CC BY
164
О. Г. Григорук1, В. Н. Богатырев2, А. Ф. Лазарев1, Л. М. Базулина3 ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПО КЛЕТОЧНОМУ СОСТАВУ ПЛЕВРАЛЬНОЙ
ЖИДКОСТИ
1 Алтайский филиал ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН
2 НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 3ГУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер», Барнаул
Изучен цитологический материал, полученный у 2102 больных с накоплением жидкости в плевральной полости. Использованы возможности цитоцентрифуги «Су1^рш-4» и набор маркеров, состоящий из 11 антител. На светооптическом уровне цитологической диагностики отмечены признаки, характерные для ряда злокачественных опухолей. Для дифференциальной диагностики аденогенного рака и ме-зотелиомы необходимо применение иммуноцитохимических методик.
Ключевые слова: опухолевый плеврит, цитоцентрифуга, иммуноцитохимическое исследование.
Микроскопическое изучение экссудатов из серозных полостей проводится во всех клинико-диагностических лабораториях. Однако, несмотря на большие достижения в диагностике, до настоящего времени этот раздел остается одним из наиболее сложных в клинической цитопатологии. Исследование экссудатов вызывает большие трудности в идентификации первичных опухолей плевры, отличии метастатических опухолей от пролиферативных процессов мезотелия реактивной природы [1; 9; 11].
Известно более 50 этиологических факторов, ведущих к появлению жидкости в плевральных полостях. Доля плевритов в структуре общей заболеваемости достигает 3,8% [7; 8]. У хирургических больных этот показатель составляет 10% [5; 6]. Частой причиной накопления выпота у больных в плевральной полости являются злокачественные опухоли. Средняя частота обнаружения опухолевых клеток в плевральных экссудатах у больных с гистологически подтвержденным диагнозом злокачественного образования составляет 42—67% [2; 12]. При высокой квалификации исследователя цитологический метод позволяет обнаружить опухолевые клетки в опухолевых экссудатах в 80—90% случаев, однако точность определения первичной локализации новообразования составляет 50—75%, зависит от уровня дифференцировки первичной опухоли и полноты клинической информации [3; 4].
У значительного числа больных отрицательные результаты цитологического исследования выпота не позволяют исключить опухоль плевры. В связи с этим чрезвычайно важны разработка и внедрение в клиническую практику новых методов обработки жидкостного мате-
© Григорук О. Г., Богатырев В. Н., Лазарев А. Ф.,
Базулина Л. М., 2007
УДК 616.006.04-07:616.25-002:616.076.5
риала, а также применение иммуноцитохимических методов для дифференциальной диагностики.
Целью настоящей работы явилась оценка эффективности цитологического метода диагностики плевритов обычным способом, с использованием центрифуги «Су1^рш-4» и методов иммуноцитохимии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучен цитологический материал, полученный у 2102 больных с плевритом, которые находились на лечении в ГУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» в течение 5 лет (с 2002 по 2006 г.). У 1636 (77,8%) больных были плевриты при химическом, лучевом воздействии, а также бактериальном, вирусном и асептическом воспалении. Злокачественные опухоли серозных оболочек с накоплением плевральных выпотов отмечены у 466 (22,2%) больных: карциноматозный плеврит — у 357, плеврит при злокачественной неэпителиальной опухоли — у 19, плеврит при первичной опухоли плевры (ме-зотелиоме) — у 90.
Цитологические препараты, приготовленные из осадка после центрифугирования жидкости с использованием центрифуги «ОПН-8», окрашивали по Паппенгейму, изучали при световой микроскопии. При необходимости использовали цитоцентрифугу «Су1^рш-4». Монослой-ные препараты готовили только в тех случаях, если при исследовании мазка из осадка, приготовленного на обычной центрифуге, возникали диагностические трудности.
Иммуноцитохимическое исследование проводили по стандартной методике. Для визуализации реакции антиген—антитело использовали стрептавидин-био-тиновую систему «LSAB2» и систему визуализации на полимерной основе «EnVision + ». В качестве хромогена использовали 3,3-диаминобензидин. Для верификации новообразования из серозных полостей был ис-
пользован набор маркеров, состоящий из 11антител: пан-цитокератины (C MNF 116, C AE1/AE3), виментин, моно- и поликлональный раково-эмбриональные антигены (CEA), эпителиальный антиген (Ber-EP4), мезотелин (Mesothelial Cell HBME-1), эпителиальный мембранный антиген (ЕМА), калретинин, тромбомодулин и лейкоцитарный антиген CD15 [2; 10]. Полученные данные были сопоставлены с последующим клиническим течением заболевания с учетом данных канцер-регистра и гистологическим изучением материала первичной опухоли, полученного во время операции.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Клетки пролиферирующего и реактивно измененного мезотелия обнаружены у 1636 больных. Карциноматоз серозных оболочек отмечен у 357 больных, что составило 76,6% всех случаев опухолевых плевритов. Злокачественная мезотелиома плевры была диагностирована у 90 (19,3%) больных, плеврит при злокачественной неэпителиальной опухоли — у 19 (4,1%). Необходимость использования цитоцентрифуги «Cytospin-4» возникла при исследовании материала, полученного у 284 (13,5%) больных. Чаще всего выявляли аденогенный рак — у 317 больных (88,8% всех карциноматозов).
Накопление жидкости в плевральной полости при раке легкого отмечено чаще всего у 197 больных, что составило 55,2% карциноматозов и 42,3% всех наблюдений злокачественных плевритов. Диагностированы следующие карциноматозные плевриты: при аденокарциноме — у 317 больных (легкого — у 166, молочной железы — у 83, яичников — у 41, желудка — у 17, кишечника — у 3, поджелудочной железы — у 1, предстательной железы — у 3, тела матки — у 3), при плоскоклеточном раке легкого — у 13 больных, при мелкоклеточном раке — у 18, при почечно-клеточном раке — у 7, при плоскоклеточном раке пищевода — у 2.
Специфических признаков, характерных для аде-ногенного рака легкого, до настоящего времени не обнаружено. Аденогенный рак легкого характеризуется многомерными комплексами клеток опухоли железистого строения. По степени дифференцировки чаще отмечали умереннодифференцированный аденогенный рак (72,9%). Дифференцированные аденокарциномы легкого отмечали реже (11,4%), в цитологических препаратах наблюдали комплексы из однотипных опухолевых клеток в виде папиллярных структур.
Клеточные элементы плоскоклеточного рака легкого в экссудате наблюдали редко в силу редкого метастази-рования по серозному покрову — всего у 13 пациентов. Опухолевые клетки, находясь в жидкости, подвергаются деструкции, в связи с чем в экссудате обнаруживались зернистые массы детрита, безъядерные чешуйки. Кроме того, определялись воспалительные элементы, среди которых с трудом удавалось обнаружить редкие, отдельно лежащие ракеткообразные клетки опухоли.
Мелкоклеточный рак обнаружен с помощью цитоцентрифуги у 14 из 18 (77,8%) больных. Клетки мелкоклеточного рака, находящиеся в жидкости, имеют сходство с лимфоидными элементами. Обнаружение комплексов клеток с характерным признаком сдавливания друг друга («притертости») позволяет установить их опухолевую природу (рис. 1).
Опухолевые клетки в экссудатах при РМЖ образуют комплексы шаровидной формы с радиальным упорядоченным расположением однотипных опухолевых клеток средней величины округлой формы (рис. 2). Такие патогномоничные структуры обнаружены у 71 больной, что составило 85,5% всех наблюдений метастазов РМЖ в плевру.
Аденокарциному яичников в плевральной жидкости изучали у 41 женщины. В 4 случаях отмечена цистадено-карцинома, в 37 — серозная аденокарцинома. Высокая дифференцировка опухоли наблюдалась у 9 женщин, умеренная — у 24, низкая — у 2. Для цистаденокарци-номы характерны крупные вакуоли в цитоплазме, чаще оптически пустые. При серозных аденокарциномах отмечаются компактные сосочковые структуры и железистые комплексы, единичные клетки с признаками секреции в виде ресничек с одного полюса клетки (рис. 3). Этот признак патогномоничен для рака яичников. Секретирующие клетки встречаются чаще при более дифференцированных формах. Вспомогательным диагностическим признаком являются псаммомные тельца — слоистые известковые образования.
Рисунок 1. Комплекс клеток мелкоклеточного рака легкого среди мезотелия. Плевральная жидкость, окраска по Паппен-гейму (х 400).
Рисунок 2. «Шарообразная» структура при РМЖ. Плевральная жидкость, окраска по Паппенгейму (х 1000).
Опухолевые клетки рака желудка у 13 больных были представлены аденокарциномой, у 4 — перстневидноклеточным раком, при котором клетки принимают фор-
Рисунок 3. Признаки секреции в виде ресничек, расположенных у одного из полюсов клеток, при серозной аденокарциноме яичников. Плевральная жидкость, окраска по Паппенгейму (х 1000).
му перстня с деформированным ядром и вакуолью со слизью, занимающей почти все клеточное тело.
Выпоты при опухолях почек отмечены у 7 больных (2% всех карциноматозов). Особенностью почечноклеточного рака является обильная, интенсивно вакуо-лизированная «кружевная» цитоплазма (рис. 4). При «классическом» светлоклеточном почечноклеточном раке опухолевые клетки лежали разобщенно, реже в скоплениях (5 наблюдений). Дифференцировали клетки почечноклеточного рака от макрофагов и длительно находящихся в жидкости мезотелиоцитов. При зернистоклеточном раке опухолевые клетки напоминают он-коциты (одно наблюдение). В папиллярном варианте почечноклеточного рака (один случай) ретроспективно обнаружили мелкие вакуоли в цитоплазме.
Клетки аденокарциномы в плевральной жидкости цитологически выявлены у 3 больных колоректальным раком. По данным канцер-регистра первичные опухоли локализовались в сигмовидной, слепой и прямой кишке. В цитологическом материале отмечали небольшие комплексы клеток аденокарциномы, специфических характеристик не отмечено. У 3 больных в плевральном выпоте обнаружены клетки злокачественной опухоли, установить гистогенез которых не представлялось возможным. По данным канцер-регистра констатирован рак предстательной железы.
При метастазе рака тела матки в плевральную полость (3 наблюдения) отмечали многомерные комплексы железистого строения, переходящие один в другой.
Рисунок 4. Интенсивно вакуолизированная цитоплазма клеток почечноклеточного рака. Плевральная жидкость, окраска по Паппенгейму (х 400).
В числе метастатических поражений плевры 2 наблюдения рака пищевода (0,6%) и одно (0,3%) поджелудочной железы.
Злокачественные опухоли неэпителиальной природы в 11 случаях представлены неходжкинской лимфомой. В материале из осадка жидкости при лимфоме обнаружены опухолевые клетки лимфоцитарного ряда различной степени зрелости. У 4 больных обнаружены опухолевые клетки саркомы — при первичной плеоморфной рабдо-миосаркоме плеча, мягких тканей грудной клетки, мягких тканей правого бедра и остеогенной саркоме верхней челюсти. В плевральной жидкости отмечали единичные крупные опухолевые клетки неэпителиальной природы. В 4 наблюдениях отмечена эпителиоидноклеточная меланома. При меланоме в экссудате обнаружены полиморфные опухолевые клетки с обильной цитоплазмой, содержащей гранулы меланина.
Злокачественная мезотелиома диагностирована у 90 больных. В 82 (91,1%) случаях определена эпителиальная мезотелиома, в 35 — высокодифференцированная, в 39 — умеренной и в 8 — низкой степени дифференци-ровки. Двухфазная (смешанная) мезотелиома диагностирована в 6 (6,7%) случаях, в 2 (2,2%) — саркомоподобная. Лишь у 24 (26,7%) больных с учетом клинических данных диагноз мезотелиомы был установлен относительно легко, во всех наблюдениях определена умереннодифференцированная эпителиальная мезотелиома. У 17 (18,9%) больных только многократные исследования жидкости позволили обнаружить опухолевые клетки мезотелиомы, в 25 (27,8%) наблюдениях при цитологическом исследовании констатировали злокачественную опухоль, предполагали мезотелиому.
Клеточный состав мезотелиомы чрезвычайно разнообразен. Клетки опухоли имеют большое сходство с железистым раком [13; 14]. При умеренно-дифференцированной мезотелиоме цитоплазма опухолевых клеток разного объема и плотности, во многих клетках мелко ва-куолизирована, с четким просветленным ободком у края. Однотипные мелкие вакуоли в цитоплазме, содержащие жир и гликоген, были обнаружены в исследованиях G. H. Yu, Z. W. Baloch, P. K. Gupta (1999) [15]. Отличительным признаком, характерным для мезоте-лиомы, являются комплексы, которые состоят из тесно прижавшихся друг к другу опухолевых клеток, при этом центральная округлая клетка обхватывается несколькими полулунными (рис. 5).
При высокодифференцированной эпителиальной мезотелиоме отмечали плотные округлые однотипные образования в виде шаров, состоящие из клеток мелкого и среднего размера. Полиморфизм ядер и ядрышек не наблюдался. При низкодифференцированной эпителиальной мезотелиоме был выражен клеточный полиморфизм. Железистоподобные структуры состояли из разного количества клеток — от 4 до 60. В большинстве клеток низкодифференцированной мезотелиомы отме-
Рисунок 5. Центральную округлую клетку охватывают несколько полулунных клеток (умереннодифференцированная эпителиальная мезотелиома). Плевральная жидкость, окраска по Паппенгейму (х 1000).
чали от 1 до 25 мелких уродливых ядрышек в одном ядре. Нередко наблюдали митозы (до 3—4) в поле зрения.
Для двухфазной мезотелиомы (6,7%) были характерны сочетание скоплений опухолевых клеток, которые напоминали описанные нами в эпителиальных мезоте-лиомах, а также наличие клеток, лежащих отдельно или образующих небольшие группы, подобных фибросар-коме. В саркомоподобной мезотелиоме (2,2%) отмечены скопления гиперхромных фибробластоподобных клеток, образующих плотные с небольшими ответвлениями образования.
В 30 наблюдениях дифференцировали мезотелиому от аденогенного рака, из них в 18 с использованием дополнительных методик окраски диагностирована мезотелиома. В 8 из этих наблюдений установлен диагноз аденогенного рака легкого, в 2 — рак яичников, в 2 — РМЖ.
С применением иммуноцитохимического исследования диагностированы 65 (72,2%) случаев мезотелиомы. При проведении реакции на моно- и поликлональный CEA опухолевые клетки были иммунонегативны. В 2 (3,1%) случаях отмечена реакция опухолевых клеток на поликлональный CEA. Отрицательная реакция клеток мезотелиомы отмечена также на Ber-EP4 в 100% наблюдений.
Клетки мезотелиомы во всех 65 (100%) наблюдениях экспрессировали кератины (C MNF 116, C AE1/AE3), мезотелин и виментин (рис. 6). Калретинин и тромбомо-дулин были изучены лишь в 12 наблюдениях мезотелио-мы, и во всех была выраженная положительная реакция.
Рисунок 6. Положительное окрашивание на виментин комплекса клеток высокодифференцированной эпителиальной мезотелиомы. Плевральная жидкость, стрептавидин-биотиновый метод (X 400).
Калретинин отсутствовал в клетках раковых опухолей (в 4 наблюдениях), за исключением серозной папиллярной аденокарциномы яичников (1 наблюдение). Реакция на тромбомодулин также отсутствовала при метастазах железистого рака в 4 наблюдениях. Иммунореактивность в мезотелиомах отмечена на клеточных мембранах при ЕМА и отсутствовала на клеточных мембранах аденокарциномы, где характерно цитоплазматическое окрашивание.
Аденокарцинома диагностирована с использованием иммуноцитохимического метода у 19 больных с накоплением жидкости в плевральной полости. Чаще всего аденокарциномы экспрессируют CEA, Ber-EP4, ЕМА, цитокератины, в то время как реакция на калретинин, мезотелин и тромбомодулин почти всегда отрицательная. Иногда (15,8% наблюдений) отмечалась положительная реакция на CD15 и виментин. При исключении мезотелиомы в 10 наблюдениях отмечен рак легкого. Органоспецифических антител для рака легкого не существует [2]. При метастазе рака яичников (у 5 женщин), так же как и при раке легкого, калретинин, тромбомо-дулин, мезотелин в клетках опухоли не определялся при положительном окрашивании на поликлональный CEA, цитокератины, Ber-EP4. В одном наблюдении реакция с калретинином и тромбомодулином оказалась положительной, что свидетельствует о некоторой мезотелиомо-подобной реактивности.
В 3 исследованиях карциноматозного плеврита при РМЖ иммуноцитохимические реакции были также аналогичны таковым аденогенного рака.
заключение
У 22,2% больных выявлены плевриты на фоне злокачественных опухолей, в том числе карциноматозные плевриты (76,6%), первичные опухоли плевры (19,3%), плевриты при злокачественной неэпителиальной опухоли (4,1%). Карциноматоз отмечен чаще при раке легкого (55,2%), РМЖ (23,2%) и раке яичников (11,5%). Патогномоничные признаки опухоли в плевральной жидкости (прямые или косвенные) отмечены при РМЖ, раке яичников, раке почки, а также при мелкоклеточном и плоскоклеточном раке легкого. Особых признаков, характерных для аденогенного рака легкого, до настоящего времени не обнаружено. Определить патогномоничные признаки при раке кишечника, предстательной железы и эндометрия ввиду редких метастазов в плевру затруднительно. Необходимость использования цитоцентрифуги возникла в 13,5% исследований всех образцов плевральной жидкости. Эпителиальная мезотелиома обнаружена в 91,1% случаев. Мезотелиому удалось диагностировать при использовании дополнительных методов обработки и окрашивания жидкости с использованием иммуноцитохимических методик (72,2% наблюдений). Для злокачественной мезотелиомы наиболее значимы реакции на калретинин, мезотелин, тромбомодулин при положительной реакции на виментин и кератины. Для метастазов аденогенного рака в серозные полости в большинстве наблюдений была характерна положительная иммуноцитохимическая реакция на CEA, Ber-EP4, ЕМА, цитокератины, в то время как реакция на калре-тинин, мезотелин и тромбомодулин почти всегда была отрицательной. Иногда отмечалась положительная реакция на CD15 и виментин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бычков М. Б., Шамилов А. К., Иванова Ф. Г. и др. Мезотелиома плевры и брюшины // Рос. онкол. журн. — 1997. — № 4. — С. 48—51.
2. Глузман Д. Ф., Скляренко Л. М., Надгорная В. А. и др. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей. — Киев: Морион, 2003. — С. 78—88.
3. Добровольский С. Р., Белостоцкий А. В. Диагностика и лечение экссудативного плеврита // Хирургия. — 2002. — № 3. — С. 52—57.
4. Липова В. А., Котов В. А. Дифференциальная диагностика опухолей по клеточному составу серозных жидкостей / Уч. пособ. для врачей. — СПб., 2003. — С. 2—38.
5. Лотов А. Н., Успенский Л. В., Павлов Ю. В. и др. Ультразвуковое исследование в дифференциальной диагностике плевритов // Хирургия. — 2000. — № 2. — С. 41—44.
6. Сыроватко А. С. Пункционная биопсия плевры при плевритах неясной этиологии // Пробл. туб. — 1998. — № 5. — С. 60—61.
7. ЦепаевГ. Н. Эндоскопическая диагностика и тактика лечения экссудативного плеврита: Автореф. дис... канд. мед. наук. — Пермь, 1999. — С. 8—12.
8. Чучалин А. Г. Плевра: патофизиологические и клинические аспекты // Пульмонология. — 1999. — № 1. — С. 6—10.
9. Boutin C., Schlesser M., Frenay C., Astoul P. Malignant pleural mesothelioma // Rev. mal. Respir. — 1999. — Vol. 16, N 6 (suppl. 2).— Р. 1257—1262.
10. Dejmek A., Brockstedt U., Hjerpe A. Optimization of a battery using nine immunocytochemical variables for distingvishing betvin epithelial mesothelioma and adenocarcinoma // APMIS. — 1997. — Vol. 105. — Р. 889—894.
11. Light R. W. Diagnostic principles in pleural disease // Eur. Respir. J. — 1997. — Vol. 10, N 2. — P. 476—481.
12. Melloni G., Puglisi A., Ferrnrori G. M. et al. Il trattamento del mesotelioma pleurico maligno // Minerva. Chir. — 2001. — Vol. 56, N 3. — P. 243—250.
13. Montero Martinez C., Yebra Pimentel M. T. Malignant diffuse mesothelioma: contribution of 23 cases // Rev. Clin. Esp. — 1998. — Vol. 19, N 10. — P. 665—668.
14. Moskal T. L., Urschel J. D., Anderson T. M. et al. Malignant pleural mesothelioma: a problematic review // Surg. Oncol. — 1998. — Vol. 7, N 1 —2. — Р. 5—12.
15. Yu G. H., Baloch Z. W., Gupta P. K. Cytomorphology of metastatic mesothelioma in fine-needle aspiration specimens // Diagn. Cyto-pathol. — 1999. — Vol. 20, N 6. — Р. 328—332.
Поступила 17.04.2007
O. G. Grigoruk1, V. N. Bogatyrev2, A. F. Lazarev1, L. M. Bazulina3 DIFFERENTIATION DIAGNOSIS OF MALIGNANT TUMORS BY CELL COMPOSITION OF PLEURAL FLUID
1 Altai Affiliation of N. N. Blokhin RCRC RAMS, Barnaul
2 Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow
3 Altai Regional Cancer Center, Barnaul
Cytological specimens from 2102 patients with fluid accumulation in pleural cavity were studied using a Cytospin-4 centrifuge and a marker set consisting of 11 antibodies. Cytology by light microscopy discovered specific features for some malignant tumors. Immunocytochemical approaches are needed to differentiate ade-nogenic cancer from mesothelioma.
Key words: neoplastic pleurisy, cytocentrifuge, immunocytochemical study.
