CC BY
28
Таким образом, широкомасштабное производство и рост объемов внешнеэкономических операций с веществами, потенциально опасными для здоровья населения и состояния окружающей среды, связанные с этим проблемы биобезопасности диктуют все новые требования к обеспечению санитарно-эпидемиологической и экологической безопасности населения нашей страны, и прежде всего в области, нормативно-правового и методического обеспечения, а также технического оснащения лабораторной базы.
Приказ М3 РФ № 325 от 2001 г. - 10. Россия в цифрах. 2003. Краткий статистический сборник. - М.: Госкомстат России, 2003. - С. 363-383. - 11. Соколов С.Ю. // Матер, совещ. по вопр. взаим. в области сан.-карантин, контроля гос.-уч. СНГ и Балтии. - СПб, 2000. - С. 98-102. —12. Устинов И.Н. Мировая торговля. Статистико-аналитический справочник. - М.: Экономика, 2000. - 357 с. - 13. Федоров Ю.М., Кутырев В.В., Топорков В.П. и др. // Гос. сан.-эпид. надзор на транспорте: Матер, междунар. науч.-практ. конф гос.-уч. СНГ. - Одесса, 2003. - 29 с. - 14. Фисенко В.В., Гончарук
Н.Н. // ЗНиСО, инф. бюл. - 2004. - № 1. - С. 18-20. - 15. Wkly Epidem. Rec. - 2004. - Vol. 79, N22. - P. 211-212. - 16. Wkly Epidem. Rec. - 2004. - Vol. 79, N 7. - P. 72-76.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Буланович П.Г. // Гос. сан.-эпид. надзор на транспорте: Матер, междунар. науч.-практ. конф гос.-уч. СНГ. -Одесса, 2003. - 34 с. - 2. Войтенко А.М. // Там же. - С. 44-45. - 3. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности продуктов. Сан.-эпид. правила и нормативы СанПиН 2.3.2.1078-01.- 143 с.-4. Иванов М.П., Курнаев Д.В.//П Межгос. науч.-практ. конф. по взаимодействию стран-уч. СНГ в области сан. охраны территорий. - Алматы, 2001. - С. 54—57. -
5.0 санитарно-эпидемиологической обстановке в РФ в 2003 г.: Гос. докл. - М.: ФЦГСЭН М3 РФ, 2004. - С. 37-59. -
6.0 санитарно-эпидемиологической обстановке в Саратовской области в 2003 г.: Гос. докл. - Саратов, 2004. - С.' 57-79. - 7. Оценка остаточных количеств некоторых ветеринарных препаратов в пище. 48-й докл. комитета экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам. - ВОЗ, Женева. - 1999. -4 с. - 8. Об утверждении Федеральной целевой программы по охране территории РФ. Приказ Гос. ком. сан.-эпид. надзора РФ № 84 от 1994 г. - 9.0 сан.-эпид. экспертизе продукции.
A.E.Shiyanova, V.P.Toporkov, E.V.Kouklev, A.N.Danilov, E.I.Nikonova
Sanitary Protection of Territories:
Inspection of Potentially Hazardous Goods and Cargoes in the Present Situation
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov;
Territorial Agency of Rospotrebnadzor for Saratov Region
Large-scale production and growing volumes of external operations with substances potentially hazardous for people's health and the environments, as well as events connected with offensive activities against sanitary epidemiologic security, call forth the necessity of improving the sanitary-hygienic component of the system of sanitary protection in the territory of Russia.
Key words', sanitary and epidemiologic surveillance, sanitary hazardous cargoes.
Поступила 03.06.05.
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 616.982.27-039
И.Б.Захарова, Д.В.Викторов, О.А.Меринова, Л.К.Меринова, В.В.Алексеев
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ DRUG-EFFLUX ГЕНОВ У ПОЛИРЕЗИСТЕНТНЫХ МУТАНТОВ BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
,1 С использованием обратной транскрипции и последующей амплификации транскриптов в ПЦР был проведен сравнительный анализ экспрессии efflux-детерминант различных типов у исходного штамма В. pseudomallei и мутантов, характеризующихся высоким уровнем устойчивости к антибиотикам различных классов. Мутанты BJpseudomallei 56770 SMR1 и В. pseudomallei 56770 SMR2, в сравнении с штаммом дикого типа, имели повышенный уровень экспрессии последовательностей атгАВ и ЬсгА, кодирующих лекарственные транспортеры RND и MFS семейств, соответственно.
• Ключевые слова: Burkholderia pseudomalle, множественная резистентность, дифференциальная экспрессия генов.
i
Возбудитель мелиоидоза ВигккоШепа р$еи-с1ота1Ш эндемичен для ряда тропических регионов мира, однако спорадические случаи заболевания отмечаются далеко за пределами основного ареала микроорганизма [5]. Инфекция характеризуется широким спектром клинических проявлений [4] и чрезвычайно трудно поддается излечению ввиду высокого уровня природной резистентности возбудителя к химиотерапевтическим средствам [14].
В последнее время опубликован ряд работ, дающих представление о разнообразии генетических механизмов, лежащих в основе лекарственной полирезистентности В. рзеш!ота11е1. У микроорганизма идентифицированы гены |3-лактамаз нескольких типов [8, 12], а также гены efflux-бeлкoв различных классов, ответственных за энергозависимый выброс лекарственных соединений из микробных клеток [3, 11]. Успешное завершение проекта по секвенирова-
нию генома возбудителя мелиоидоза [9] создает новые возможности для развития функциональной геномики данного микроорганизма и, в частности, расшифровки молекулярно-генетических механизмов, определяющих его полирезистентность.
В данной работе мы предприняли попытку сравнительного анализа экспрессии последовательностей генома, гомологичных некоторым известным на сегодняшний день efflux-детерминантам, у исходного штамма В. pseudomallei и его мутантов, отличающихся стабильным сохранением высокого уровня множественной лекарственной устойчивости.
Материалы и методы
Бактериальные штаммы и питательные среды. В работе были использованы штамм В. pseudomallei 56770 дикого типа и мутанты В. pseudomallei 56770 SMR1, 56770 SMR2 и 56770 SMR4, полученные методом направленной селекции на средах с возрастающими концентрациями офлоксацина, пеф-локсацина и цефтазидима и характеризующиеся повышенной, в сравнении с исходным штаммом, резистентностью к антимикробным препаратам различных классов (табл. 1). Культуры бактерий выращивали на Nutrient агаре (NA) и Nutrient бульоне (NB) (Difco).
Таблица 1
Устойчивость исходного и мутантных штаммов В. pseudomallei к антибиотикам различных классов
МПК, мкг/мл
штамм OFX PFX CAZ ТЕТ STR АМР CML
В. pseudomallei 56770 20 25 30 50 650 120 100
В. pseudomallei 56770 SMR1 100 200 120 50 950 640 490
В. pseudomallei 56770 SMR2 150 200 200 50 1800 1100 120
В. pseudomallei 56770 SMR4 200 200 100 75 650 950 1000
Примечание. ОИХ - офлоксацин, РРХ - пефлоксацин, САг-цефтазидим, ТЕТ - тетрациклин, БТІ* - стрептомицин, АМР - ампициллин, СМЬ - хлорамфеникол.
Олигонуклеотиды. Все праймеры, применявшиеся в работе, были синтезированы в НПФ «Ли-тех» (Россия). Нуклеотидные последовательности и характеристика праймеров приведены в табл. 2. Предварительный анализ последовательностей генома В. pseudomallei (вепЬапк асс. N0)06350, N0)06351), гомологичных известным еґПих-детер-
минантам, и специфичности выбранных праймеров предполагаемым генам-мишеням проводили с использованием программного обеспечения Vector NTI Advanced 9.1 (Invitrogen, США) и Artemis v. 7.0 (Sanger Institute, Великобритания, www.sanger.ac.uk).
Выделение РНК. Клетки 24-часовой агаровой культуры суспендировали в 0,15 М NaCl до плотности 2-109 м.к./мл, добавляли равный объем предварительно прогретого при 32 °С NB и подращивали в течение 60 мин. РНК изолировали из 200 мкл бульонной культуры, используя набор «Рибосорб» (Ин-терлабсервис, Россия). От примеси ДНК препараты очищали с помощью RQ1 DNAse (Promega, С1ПА) в соответствии с рекомендациями производителя.
Обратная транскрипция и амплификация. Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили в течение 60 мин при 37 °С в объеме 35 мкл. В состав реакционной смеси входили 100 нг тотальной РНК, 1 мМ каждого dNTP, 200 мкМ SD праймера, 40. ед. обратной транскриптазы M-MulV (Fermentas, Латвия), 1 х реакционный буфер (Fermentas, Латвия), 20 ед. ингибитора рибонуклеаз (Fermentas, Латвия). Реакцию останавливали прогреванием при 70 °С 10 мин; 10 мкл продуктов реакции использовали в ПЦР.
Для постановки ПЦР применяли 1 х ПЦР буфер (Интерлабсервис, Россия), 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого dNTP, 15 пмоль каждого праймера, 1 ед. ДиаТак ДНК-полимеразы (Интерлабсервис, Россия).
ПЦР с праймерами emrEf - emrEr проводили по программе: прогрев 94 °С 2 мин, 40 реакционных циклов (94 °С 40 с, 56 °С 40 с, 68 °С 30 с), удлинение цепи 68 °С 8 мин. Последовательность ЬсгА ам-плифицировали в следующих условиях: прогрев 94 °С 5 мин, 35 реакционных циклов (94 °С 35 с, 55 °С 35 с, 72 °С 40 с), удлинение цепи 72 °С 7 мин. Фрагмент оперона атгАВ-оргА амплифицировали по программе: прогрев 97 °С 2 мин, 35 реакционных циклов (97 °С 30 с, 60 °С 30 с, 72 °С 30 с), удлинение цепи 72 °С 10 мин.
Эффективность реакции ОТ контролировали в ПЦР с использованием SD праймера (0,4 мкМ) при параметрах: прогрев 94 °С 2 мин, 30 реакционных циклов (94 °С 45 с, 40 °С 60 с, 72 °С 60 с), удлинение цепи 72 °С 7 мин.
Анализ продуктов ПЦР. Продукты реакций анализировали в 1,5 % агарозном геле и в денатурирующем 6 % полиакриламидном геле (ПААТ) с 7,0 М мочевины. Полиакриламидные гели окрашивали серебром [2].
1 Праймер
Характеристика олигонуклеотидов и предполагаемых последовательностей-мишеней
Таблица 2
Последовательность
Характеристика
Предполагаемая мишень*
SD
GGGGAACGACGATG Стартовые последовательности бактериальных иРНК [7]
emrEf CCGCCATGACCAACTATCTC Внутренний регион гена emrE P. aeruginosa, 300 п.о. [10] Локус BPSL1861 (qacE, етгЕ), 340 п.о. emrEr GCTGGCCGTAGACGAACATC
Ген ЬсгА В. cepacia, 1100 п.о. [15]
Локус BPSS2120 (ртгА, ЬсгА), 1100 п.о.
bcrAf ATGTCCGCCACCACGGCA
bcrAr ATGCCCCATCGCGCGGGG
amr-f CAGATAGTGCGACGCGGCAA Фрагмент оперона amrR-amrAB-oprA В. pseudomallei. Фрагмент оперона amrR-amrAB-oprA
580 п.о. [11] В. pseudomallei, регион BPSL1804 -
BPSL1805,597 п.о.
amr-r TTCGGCGAGCCCCAGTTGAT
’ Последовательности генома В. pseudomallei, в скобках указаны гомологичные efflux-гены.
1 Результаты и обсуждение
j
Для] сравнительного анализа транскрипционных профилей были выбраны ранее идентифицированный оперон В. pseudomallei amrAB-oprA [11], а также последовательности генома, имеющйе высокую степень гомологии с efflux-детерминантами emrE Р. ае-ragmoW[10] и ЬсгА В. cepacia [15] (табл. 2).
Известные на сегодняшний день транспортные протеины бактерий, обеспечивающие активный выброс лекарственных соединений из клеток во внешнюю среду, на основании сходства их аминокислотных последовательностей, профилей гидрофобности и мембранной топологии относят к нескольким семействам [13]. Так, оперон amrAB-oprA кодирует функционально связанные мембранный транспортер RND-семейства (Resistance-Nodulation-Division) AmrB, вспомогательный периплазматический протеин AmrA и порин наружной мембраны ОргА, участвующие в выбросе из микробной клетки соединений классов аминогликозидов и макролидов, а также некоторых катионных пептидов [11, 13].
Продукт гена ЬсгА представляет собой протеин цитоплазматической мембраны, принадлежащий к MFS-семейству белков (Major Facilitator Superfami-1у), ответственных за транспорт из клеток различных гидрофобных соединений - ряда красителей и антибиотиков, таких как бицикломицин, сульфатиа-зол, хлорамфеникол и некоторых других [13, 15].
Ген етгЕ детерминирует синтез транспортера цитоплазматической мембраны SMR-семейства (Small Multidrug Resistance), определяющего выведение из клетки различных токсических соединений, в частности, липофильных катионов (этидиум бромид, метилвиологен и другие) и антибиотиков тетрациклинового ряда [10, 13].
Электрофореграммы транскриптов атгАВ и последовательностей, гомологичных етгЕ и ЬсгА, представлены на рис. 1. Размеры обнаруженных транскриптов были близки расчетным (табл. 2).
Как следует из полученных данных, гомолог етгЕ В. pseudomallei имел сходный уровень экс-
ЬсгА_____________етгЕ___________атгАВ____
прессии в штамме дикого типа и мутантах с высоким уровнем лекарственной устойчивости, тогда как в отношении экспрессии других efflux-детерми-нант прослеживались выраженные межштаммовые различия (рис. 1). Так, по сравнению с исходным штаммом, повышение уровня экспрессии гомологов ЬсгА отмечено у штаммов В. pseudomallei 56770 SMR2 (максимальный уровень) и В. pseudomallei 56770 SMR1, тогда как у мутанта SMR4 количественная выраженность транскрипта соответствовала штамму дикого типа. Заметный уровень экспрессии атгАВ отмечен у мутантов SMR1 и SMR2, в то же время у исходного штамма и мутанта SMR4 транскрипты данной последовательности визуально не детектировались.
Выявленные межштаммовые различия в экспрессии исследуемых efflux-последовательностей, очевидно, не являются результатом различного количественного содержания РНК и, как следствие, первичных транскриптов в исследуемых пробах, поскольку электрофореграммы продуктов ОТ-ПЦР с праймером SD, проведенной в качестве контроля, имели довольно высокую степень сходства (рис. 2).
Таким образом, обнаруженное возрастание уровня экспрессии генов, ответственных за синтез отдельных лекарственных транспортеров может свидетельствовать о значимой роли механизмов эффлюкса при формировании различных типов множественной лекарственной устойчивости В. pseudomallei. Повышенный уровень экспрессии ЬсгА и атгАВ в отсутствие селективного воздействия, наблюдаемый у части мутантов, возможно, говорит о генетически закрепленных нарушениях механизмов регуляции данных последовательностей. Ранее было показано, что конститутивная экспрессия efflux-оперона mexAB-oprM P. aeruginosa, вызванная мутациями репрессора mexR, приводила к увеличению резистентности микроорганизма к Р-лактамам, аминогликозидам и некоторым неспецифическим ингибиторам [1, 6]. Интересным, на
м
м
Рис. 1. Сравнительный анализ транскрипционных профилей 1 efflux-последовательностей ЬсгА, етгЕ и атгАВ.
I | Электрофорез в денатурирующем ПААГ
Здесь и на рис. 2: М-маркерная ДНК (сверху вниз: 2645, 1605,
1198; 676, 517,460, 396, 350 п.о.); 1-В. pseudomallei 56770;
2 - В. pseudomallei 56770 SMR1; 3 - В. pseudomallei 56770 SMR2;
! 4-В. pseudomallei 56770 SMR4
М
3 4
Рис. 2. Анализ продуктов ОТ-ПЦР с праймером SD. Электрофорез в денатурирующем ПААГ
наш взгляд, представляется исследование роли е^ Лих-детерминант в адаптивной резистентности В. рзеис1ота1Ш к антибиотикам различных классов и формировании стабильных фенотипов множественной лекарственной устойчивости.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Adewoye L., Sutherland A., Srikumar R., Poole К. // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184. - P. 4308^312. - 2. Bas-sam B.J., Caetano-Anolles G., Gresshoff P.M. // Anal. Biochem. - 1991. - Vol. 196. - P. 80. - 3.Chan Y.Y., Tan T.M., Ong Y.M., Chua K.L. // Antimicrob. Agents Chemo-ther. - 2004. - Vol. 48.-P. 1128-1135.-4.Currie B.J., Fisher D.A., Anstey N.M., Jacups S.P.//Trans. R. Soc. Trap. Med. Hyg. - 2000. - Vol. 94. - P. 301-304. - 5. Dance D.A. // Acta Trop. - 2000. - Vol. 74. - P. 115-119. - 6. Evans K., Adewoye L., Poole K. // J. Bacteriol. - 2001. - Vol. 183. - P. 807-812. -7.Fleming J.T., Yao W.H., Sayler G.S. // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol. 64. - P. 3698-3706. - 8. Ho P.L., Cheung Т.К., Yam W.C., Yuen K.Y. // J. Antimicrob. Chemother. - 2002. - Vol. 50. - P. 723-726. -9.HoldenM.T., Titball R.W., Peacock S.J. et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 14240-14245. - 10. Li X. Z., Poole K., Nikaido H. // Antimicrob. Agents Chemother. -2003. - Vol. 47. - P. 27-33. - 11. Moore A., DeShazer D., Reckseidler S., Weissman A., Woods D. E. // Antimicrob. Agents Chemother. - 1999. - Vol. 43. - P. 465-470. -
12. Niumsup P., Wuthiekanun V. // J. Antimicrob. Chemother. - 2002. - Vol. 50. - P. 445^155. - 13. Paulsen I.T., Brown M.H., Skurray R.A. // Microbiol. Rev. - 1996. -Vol. 60. - P. 575-608. - 14. Vorachit M., Chongtrakool P., Arkomsean S., Boonsong S. // Acta Trop. - 2000. - Vol.74. - P. 139-144. - 15. Wigfield S.M., Rigg G.P., Kavari M., Webb A.K., Matthews R.C., Burnie J.P.//J. Antimicrob. Chemother. - 2002. - Vol. 49. - P. 619-624.
I.B.Zakharova, D.V.Viktorov, O.A.Merinova, L.K.Merinova, V.B.Alekseyev
Differential Expression of Drug-Efflux Genes in Polyresistant Burkholderia pseudomallei Mutants
Volgograd Anti-Plague Research Institute
The method of reverse transcription followed by PCR amplification of the transcripts was used to comparatively study the expression of various types of efflux determinants in the original B. pseudomallei strain and its mutants highly resistant to different classes of antibiotics. In contrast to the wild-type strain, B. pseudomallei mutants 56770 SMR1 and 56770 SMR2 were characterized with enhanced expression levels of amrAB and bcrA sequences coding for RND and MFS families drug transporters, respectively.
Key words: Burkholderia pseudomallei, multiple resistance, differential gene expression.
Поступила 26.04.05.
УДК 616.981.51
О.М.Кудрявцева, Н.И.Микшис, Л.В.Новикова, М.Ф.Болотникова, ДЛЗ.Шулепов, Ю.А.Попов
СЕЛЕКЦИЯ СТАБИЛЬНЫХ И ЭФФЕКТИВНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА BACILLUS ANTHRACIS
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Для рекомбинантных бациллярных штаммов с клонированным геном pag, детерминирующим синтез про-тективного антигена сибиреязвенного микроба, изучена стабильность наследования генетической информации in vitro и in vivo. Отобраны стабильные клоны трансформантов с продукцией биологически значимого антигена выше уровня, определенного для исходных вакцинных штаммов. Бациллярные штаммы-продуценты авиру-лентны, вследствие отсутствия репликонов pXOl и рХ02, и синтезируют только протективный компонент токсина Bacillus anthracis.
Ключевые слова: В. anthracis, протективный антиген возбудителя сибирской язвы, генно-инженерные продуценты протективного антигена.
В геноме Bacillus anthracis - возбудителя сибирской язвы содержатся две высокомолекулярные плазмиды - pXOl и рХ02. Элиминация репликона рХ02, кодирующего синтез капсулы, приводит к авирулентности штамма. Плазмида pXOl детерминирует синтез бифункционального экзотоксина. При взаимодействии его компонентов, протеолити-чески активированного протективного антигена с отечным и летальным факторами, происходит образование токсичных комплексов, вызывающих специфическое повреждение тканей организма. Вне комплексов протективный антиген (ПА) безвреден и обладает высоким иммуногенным потенциалом. Для производства химических сибиреязвенных вакцин препарат ПА получают из токсина, продуцируемого в среду выращивания аттенуированными культурами В. anthracis. Но очевидно, что вакцин-
ные штаммы сибиреязвенного микроба, содержащие рХ01, а следовательно, гены синтеза отечного и летального факторов, не могут в полной мере отвечать возрастающим требованиям, предъявляемым к продуцентам биологически значимого антигена. Создание эффективных и безопасных продуцентов возможно путем клонирования гена pag, ответственного за синтез ПА, в штаммах гомо- и гетероло-гичных видов микроорганизмов [3, 5 ,6].
Ранее нами была сконструирована гибридная плазмида рИВ 110РА посредством встраивания участка рХ01, содержащего ген pag, в мультикопийный вектор рИВПО по сайтам рестрикции ВатН1 и селектирован ее вариант риВ110РА-1, обеспечивающий высокую продукцию ПА. Рекомбинантную ДНК с помощью электростимулируемой трансформации ввели в бесплазмидные реципиентные ба-
