R., Uchikawa M. et al. Different alleles cause an imbalance in A2 and A2B phenotypes of the AB0 blood group. Vox Sang. 1998; 74: 242-7
16. Economidou J., Hughes-Jones N.C., Gardner B. Quantitative measurements concerning A and B antigen sites. Vox Sang. 1967; 12: 321-8.
17 Schachter H., Michaels M.A., Tilley C.A., Crookston M.C., Crookston J.H. Qualitative differences in the N-acetyl-D-galactosaminyltransferases produced by human A1 and A2 genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1973; 70: 220-4. DOI: 10.1073/pnas.70.1.220
1 8. Storry J.R., Olsson M.L. Genetic basis of blood group diversity. Br J Haematol. 2004; 126: 759-71. DOI: 10.1111/j .1365-2141,2004.05065.x 19. Yamamoto F., McNeill P.D., Hakomori S. Human histo-blood group A2 transferase coded by A2 allele, one of the A subtypes, is characterized by a single
base deletion in the coding sequence, which results in an additional domain at the carboxyl terminal. Biochem Biophys Res Commun. 1992; 187: 366-74. DOI: 10.1016/s0006-291x(05)81502-5
20. Yoshida A., Dave V., Prchal J. Uncertainty in identification of blood group A subtypes by agglutination test. Hum. Hered. 1985; 35: 1-6. DOI: 10.1159/000153505
21. Watkins W.M. Genetic regulation of the structure of blood-group-specific glycoproteins. Biochem Soc Symp. 1974; 40: 125-46.
22. Clausen H., Hakomori S. ABH and related histo-blood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution. Vox Sang. 1989; 56: 1-20.
23. Zhang Wei, Zhu Zi-yan. Structural modification of H histo-blood group antigen. Blood Transfus. 2015; 13: 143-9. DOI: 10.2450/2014.0033-14
24. Luiz Carlos de Mattos. Structural diversity and biological importance of АВ0, H, Lewis and secretor histo-blood group carbohydrates. Rev Bras Hematol Hemoter. 2016; 38(4): 331-40. DOI: 10.1016/j.bjhh.2016.07.005
25. Svensson L., Rydberg L., de Mattos L.C., Henry S.M. Blood group A(1) and A(2) revisited: an immunochemical analysis. Vox Sang. 2009; 96: 56-61. DOI: 10.1111/j .1423-0410.2008.01112.x
26. Barjas-Castro M.L., Carvalho M.H., Locatelli M.F., Bordin S., Saad S.T. Molecular heterogeneity of the A3 subgroup. Clin. Lab. Haematol. 2000; 22: 73-8. 27 Головкина Л.Л., Стремоухова А.Г., Пушкина Т.Д. Выявление редкого аллеля антигена А системы АВ0 Ael у женщины из Дагестана. Интер-медикал. 2015; 1(7): 25-8.
28. Westhoff C.M. Blood group genotyping. Blood. 2019; 133: 1814-20. DOI: 10.1182/blood-2018-11-833954
Информация об авторах
Головкина Лариса Леонидовна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией трансфузиологической иммуногематологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected];
ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9423-2640
Каландаров Рахман Самиевич, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории трансфузиологической иммуногематологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7730-8367
Стремоухова Алла Геннадьевна, врач клинической лабораторной диагностики лаборатории трансфузиологической иммуногематологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected];
ORCID: http:// orcid.org/0000-000 2-1705-7535
Калмыкова Ольга Сергеевна, заведующая лабораторией контроля качества и безопасности гемотрансфузий ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-6897-5977
base deletion in the coding sequence, which results in an additional domain at the carboxyl terminal. Biochem Biophys Res Commun. 1992; 187: 366-74. DOI: 10.1016/s0006-291x(05)81502-5
20. Yoshida A., Dave V., Prchal J. Uncertainty in identification of blood group A subtypes by agglutination test. Hum. Hered. 1985; 35: 1-6. DOI: 10.1159/000153505
21. Watkins W.M. Genetic regulation of the structure of blood-group-specific glycoproteins. Biochem Soc Symp. 1974; 40: 125-46.
22. Clausen H., Hakomori S. ABH and related histo-blood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution. Vox Sang. 1989; 56: 1-20.
23. Zhang Wei, Zhu Zi-yan. Structural modification of H histo-blood group antigen. Blood Transfus. 2015; 13: 143-9. DOI: 10.2450/2014.0033-14
24. Luiz Carlos de Mattos. Structural diversity and biological importance of AB0, H, Lewis and secretor histo-blood group carbohydrates. Rev Bras Hematol Hemoter. 2016; 38(4): 331-40. DOI: 10.1016/j.bjhh.2016.07.005
25. Svensson L., Rydberg L., de Mattos L.C., Henry S.M. Blood group A(1) and A(2) revisited: an immunochemical analysis. Vox Sang. 2009; 96: 56-61. DOI: 10.1111/j.1423-0410.2008.01112.x
26. Barjas-Castro M.L., Carvalho M.H., Locatelli M.F., Bordin S., Saad S.T. Molecular heterogeneity of the A3 subgroup. Clin. Lab. Haematol. 2000; 22: 73-8.
27. Golovkina L.L., Stremoukhova A.G., Pushkina T.D. Detection of rare allele Ael of AB0 system in woman from Dagestan. Inter-medical. 2015; 1(7): 25-8
28. Westhoff C.M. Blood group genotyping. Blood. 2019; 133: 1814-20. DOI: 10.1182/blood-2018-11-833954
Information about the authors
Larisa L. Golovkina, Dr. Sci. (Med.), Head of the Laboratory for Transfusion Im-munohematology, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected];
ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9423-2640
Rakhman S. Kalandarov, Cand. Sci. (Med.), Senior Researcher, Laboratory for Transfusion Immunohematology, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected]; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7730-8367
Alla G. Stremoukhova, Clinical Pathologist, Laboratory for Transfusion Immunohematology, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected];
ORCID: http:// orcid.org/0000-000 2-1705-7535
Olga S. Kalmykova, Head of the Laboratory for the Quality Control and Safety of Blood Transfusions, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-6897-5977
Пушкина Татьяна Дмитриевна, биолог лаборатории трансфузиологиче-ской иммуногематологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
е-тсл1: [email protected];
01?СЮ: http://orcid.org/0000-0002-8801-5578
Сурин Вадим Леонидович, старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-тюП: [email protected];
01?СЮ: https://orcid.org/0000-0002-1890-4492
Пшеничникова Олеся Сергеевна, старший научный сотрудник лаборатории генной инженерии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации,
е-тюП: [email protected]; 01?СЮ: https://orcid.org/0000-0001-5752-8146
Николаева Татьяна Леонидовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологии кроветворения ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected]; 01?СЮ: https://orcid.org/0000-0003-2614-0506
Оловникова Наталья Ивановна*, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии кроветворения ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, е-mail: [email protected], тел.: +7 (916) 915-25-01; 01?СЮ: https://orcid.org/0000-0003-0876-5414
* Автор, ответственный за переписку
Поступила: 05.07.2019 Принята к печати: 12.09.2019
Tatyana D. Pushkina, Biologist, Laboratory for Transfusion Immunohematology, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-8801-5578
Vadim L. Surin, Senior Researcher, Laboratory of Genetic Engineering National Research Centre for Hematology, e-mail: [email protected];
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1890-4492
Olesya S. Pshenichnikova, Senior Researcher, Laboratory of genetic engineering, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected]; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-5752-8146
Tatyana L. Nikolaeva, Cand. Sci. (Biol.), Senior Researcher, Laboratory for Physiology of Hematopoiesis, e-mail: [email protected]; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-2614-0506
Natalya I. Olovnikova*, Cand. Sci. (Biol.), Leading Researcher, Laboratory for Physiology of Hematopoiesis, National Research Center for Hematology, e-mail: [email protected], tel.: +7 (916) 915-25-01; ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0876-5414
* Corresponding author
Received 05 Jul 2019 Accepted 12 Sep 2019
