CC BY
66
УДК 612.017.1:616-008
Дифференциальный анти-ВИЧ-эффект нового препарата на основе гуминовых веществ в различных клетках-мишенях иммунной системы
Г. В. Корнилаева1, А. Э. Синявин1,2*, A. Schultz3, A. Germann3, C. Moog4, H. von Briesen3, А. С. Тургиев1,5, Э. В. Карамов1
1ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
3Fraunhofer Institut fuer Biomedizinische Technik (IBMT), Joseph-von-Fraunhofer-Weg 1, 66280 Sulzbach, Germany
4INSERM U1109, Fédération Hospitalo-Universitaire (FHU) OMICARE, Fédération de Médecine Translationnelle de Strasbourg (FMTS), Université de Strasbourg, 4 Rue Biaise Pascal, Strasbourg 67000, France
5ООО «Иммуномика», 107078, Москва, ул. Новая Басманная 12, стр. 2, офис 103
*E-mail: andreysi93@yandex.ru
Поступила в редакцию 03.03.2019
Принята к печати 15.04.2019
DOI: 10.32607/20758251-2019-11-2-68-76
РЕФЕРАТ Исследована эффективность ингибирования ВИЧ-инфекции в индивидуальных пулах иммунных клеток - CD4+ Т-лимфоцитах, макрофагах, дендритных клетках - новым препаратом на основе гуминовых веществ. При воздействии нетоксичных концентраций препарата в каждой из этих популяций достигается почти полное (более 90%) ингибирование инфекции. Обнаруженный эффект показывает возможность защиты существенной части функционально значимых для иммунной системы клеток от истощения. Сравнительное изучение подавления инфекции в индивидуальных пулах позволило выявить различия в эффективности препарата в каждой из клеточных популяций. Наиболее чувствительной оказалась инфекция в макрофагах, зараженных вариантом R5 ВИЧ-1: 90 и 50% ингибирование инфекции наблюдалось в присутствии достаточно низких (1.4 и 0.35 мкг/мл) концентраций препарата. Для достижения такого же уровня ингибирования инфекции в дендритных клетках, зараженных тем же штаммом, требовались в 15-19 раз более высокие концентрации препарата. Эффективность препарата в CD4+ Т-лимфоцитах была достаточно близка к его эффективности в макрофагах. Препарат оказался универсально эффективным как в отношении Т-, так и М-тропных вариантов ВИЧ-1.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА гуминовые вещества, дендритные клетки, макрофаги, подавление ВИЧ-инфекции, CD4+ Т-лимфоциты, Т- и М-тропные варианты ВИЧ-1.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; СБФГ - солюбилизированная бутанольная фракция гуминовых веществ; ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; Мф - макрофаги; ДК - дендритные клетки; МПК - мононуклеары периферической крови; AZT - азидотимидин; ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты.
ВВЕДЕНИЕ
Клетки врожденного иммунитета, такие, как моноциты, макрофаги и дендритные клетки, представляют собой первую линию защиты от патогенов [1-5], и они же являются клетками-мишенями для ВИЧ. Вирусной атаке подвергаются клетки, экспрессиру-
ющие мембранные молекулы CD4, CCR5 и CXCR4, находящиеся, в зависимости от пути проникновения инфекции, в слизистых оболочках, в крови или лим-фоидных тканях. Эффективность инфицирования зависит как от уровня экспрессии поверхностных клеточных рецепторов, так и от штамма вируса [6,
7]. На высоком уровне вирус продуцируется главным образом в активированных во время острой инфекции CD4+ Т-лимфоцитах [8]. Но и в покоящихся CD4+ клетках памяти обнаруживается и репликация вируса, и провирусная ДНК в латентно интегрированном или преинтегрированном состоянии [9]. Клетки с интегрированным вирусным геномом представляют часть существующего длительное время резервуара инфекции в организме, где могут сохраняться до 4 лет [9]. Полагают, что покоящиеся CD4+ клетки памяти подвергаются инфицированию в первую очередь и преимущественно R5-фенотипом вируса [10-12], что может быть связано с экспрессией интегрина LFA-1 [13]. Повышенная способность варианта R5 вируса к репликации может также объяснить их преобладание во время острой или первичной инфекции [14].
В патогенетическом процессе ВИЧ-инфекции участвуют также антигенпрезентирующие клетки - макрофаги и дендритные клетки [15-18], обладающие ВИЧ-специфичными рецепторами, способные активно циркулировать в крови и проникать в различные лимфоидные и нелимфоидные ткани. Дендритные клетки - классические антигенпре-зентирующие клетки с экстраординарной способностью распознавать и процессировать антиген [19]. Незрелые дендритные клетки обладают повышенной способностью к фагоцитозу, тогда как у зрелых клеток увеличена способность продуцировать цитокины. При созревании в дендритных клетках экспрессия рецепторов CCR5 уменьшается, а CXCR4 увеличивается, что может привести к инфицированию вирусами с обоими фенотипами [18]. Известно также, что клетки Лангерганса (дендритные клетки кожи) способны захватывать вирус с помощью лектина С-типа - лангерина, без продукции вируса. При созревании дендритных клеток продукция вируса в них снижается в 10-100 раз по сравнению с продукцией в незрелых клетках [17, 20]. Большинство исследователей считают, что дендритные клетки не являются активными продуцентами вируса, но благодаря высокой способности к миграции их основная роль заключается в доставке вируса от сайтов проникновения к СD4+ Т-клеткам в лимфоидных тканях, что способствует быстрой диссеминации вируса в организме. Макрофаги также проявляют чувствительность к ВИЧ-инфекции [21, 22]. R5-вирусы, обладающие тропизмом к макрофагам, так же хорошо реплицируются в макрофагах периферической крови, как и в СD4+ лимфоцитах [23]. Способность продуцировать вирус у макрофагов также различается. Часто при инфицировании макрофагов наблюдается низкая интенсивность продукции вируса, который обнаруживается в секвестрированной форме
во внутриклеточных вакуолях. Причина ограничения вирусной репликации может быть обусловлена внутриклеточными механизмами неспецифической защиты. Обычно R5-вирусы не проявляют цитопа-тогенных свойств, но некоторые изоляты, особенно обнаруживаемые на поздних стадиях заболевания, размножаются в макрофагах до высоких титров и могут проявлять цитопатический эффект [24, 25]. Инфицированные макрофаги погибают преимущественно путем некроза. Весьма важно, что эти клетки, участвующие в патогенетическом процессе, могут служить резервуаром для вируса, недоступного в виду отсутствия активной вирусной репродукции и синтеза вирусспецифических белков ни для анти-ретровирусной терапии, ни для распознавания цито-токсическими лимфоцитами иммунной системы.
В целом, опубликованные данные свидетельствуют о том, что пермиссивность иммунных клеток по отношению к ВИЧ во многом зависит от стадии созревания/дифференцировки и функциональной поляризации. При этом может меняться и продукция цитокинов, и рецепторный репертуар. Индуцированное инфекцией истощение пула чувствительных к вирусу иммунных клеток приводит в конечном итоге к негативному влиянию на формирование дальнейшего иммунного ответа.
Современный подход к оценке антивирусной активности каждого нового препарата непременно включает исследования на основных клетках-мишенях, участниках патогенеза ВИЧ-инфекции, таких, как мононуклеары периферической крови, макрофаги, дендритные клетки. Это позволяет получить информацию об эффективности исследуемого вещества в каждой популяции клеток и иметь представление о его возможности влиять на течение патогенетического процесса, и, в конечном итоге, оптимизировать анти-ВИЧ-терапию.
В настоящей работе исследована анти-ВИЧ-активность нового препарата, представляющего собой солюбилизированную бутанольную фракцию гуминовых веществ (СБФГ). Согласно масс-спектрометрическим данным и элементному анализу, содержание углерода и кислорода (% по массе) в данной фракции составляет порядка 52.7 и 37.1% соответственно при невысоком содержании азота и серы (4.3 и 2.1% соответственно) [26, 27]. Следует отметить, что элементный анализ гуминовых веществ, полученных из одного источника и с использованием одних и тех же методов выделения и фракционирования, дает воспроизводимые значения. Данные ВЭЖХ показывают, что препарат характеризуется достаточно высоким содержанием гидрофобных ароматических фрагментов (74%), что также подтверждено с помощью 13С-ЯМР. Атомное отношение Н/С
ТОМ 11 № 2 (41) 2019 | АСТА ^ТОИАЕ | 69
составляет 0.8, О/С - 0.53 [28-30]. Известно, что гу-миновые вещества образуются в результате распада отмерших организмов и составляют один из самых обширных резервуаров органического углерода. Препараты на основе гуминовых веществ, разработанные и изученные ранее, такие, как, например Олипифат, характеризуются как экологически чистые и безопасные продукты, обладающие многими полезными свойствами. Они стимулируют гемопоэз, проявляют ранозаживляющую, иммуномодулиру-ющую, антиоксидантную, а также противоопухолевую, антибактериальную, противогрибковую и противовирусную активность [31-33].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Получение препарата
В качестве исходного сырья для получения гумино-вых веществ использовали лигнинсодержащие материалы (твердые остатки переработки растительного сырья). Материалы подвергали окислительному щелочному гидролизу с последующим отделением жидкой фазы, ее подкислением, отделением полученного осадка, его промывкой и сушкой. Полученный полупродукт подвергали экстракции этилацетатом. Далее проводили экстракцию полученного осадка н-бутанолом. Для выделения и солюбилизации биологически активных фракций, обладающих противовирусной активностью, сухой остаток после испарения бутанола очищали многократным переосаждением из щелочного раствора добавлением концентрированной соляной кислоты. Стандартизацию фракций осуществляли по характерным полосам поглощения в инфракрасной области (наличие специфичных полос поглощения в интервале от 2 до 10 мкм) и мо-лекулярно-массовому распределению (максимум в области 7000 Да). Выход целевого продукта - со-любилизированной бутанольной фракции гуминовых веществ (СБФГ) - составлял ~40%.
Физико-химические методы исследования СБФГ
Элементный состав. Образцы исследуемого соединения доводили до полного растворения при нагревании до 80-1000С в 2 мл азотной кислоты с добавлением нескольких капель пероксида водорода в течение 3 ч. Полученный раствор анализировали методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной аргоновой плазмой на приборе ICAP-9000 (Thermo Jarrell Ash, США).
ГХ-МС-анализ. Навеску СБФГ доводили до полного воздушно-сухого веса и обрабатывали 5 мл толуола в ультразвуковой бане. Экстракты отфильтровыва-
ли, сушили безводным сульфатом натрия и упаривали в токе азота. Часть проб подвергали метилированию. Аликвотную часть образца анализировали с помощью ГХ-МС на комплексе, включающем газовый хроматограф НР5890А, масс-спектрометр НР5988А и систему обработки данных НР59970С (Hewlett-Packard, США). Компоненты пробы идентифицировали с помощью компьютерного поиска и библиотеки масс-спектров Wiley.
ЯМР-спектроскопию выполняли с использованием прибора Bruker Avance 400 MHz NMR.
Клеточные линии
CEM-SS - перевиваемая иммортализованная линия, клонированная из Т4-лимфобластоидной клеточной линии человека путем адгезии с помощью поли-L-лизина, обладающая повышенной способностью к вирус-индуцированному синцитиеобразованию и фузогенной активностью, широко используется для изучения ВИЧ и его ингибиторов (NIH AIDS Reagent Program № 776, США). Клетки культивировали в питательной среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 10% фетальной сыворотки (Sigma, США), 2 мM L-глутамина (Sigma, США).
Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли из обработанной антикоагулянтом (EDTA) цельной крови серонегативного донора путем седи-ментационного разделения при центрифугировании в растворе фиколла (GE Healthcare Worldwide, США). Для заражения вирусом использовали стимулированные митогеном МПК, полученные путем 3-4-дневного культивирования с 5 мкг/мл фито-гемагглютинина (ФГА, Sigma, США). Зараженные клетки культивировали в среде RPMI-1640 c 10% фетальной сыворотки, 100 мкг/мл гентамицина и 50 ЕД/ мл рекомбинантного интерлейкина-2 (IL-2, Sigma, США).
Макрофаги (Мф) человека получали путем адгезии моноцитов из пула МПК (концентрация 1-2 х 106 клеток/мл) после 2 ч инкубации при 370С с последующей дифференцировкой клеток в течение 7-8 дней в присутствии 0.2 мкг/мл GM-CSF (Invitrogen, США) в ростовой среде указанного состава.
Дендритные клетки (ДК) получали путем культивирования моноцитов человека в течение 7 дней в присутствии 20 нг/мл интерлейкина-4 (IL-4, Sigma, США) (фракция моноцитов выделена из МПК с помощью MACS (magnetic cell separation system CD14+; Miltenyi Biotec., ФРГ)). Антигенпрезентирующая функция ДК и моноцитов протестирована путем оценки способности стимулировать аллогенную пролиферацию Т-клеток.
TZM-bl - перевиваемая клеточная линия, полученная из клеток HeLa генно-инженерным путем, экспрессирующая CD4, CXCR4, CCR5 и содержащая Tat-зависимый репортерный ген люциферазы под контролем длинных концевых повторов (LTR) ВИЧ-1 (NIH AIDS Reagent Program № 8129, США).
293T/17 - эпителиальные клетки почки человека, полученные из клеточной линии 293Т. Линия 293Т/17 характеризуется высокой способностью к трансфекции и используется для получения высоких титров инфекционных ретровирусов (ATCC® CRL-11268).
Вирусы. Клетки заражали следующими штаммами ВИЧ-1:
ВИЧ-1/BRU - референсный штамм с фенотипом X4, активно реплицирующийся в Т-лимфобластоидных клеточных линиях, чувствительный к действию AZT (азидотимидин).
ВИЧ-1/AR216 - выделенный от ВИЧ-инфицированного пациента клинический изолят X4-фенотипа, адаптированный к Т-клеточным линиям, обладающий высокой устойчивостью к AZT.
ВИЧ-1/Ba-L - М-тропный штамм R5-фенотипа.
ВИЧ-1/SF-162 - М-тропный штамм R5-фенотипа.
ВИЧ-1/QHO - М-тропный штамм R5-фенотипа, выделенный от пациента в Тринидад и Тобаго.
Биологическую активность вирусных стоков оценивали с помощью титрования по TCID50.
Получение env-псевдовирусов ВИЧ-1
Псевдовирусы получали по описанной ранее методике [34]. Клетки 293Т/17 высевали в концентрации 2 х 106 на флакон Т-75 в 20 мл среды DMEM. После инкубации в течение 24 ч клетки трансфи-цировали 4 мкг плазмиды, экспрессирующей ген env, кодирующий белок оболочки соответствующего подтипа ВИЧ-1, и 8 мкг плазмиды pSG3AEnv без гена env, несущей недостающие гены для сборки псевдовируса ВИЧ-1. Для трансфекции использовали реагент Fugene 6 (Promega, США). После 4 ч инкубации среду для трансфекции заменяли свежей ростовой средой. Содержащие псевдовирус супернатанты собирали через 48 ч и хранили при -800С. Все плазмиды получены из международного репозитория по программе NIH AIDS Reagent Program.
Антиретровирусный TZM-bl-анализ
Анализ нейтрализации env-псевдовирусов проводили с использованием клеток TZM-bl по методу Montefiori [35] - модифицированной версии Wei и соавт. [36]. Свежие трипсинизированные клетки засевали в 96-луночные планшеты в концентра-
ции 1 х 104 клеток/лунка в 100 мкл среды DMEM с 5 мкг/мл DEAE-декстрана. К клеткам добавляли различные разведения исследуемого соединения и инкубировали в течение 45-90 мин при 37°С. Далее клетки инокулировали 150000 RLU (относительные люминесцентные единицы) соответствующего псевдовируса. После 48 ч инкубации клетки промывали средой и лизировали, а затем с помощью люминоме-тра Victor X3 (Perkin Elmer) определяли количество люциферазы в сравнении с контролем. Значения 50% ингибирующей концентрации рассчитывали с помощью GraphPad Prism 6 c использованием функции log (ингибитор) в сравнении с нормированным ответом.
Оценка жизнеспособности клеток
Жизнеспособность клеток определяли с помощью МТТ-теста, суть которого заключается в измерении способности живых клеток превращать хорошо растворимый желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) в нерастворимые внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана. Эффективность такого превращения отражает общий уровень дегидрогеназной активности клеток и в известных пределах прямо пропорциональна концентрации живых клеток [37]. Согласно принятым критериям высокотоксичными считаются вещества, ТД50 которых составляет от 1 до 10 мкг/мл, токсичными - от 11 до 20 мкг/мл, от 21 до 50 мкг/мл умеренно токсичными, от 51 до 100 мкг/мл - слаботоксичными. Вещества с ТД50 более 100 мкг/мл относят к категории нетоксичных.
Определение анти-ВИЧ-активности
При исследовании антивирусной активности клетки в течение 2 ч инкубировали при 37°С в 96-луноч-ных планшетах (Corning, США) с СБФГ в различных концентрациях (10, 1, 0.1 и 0.01 мкг/мл) и затем заражали вирусом с множественностью инфекции 100 TCID50 (Tissue Culture Infection Dose 50). После инкубации в течение 24 ч несвязавшийся вирус удаляли путем низкоскоростного центрифугирования планшета, а осадок клеток ресуспендировали в свежей ростовой среде. За развитием инфекции наблюдали в течение 5 сут, оценивая цитопатический эффект (цитолиз, образование синцития). Уровень ингиби-рования инфекции оценивали методом иммунофер-ментного анализа (ИФА) на основе моноклональных антител к коровому антигену р24 ВИЧ-1. Основной высококонсервативный коровый антиген р24 является признанным маркером ВИЧ-инфекции. В работе мы использовали сертифицированные коммерческие тест-системы Bio-Rad (США) и «Вектор-Бест» (Россия).
ТОМ 11 № 2 (41) 2019 | ACTA NATURAE | 71
Статистическая обработка результатов
Экспериментальные данные получены в трех независимых повторностях, результаты рассчитывали как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Значимость различий между выборками оценивали с использованием теста Колмагорова-Смирнова, одностороннего теста ANOVA и поправки Бонферрони (Origin Pro 2016G, OriginLab Corporation) для экспериментов более чем с 2 подгруппами. Показатели полумаксимальной ингибиру-ющей концентрации (ИД50) и 50% цитотоксической концентрации (ТД50) рассчитывали, исходя из кривых доза-эффект c помощью программ Origin Pro 2016G Softwear и Sigma Plot 12.5 Softwear. Различия считали статистически значимыми при рассчитанной величине р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика химического состава СБФГ
Исследования элементного состава СБФГ выполняли в двух параллельных повторах. Оказалось, что СБФГ - это полиэлементное вещество с повышенным содержанием P и Na (6000 и 10 029 мкг/мл соответственно). Важно отметить практически полное отсутствие тяжелых металлов в исследуемом веществе.
По данным ГХ-МС-анализа в составе СБФГ наиболее представлены жирные и смоляные кислоты. Среди жирных кислот преобладают гексадекановая, октадеценовая и докозановая кислоты (по 1.2 мкг/г). В меньшей степени в СБФГ содержатся октадека-новая, эйкозановая и тетракозановая кислоты (по 0.4 мкг/г). Среди смоляных кислот в анализируемом образце обнаружены три компонента, относящиеся к ряду C20H30O2 (1.6 мкг/г), из которых один компонент можно точно отнести к абиетиновой кислоте (0.6 мкг/г). Остальные являются изомерными структурами в пределах данной брутто-формулы. Две другие смоляные кислоты имеют брутто-фор-мулу: C20H28O2. Наиболее характерный пик на масс-хроматограмме соответствовал дегидролевопимаро-вой кислоте (18 мкг/г).
С помощью ЯМР-спектроскопии фрагментный состав СБФГ был сопоставлен с составом гумино-вых кислот угля (табл. 1). Содержания карбонильных, карбоксильных и сложноэфирных фрагментов в СБФГ сходны с содержанием в гуминовых кислотах угля. Содержание фенольных групп в СБФГ немного выше (11% против 7-9%). Традиционными являются высокие показатели величины соотношений
CCOO-H/CCOO-R и кот°рые отображают сте-
пень гидролизованности структуры. Особенностью
СБФГ является высокое содержание ароматических
Таблица 1. Фрагментный состав СБФГ
Фрагмент Содержание С, %
С 3
C COO-H 10
C COO-R 2
C Ar-OH 11
C Ar-OR 7
C CAr-R 21
CAr-H 27
C O-Alk-O 0
C -CH-OH 3
C -CH2-OH 6
C CH3O 15
фрагментов, при этом ароматическая часть структуры содержит большое количество незамещенных и О-замещенных фрагментов.
Изучение цитотоксических свойств СБФГ
Цитотоксические свойства СБФГ оценивали, культивируя клетки в присутствии различных концентраций этого вещества в течение 3-4 дней, с последующим определением жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста.
Исследование цитотоксичности в трех независимых экспериментах показало, что СБФГ является нетоксичным препаратом, причем как в отношении перевиваемой Т-клеточной линии CEM-SS, так и в отношении первичных клеток (МПК) (табл. 2).
ИД50 - 50% ингибирующая доза, при которой инфекция подавляется на 50%; ТД50 - цитотоксическая доза, при которой 50% клеток утрачивают жизнеспособность; индекс селективности, рассчитывается
Таблица 2. Антивирусная активность, цитотоксичность и индекс селективности СБФГ в перевиваемых и первичных CD4+ Т-клетках
Клетки Штамм Ингибирование репродукции ВИЧ, мкг/мл Цитотоксичность, ТД50> мкг/мл Индекс селек-
ВИЧ ИД90 ИД5с ±SEM R2 тив-ности
CEM- HIV-1BRU HIV-1AR216 5.4 0.8 ± 0.3 0.87 708 865
SS 26.0 4.6 ± 0.55 0.79 154
МПК HIV-1BRU HIV 1AR216 5.3 0.9 ± 0.2 0.91 631 701
11.5 1.04 ± 0.38 0.85 607
Таблица 3. Ингибирование вирусной репликации в клетках TZM-bl, МПК, макрофагах и дендритных клетках, инфицированных штаммами ВИЧ-1^-162, ВИЧ-1^Н0 и ВИЧ-1/Ва-_
Клетки Вирусы Ингибирующая концентрация, мкг/мл
ИД90 ИД80 ИД50 И2*
МПК ВИЧ-1^-162 ВИЧ-1^И0 5.8 60.0 3.0 20.0 0.9 ± 0.25 9.8 ± 2.9 0.89 0.72
Макрофаги ВИЧ-1/Ба^ 1.4 0.9 0.35 ± 0.1 0.78
Дендритные клетки ВИЧ-1/Ба^ 21.0 12.0 6.8 ± 1.3 0.76
Т2М-Ы Псевдовирус SF-162 Псевдовирус QH0 24.0 60.0 - 5.0 ± 0.7 5.0 ± 1.2 0.85 0.87
*R2 приведен для значений ИД50.
как отношение ТД50 к ИД50. Значения И2 приведены для ИД50. Представлены средние данные, вычисленные по результатам изучения цитотоксических свойств и антивирусной активности СБФГ в трех независимых экспериментах.
Исследование антивирусной активности СБФГ на перевиваемых и первичных CD4+ Т-клетках, зараженных чувствительным и устойчивым штаммами ВИЧ-1
Результаты определения ингибирования экспериментальной ВИЧ-инфекции свидетельствуют о том, что СБФГ способен эффективно подавлять инфекцию как AZT-чувствительного (HIV-1/BRU), так и AZT-резистентного штаммов вируса (Н^-1/ AR216) и в перевиваемых, и в первичных клетках (табл. 2). При этом для 50% подавления инфекции AZT-чувствительного штамма и в перевиваемых, и в первичных клетках требуется практически одинаковая концентрация препарата - менее 1 мкг/мл.
Ингибирование инфекции AZT-резистентного штамма несколько отличается в разных клеточных культурах: эффективность СБФГ в большей степени проявляется в МПК, тогда как для снижения инфекции на 50% в клетках CEM-SS концентрация должна быть более высокой. Следует также отметить достаточно высокие значения индекса селективности (600-800), характеризующего перспективность исследуемого препарата, при использовании донорских лимфоцитов (МПК). Эта клеточная модель более предпочтительна, чем перевиваемые клеточные культуры. Ограниченное применение МПК в экспериментальных исследованиях обусловлено рядом причин, основными из которых являются отсутствие стандартизации и вероятность индивидуальной устойчивости к ВИЧ-инфекции (во избежание последней мы использовали для заражения смесь МПК от трех серонегативных доноров).
Изучение антивирусных свойств СБФГ в МПК, макрофагах и дендритных клетках
Дальнейшее исследование антивирусной активности СБФГ проводили на клетках МПК, макрофагах (Мф) и дендритных клетках, которые заражали М-тропными штаммами ВИЧ-1: ВИЧ-1/SF-162, ВИЧ-1/Ба^ и ВИЧ-1^Н0 (табл. 3).
Проведенные исследования позволили оценить эффективность СБФГ в пулах разных иммунных клеток и получить данные, свидетельствующие о различной (дифференциальной) эффективности препарата в этих клетках.
Наиболее чувствительной к действию СБФГ оказалась инфекция в макрофагах, зараженных вариантом R5 ВИЧ-1/Ба^: 90 и 50% ингибирование инфекции наблюдается при достаточно низких концентрациях препарата (табл. 3), тогда как для достижения того же уровня ингибирования инфекции в дендритных клетках, зараженных тем же самым штаммом, требуются в 15-19 раз более высокие концентрации препарата. Как показали наши исследования, подавление инфекции на 90% в МПК, зараженных штаммом SF-162 (фенотип R5), резистентным к нейтрализации антителами, происходит в присутствии 6.0 мкг/мл СБФГ. Следует отметить, что почти такая же концентрация препарата требовалась для 90% ингибирования штаммов ВИЧ-1 фенотипа Х4 (табл. 2). Это наблюдение подчеркивает универсальность СБФГ как анти-ВИЧ-агента в отношении вирусов обоих фенотипов (И5 и Х4). Однако наши исследования показывают, что встречаются штаммы ВИЧ-1, проявляющие большую устойчивость к действию СБФГ. Так, для ингибирования штамма ВИЧ-1^Н0 требуется в 10 раз более высокая концентрация СБФГ в клетках МПК. Наиболее вероятным объяснением этого факта может быть наличие геномных различий у разных штаммов и предсуществующих мутаций, обусловленных естественным полиморфизмом ВИЧ-1.
ТОМ 11 № 2 (41) 2019 | АСТА ^ТиИАЕ | 73
Несмотря на разницу в концентрациях, во всех вирус-клеточных системах при воздействии СБФГ достигается 90% подавление инфекции, что означает защиту существенной части клеток-мишеней, подвергающихся вирусной атаке. Обнаруженные различия в уровне ингибирования инфекции в разных пулах иммунных клеток, не зависящие от фенотипа вируса, говорят, вероятно, о различиях в биодоступности препарата. Неодинаковое проникновение лекарственных препаратов в различные клетки (ткани) - давно известный факт. Следствием этого может быть концентрация препарата, недостаточная (субоптимальная) для ингибирования вируса. Неполное подавление репликации вируса приводит к возникновению условий, благоприятных для селективного отбора резистентных форм. Это необходимо учитывать в доклинических исследованиях новых препаратов и более детально изучать ингибиторы репликации вируса с использованием пулов индивидуальных иммунных клеток, участвующих в патогенезе ВИЧ.
Известно, что при ВИЧ-инфекции наблюдается прогрессирующее уменьшение субпопуляций иммунных клеток, что неизбежно приводит к снижению функций иммунитета, среди которых можно выделить наиболее существенные: антигенпрезентиру-ющую, стимулирующую Т-клеточные пролифера-тивные реакции, регулирующую выработку антител В-клетками. При этом снижается также скорость обновления клеточных популяций. Механизмы гибели иммунных клеток во время острой и хронической инфекции полностью не установлены, но известно, что они, скорее всего, включают прямое инфицирование, апоптоз и действие ЦТЛ. Наши исследования показали возможность почти полного подавления ВИЧ-инфекции (более 90%) с помощью СБФГ, что означает возможность сохранения функциональности иммунной системы. Очень важным результатом данного исследования является также особенно высокая эффективность СБФГ в ингибировании ВИЧ-инфекции в макрофагах. Макрофаги, как и Т-клетки памяти, служат резервуарами вируса, наличие которых составляет главную причину невозможности полной эрадикации вируса и необходимости пожизненной анти-ВИЧ-терапии.
Известно, что субпопуляция Т-хелперов фенотипа 17 (ТЫ7), продуцирующих интерлейкин-17, наиболее чувствительна к заражению ВИЧ и, как следствие, подвержена быстрому истощению
[38]. Интерлейкин-17 играет ключевую роль в поддержании непроницаемости слизистых кишечника
[39]. Утрата ^-17 приводит к деструкции слизистого барьера и увеличению транслокации микробов, что, в свою очередь, приводит к ВИЧ-ассоциированной иммунной гиперактивации [40-43]. Новые знания
об участии фенотипически различных, значимых для патогенеза ВИЧ-инфекции субпопуляций иммунных клеток, открывают новые возможности для оценки анти-ВИЧ-потенциала новых соединений.
Исследование воспроизводимости анти-ВИЧ-эффекта препарата СБФГ
В исследовании эффективности СБФГ немаловажно было понять, не изменяется ли эффективность препарата в сериях, полученных в разное время. Было проверено шесть серий и показано, что разные препараты действуют практически одинаково, до-зозависимо ингибируя ВИЧ-инфекцию в сходных концентрациях с высоким индексом селективности в различных вирус-клеточных системах оценки и с различными вариантами ВИЧ-1: ВИЧ-1/BRU и TZM-bl-псевдовирус (табл. 4, 5 и рисунок).
В трех независимых экспериментах по ингибиро-ванию одноцикловой инфекции в клетках TZM-bl, зараженных псевдовирусами, етеи-последовательности которых соответствуют различным стадиям инфекции/путям заражения и относятся к трем различным подтипам (A, B, C) и двум циркулирующим ре-комбинантным формам ВИЧ-1, показано, что СБФГ активно ингибирует инфекцию. Экспрессионные векторы для получения псевдовирусов выбраны из стандартной панели контрольных штаммов ВИЧ-1 (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program; NIH ARRRP), которые используются в качестве эталонных для оценки нейтрализующих антител и исследования анти-ВИЧ-активности соединений. При этом значения 50% ингибирующей дозы (ИД50) составляют: для Q769.d22 - 0.62-0.75 мкг/мл; для WIT04160.33 - 0.49-0.55 мкг/мл; для CE1176_ A3 - 0.95-1.13 мкг/мл; для 703357.c02 - 0.91-0.98 мкг/мл и для BJ0X002000.03.2 - 0.99-1.19 мкг/мл (рисунок).
Таблица 4. Сравнительная оценка эффективности шести серий СБФГ в экспериментальной ВИЧ-инфекции -СЕМ^/ВИЧ-1^и
СБФГ, серия, № Цитотоксич- ность ТД50 ± SEM, мкг/мл Ингибирующая концентрация, мкг/мл Индекс селективности
ИД90 ИД^ЕМ
2660716 1100.0 ± 123 0.90 0.31 ± 0.012 3548
2640516 1251.0 ± 380 1.10 0.36 ± 0.001 3475
2690816 985.0 ± 210 0.95 0.34 ± 0.021 2897
2680716 1230.0 ± 138 1.00 0.38 ± 0.01 3242
2630416 1150.0 ± 226 0.95 0.35 ± 0.023 3285
2610316 1159.0 ± 195 0.94 0.31 ± 0.15 3738
Таблица 5. Панель псевдовирусов ВИЧ-1, использованных для инфицирования клеток TZM-bl (одноцикловая инфекция)
Изолят Происхождение, страна Подтип Стадия инфекции Способ заражения
Q769.d22-PV Кения A Острая/начальная Половой
WIT04160.33-PV США B II Половой
CE1176 A3-PV Малави C I/II переданный «вирус-основатель» Половой
703357.c02-PV Тайланд CRF01 AE I/II Половой
BJ0X002000.03.2-PV Китай/Пекин CRF07_BC I/II ПИН*
'Потребители инъекционных наркотиков.
Рисунок. Оценка эффективности СБФГ в условиях одно-цикловой инфекции с использованием клеток TZM-bl и пяти псевдовирусных вариантов ВИЧ. Не выявлено статистически значимых различий в ингиби-ровании псевдовирусов протестированными партиями СБФГ, за исключением ингибирования псевдовируса Q769.d22-PV партиями № 2640516 и № 2630416 (*) при р < 0.05
2.0
X
Партия № 2660716 .Партия № 2640516 ■ Партия № 2690816 .Партия № 2680716 Партия № 2630416 Партия № 2610316
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Обобщая полученные данные, можно сказать, что СБФГ эффективно ингибирует экспериментальную ВИЧ-инфекцию, обладает защитным эффектом против различных подтипов и циркулирующих рекомбинантных форм вируса. Надежность метода фракционирования, использованного для получения стандартизированных фракций гуминовых кислот, подтверждена экспериментами с шестью различными сериями препарата.
На Международном съезде по гуминовым веществам в 1988 году ряд ученых предсказывали большое будущее соединениям гуминовой природы в лечении разнообразных болезней [44]. К настоящему времени накоплено достаточно знаний об уникальных свойствах гуматов, обладающих противовос-
палительным и ранозаживляющим, противогрибковым и бактерицидным, и даже противоопухолевым действием. Несмотря на такие уникальные свойства, нельзя сказать, что в последующие годы проводились масштабные научно-исследовательские исследования гуматов. В итоге лишь две компании (американская и российская) создали лекарственные препараты на основе гуминовых веществ со всеми необходимыми доклиническими и клиническими испытаниями их безопасности и эффективности [30]. Данная работа дополняет имеющиеся знания терапевтических свойств таких уникальных природных соединений, как гуматы. •
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ ERA_Net RUS plus № 16-54-76005.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Geissmann F. // Nat. Immunol. 2007. № 8. Р. 558-560.
2. Epelman S., Lavine K.J., Randolph G.J. // Immunity. 2014. № 41. Р. 21-35.
3. Alvarez-Errico D., Vento-Tormo R., Sieweke M., Ballestar E. // Nat. Rev. Immunol. 2015. № 15. Р. 7-17.
4. Wacleche V.S., Tremblay C., Routy J.-P., Ancuta P. // Viruses. 2018. V. 2. № 10. Р. 65.
ТОМ 11 № 2 (41) 2019 | ACTA NATURAE | 75
5. Stevenson M. // J. Neurovirol. 2015. № 21. P. 242-248.
6. Bagasra O., Hauptman S.P., Lischner H.W., Sachs M., Pomer-antz R.J. // N. Engl. J. Med. 1992. № 326. P. 1385-1391.
7. Embretson J., Zupancic M., Ribas J., Burke A., Rack P., Tenner-Racz K., Haase A. // Nature. 1993. № 362. P. 359362.
8. Klatzmann D., Barre-Sinoussi F., Nugeyre T., Dauquet C., Vilmer E., Griscelli C., Brun-Vezinet F., Rouzioux C., Gluck-man C., Chermann J.C. // Science. 1984. № 225. P. 59-62.
9. Siliciano J.D., Siliciano R.F. // J. Clin. Investig. 2000. № 106. P. 823-825.
10. Brenchley M., Hill B., Ambrozak D., Price A., Guenaga F., Casazza J., Kuruppu J., Yazdani J., Migueles S., Connors M., Roederer M., Couek D., Koup R.A. // J. Virol. 2004. № 78.
P. 1160-1168.
11. Chun W., Chadwick K., Margolick J., Siliciano R.F. // J. Virol. 1997. № 71. P. 4436-4444.
12. Schnittman M., Lane H., Greenhouse J., Justement J., Baseler M., Fauci A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. № 87. P. 6058-6062.
13. Tardif M.R., Tremblay M.J. // J. Virol. 2005. № 79. P. 1371413724.
14. Schweighardt B., Roy A.-M., Meiklejohn A., Grace J., Moret-to J., Heymann F. // J. Virol. 2004. № 78. P. 9164-9173.
15. Blauvelt A., Asada H., Saville M., Klaus-Kovtun V., Alt-man D., Yarchoan R., Katz S. // J. Clin. Investig. 1997. № 100. P. 2043-2053.
16. Dittmar M.T., Simmons G., Hibbitts S., O'Hare M., Loui-sirirotchanakul S., Beddows S., Weber J., Clapham P.R., Weiss R.A. // J. Virol. 1997. № 71. P. 8008-8013.
17. Granelli-Piperno A., Delgado E., Finkel V., Paxton W., Stein-man R.M. // J. Virol. 1998. № 72. P. 2733-2737.
18. Zaitseva M., Blauvelt A., Lee S., Lapham C., Klaus-Kovtum V., Mostowski H., Manischewitz J., Golding H. // Nat. Med. 1997. № 3. P. 1369-1375.
19. Geissmann F., Manz M.G., Jung S., Sieweke M.H., Merad M., Ley K. // Science. 2010. № 327. P. 656-661.
20. Bakri Y., Schiffer C., Zennou V., Charneau P., Kahn E., Benj-ouad A., Gluckman J.C., Canque B. // J. Immunol. 2001. № 166. P. 3780-3788.
21. Grossman Z., Meier-Schellersheim M., Paul W.E., Picker L.J. // Nat. Med. 2006. № 12. P. 289-295.
22. Levy J.A. HIV and the pathogenesis of AIDS. Copiring. ASM Press, USA, 2010.
23. Gendelman H.E., Orenstein J.M., Baca L.M., Weiser B., Burger H., Kalter D.C., Meltzer M.S. // AIDS. 1989. № 3. P. 475-495.
24. Bergamini A., Dini L., Capozzi M., Ghibelli L., Placido R., Faggioli E., Salanitro A., Buonanno E., Cappannoli L., Ventura L., Cepparulo M., Falasca L., Rocchi G. // J. Infect. Dis. 1996. № 173. P. 1367-1378.
25. Kwa D., Vingerhoed J., Boeser B., Schuitemaker H. // J. Infect. Dis. 2003. № 187. Р. 1397-1403.
26. Филов В.А., Резцова В.В., Беркович А.М. // Рос. биотерапевт. журн. 2002. Т. 1. № 2.
27. Zhernov Y.V., Kremb S., Helfer M., Schindler M., Harir M., Mueller C., Hertkorn N., Avvakumova N.P., Konstan-tinov A.I., Brack-Werner R., Schmitt-Kopplin Ph., Permi-nova I.V. // N. J. Chem. 2017. № 41. Р. 212-224.
28. Rice J. A., MacCarthy P. A. // Environ. Sci. Technol. 1990. № 24. Р. 1875-1877.
29. Driver S.J., Perdue E.M. // Environ. Eng. Sci. 2015. V. 32. № 1. Р. 66-70.
30. Grimalt J.O., Hermosin B., Inmaculada Y.G., Saiz-Jimenez C. // Sci. Total Environ. 1989. № 81. Р. 421-428
31. Бузлама В.С., Беркович А.М., Бузлама А.В. // Материалы сателлитного симпозиума «Новый отечественный препарат ОЛИПИФАТ». М.: РОНЦ им. Н.Н. Блохина, 2002.
32. Нежинская Г.И., Гавровская Л.К., Беркович А.М., Филов В.А. // Вопросы онкологии. 2005. Т. 51. № 5.
33. Kornilayeva G., Bercovich A., Pavlova T., Karamov E. // XV International AIDS Conf. 2004. 11-16 July, Bangkok, Thailand, abstract book. Р. 167.
34. Scultz A., Koch S., Fuss M., Mazzotta A., Sarzotti-Kelsoe M., Ozaki D., Montefiori D., von Briesen H., Zimmermann H., Meyerhans A. // PLoS One. 2012. V. 7. № 12. P. 1-10.
35. Sarzotti-Kelsoe M., Bailer R.T., Turk E., Lin C.-L., Bilska M., Greene K.M., Gao H., Todd C.A., Ozaki D.A., Seaman M.S., et al. // J. Immunol. Methods. 2014. V. 409. P. 131-146.
36. Wei X., Decker J.M., Liu H., Zhang Z., Arani R.B., Kilby J.M., Saag M.S., Wu X., Shaw G.M., Kappes J.C.// Antimicrob. Agents. Chemoter. 2002. V. 46. № 6. P. 1896-1905.
37. Mossman T. // J. Immunol. Methods. 1993. № 65. Р. 55-63.
38. Mitsuki Y.Y., Tuen M., Hioe C.E. // J. Leukoc. Biol. 2017. V. 101. № 1. Р. 339-350.
39. Guglani L., Khader S.A. // Curr. Opin. HIV AIDS. 2010. № 5. Р. 120-127.
40. Brenchley J.M., Price D.A., Schacker T.W., Asher T.E., Silves-tri G., Rao S., Kazzaz Z., Bornstein E., Lambotte O., Altmann D., et al. // Nat. Med. 2006. № 12. Р. 1365-1371.
41. Dandekar S., George M., Bäumler A.J. // Curr. Opin. HIV AIDS. 2010. № 5. Р. 173-178.
42. Gordon S.N., Cervasi B., Odorizzi P., Silverman R., Aberra F., Ginsberg G., Estes J.D., Paiardini M., Frank I., Silvestri G. // J. Immunol. 2010. № 185. Р. 5169-5179.
43. Vyboh K., Jenabian M.A., Mehraj V., Routy J.P. // J. Immunol. Res. 2015. № 6. Р. 1-9.
44. Visser S.A. // Internat. Humic Substances Soc. Meet. Sevilla, Spain, 1988.
