CC BY
219
КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
О. Г. Григорук1, В. Н. Богатырев2, А. Ф. Лазарев1, Л. М. Базулина3 ДИАГНОСТИКА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ МЕЗОТЕЛИОМЫ ПЛЕВРЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
1 Алтайский филиал РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН
2 НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 3 ГУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер», Барнаул
На светооптическом уровне диагностики с использованием иммуноцитохимических методик изучены цитологические характеристики мезотелиомы плевры у 90 больных. Приведены данные о наиболее значимых опухолеспецифичных иммуноцитохимических маркерах в дифференциальной диагностике мезотелиомы и аденогенного рака.
Ключевые слова: мезотелиома, аденокарцинома, дифференциальная диагностика, иммуноцитохи-
мическое исследование.
Заболеваемость мезотелиомой плевры невелика — всего 0,1—3,4 на 100 000 населения [3]. По данным литературы, мезотелиома поражает плевру в 88,8% случаев, брюшину — в 9,6% и перикард — в 0,7% [5]. Злокачественная мезотелиома характеризуется крайне неблагоприятным прогнозом, средняя продолжительность жизни больных составляет 4—12 мес [13; 17]. До настоящего времени ме-зотелиальные опухоли вообще и мезотелиомы плевры в частности представляют определенные трудности в диагностике.
Нередко цитологический диагноз мезотелиомы является единственным морфологическим подтверждением опухоли ввиду возможных осложнений при проведении открытой биопсии легкого. Клетки, полученные для цитологического исследования в выпотах, по существу имеют те же самые характеристики, что и биопсийный материал [11; 18]. С учетом низкой диагностической ценности светооптического цитологического метода, а также того, что торакоскопия технически не всегда выполнима, в практическом здравоохранении ведется поиск дополнительных методов диагностики, позволяющих сокращать затраты времени на выявление возможного альтернативного первичного очага и назначать больному адекватную терапию. Одним из таких методов является иммуноморфология [7].
Актуальной задачей при исследовании экссудатов из серозных полостей на протяжении многих лет является
© Григорук О. Г., Богатырев В. Н., Лазарев А. Ф.,
Базулина Л. М., 2008
УДК 616.25-006.32-076.5:57.083.3
выбор панели маркеров, позволяющих надежно отличить мезотелиальные клетки и гистиоциты-макрофаги от метастатических раковых клеток и клеток злокачественной мезотелиомы. Существуют различные мнения относительно того, какие маркеры должны быть включены в стандартную диагностическую панель для дифференциальной диагностики клеток серозных полостей [8]. Одного специфического онкомаркера для использования в экссудатах из серозных полостей не существует. В настоящее время общепринятым считается набор онкомаркеров, которые позволяют идентифицировать в экссудатах опухолевые клетки аденокарциномы, а также набор онкомаркеров, иммунопозитивных для мезотелиомы. Кроме того, рекомендовано использовать маркеры для идентификации иммунокомпетентных клеток.
Целью настоящего исследования явилось изучение возможностей диагностики мезотелиомы плевры цитологическим методом с использованием иммуноцитохимии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа основана на изучении результатов обследования в течение 5 лет 90 больных мезотелиомой в клинико-диагностической (цитологической) лаборатории ГУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер». Иммуноцитохимические исследования проведены у 65 (72,7%) больных мезотелиомой. В 19 случаях, выбранных в качестве контрольной группы, с использованием иммуноцитохимического метода диагностирована аденокарцинома, в том числе (с учетом клинических данных) — метастазы аденогенного рака легкого (10 случа-
ев), аденокарциномы яичников и молочной железы (6 и 3 случая соответственно).
Доставленную в лабораторию плевральную жидкость центрифугировали по стандартным методикам, окрашивали по Паппенгейму, изучали с помощью светового микроскопа. При проведении иммуноцитохимической реакции препараты изготавливали с использованием цитоцентрифуги «Cytospin-4». На предметные стекла с наличием двух отдельно расположенных окон наносили монослой образца Double Cytoslide с одновременным использованием камер «Double Cytofunnel». Препараты заворачивали в фольгу и помещали в морозильную камеру при температуре —20°С, где хранили до подбора определенного числа пациентов. Контролем необходимого количества опухолевых клеток в Cytoclip-препаратах служили препараты, окрашенные по Паппенгейму.
Иммуноцитохимическое исследование проводили по стандартной методике. Для визуализации реакции антиген—антитело использовали стрептавидинбиоти-новую тест-систему «LSAB2» и «EnVision + ». В качестве хромогена применяли DAB (3,3-диаминобензидин). Для верификации новообразования из серозных полостей был использован набор маркеров, состоящий из 11 антител: пан-цитокератины (Cytokeratin Clone MNF 116, Cytokeratin Clone AE1/AE3), виментин (Vimentin Clone V9), моно- и поликлональный раково-эмбриональные антигены (Carcinoembryonic Antigen — CEA, Clone II-7, Polyclonal CEA), эпителиальный антиген (Epithelial Antigen Clone Ber-EP4), мезотелин (Mesothelial Cell Clone HBME-1), эпителиальный мембранный антиген (Epithelial Membrane Antigen Clone E29 — ЕМА), калре-тинин (Calretinin Clone DAK-Calret 1), тромбомодулин (Thrombomodulin Clone 1009) и лейкоцитарный антиген CD15 (Granulocyte-Associated Antigen Clone C3D-1) [1; 11; 16]. Результаты этих исследований были сопоставлены с клиническим течением заболевания; при этом учитывали данные канцер-регистра и результаты гистологического изучения материала первичной опухоли, полученного во время операции. Последующее гистологическое исследование было выполнено у 36 (40,0%) больных, им-муногистохимическое — у 19 (21,1%). Для проведения иммуногистохимических исследований из парафиновых блоков делали срезы толщиной 4 мкм. Кроме антител, использованных при проведении иммуноцитохимических исследований, в работе применяли моноклональные антитела к р-53 (Clone D0-7) и Ki-67 (Clone MIB-1), а также поликлональные антитела к Her-2/neu. Использовали стандартную методику. В качестве детекционной применяли систему LSABkit с DAB-хромогеном.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Злокачественная мезотелиома диагностирована у 48 (53,3%) женщин и 42 (46,7%) мужчин. Преобладали пациенты старше 50 лет (86,7%). Доброкачественных форм мезотелиомы не было. В лабораторию на исследование
поступала геморрагическая (46; 51,2% случаев), серозная (40; 44,4%) и вязкая желеобразная (4; 4,4%) жидкость в количестве от 8 до 600 мл, максимально 1 л.
В связи с чрезвычайно разнообразным клеточным составом точная диагностика мезотелиомы при светооптическом цитологическом исследовании плевральной жидкости вызывает значительные трудности. С учетом всех имеющихся данных в 82 (91,1%) случаях определена эпителиоидная мезотелиома. Двухфазная (смешанная) мезотелиома диагностирована в 6 (6,7%) случаях, в 2 (2,2%) — саркомоподобная. В практической работе учитывали диагностические критерии мезотелиомы, разработанные Paul Lopes Cardoso в 197З г., а также 8 цитологических признаков, описанных в 1988 г. G. Pedio и U. Lardolt-Weber.
Клетки эпителиоидной мезотелиомы, находящиеся в плевральной жидкости, имеют большое сходство с клетками железистого рака различных локализаций [2; 14]. На светооптическом уровне мезотелиома характеризуется однородностью популяции клеток. Злокачественные клетки располагаются разрозненно или образуют мору-лоподобные структуры. Цитоплазма опухолевых клеток разного объема и плотности, во многих клетках мелко вакуолизирована, у края имеется четкий просветленный ободок. Отличительным признаком мезотелиомы являются комплексы, которые состоят из плотно прижатых одна к другой полулунных клеток, окружающих округлую центральную клетку. Кроме того, для опухолевых клеток мезотелиомы характерно формирование своеобразного просвета — пространства между двумя соседними клетками.
В 42,7% случаев эпителиоидной мезотелиомы отмечали многочисленные мелкие округлые образования в виде шарообразных структур, состоящих из однотипных клеток (рис. 1). Клетки опухоли напоминали неизмененные мезотелиоциты, злокачественный характер которых был не очевиден. В других 57,3% случаев эпителиоидной ме-зотелиомы злокачественные признаки клеток, находившихся в плевральной жидкости, не вызывали сомнений, но определить принадлежность их к мезотелиоме было трудно. Железистоподобные структуры состояли из разного количества клеток с выраженным клеточным и ядерным полиморфизмом. В большинстве клеток мезоте-лиомы отмечали от 1 до 25 мелких уродливых ядрышек в одном ядре. Нередко наблюдали митозы — до 3—4 в поле зрения.
Для двухфазной мезотелиомы (6,7%) характерны 2 типа клеток опухоли: подобные эпителиоидной ме-зотелиоме и отдельно лежащие фибробластоподобные клетки. В саркомоподобной мезотелиоме (2,2%) клеточные скопления из гиперхромных фибробластоподобных клеток, образующих плотные с небольшими ответвлениями образования, напоминали фибросаркому (рис. 2). Саркомоподобная мезотелиома диагностирована у молодых людей в возрасте 11 и 27 лет.
зо
Рисунок 1. Комплексы клеток эпителиоидной мезотелио-
мы. Окраска по Паппенгейму (х 400).
Клетки мезотелиомы во всех 65 (100%) случаях экспрессировали кератины (С MNF 116, С АЕ1/АЕ3), в том числе в фибробластоподобных клетках саркомоподобной мезотелиомы. Кроме того, в 100% случаев в клетках мезотелиомы отмечена положительная цитоплазматическая реакция на виментин. При проведении реакции на
Рисунок 2. Саркомоподобная мезотелиома. Окраска по Паппенгейму (х 400).
моно- и поликлональный CEA опухолевые клетки были иммунонегативными (рис. 3). В 2 (3,1%) случаях отмечена реакция опухолевых клеток на поликлональный СЕА. Отрицательная реакция клеток мезотелиомы отмечена на эпителиальный антиген (Ber-EP4) в 100% случаев (см. таблицу).
Мезотелин (Mesothelial Cell HBME-1) наблюдали во всех 100% случаях мезотелиомы. В нормальном и реактивно измененном мезотелии иммуноцитохимическая реакция с мезотелином происходит на мембранах и в цитоплазме клеток, для неопластических клеток характерна выраженная мембранная реакция [6]. При мезотелиоме клеточные мембраны окрашиваются на эпителиальный мембранный антиген (ЕМА), в отличие от аденокарциномы, для которой характерно цитоплазматическое окрашивание.
Калретинин и тромбомодулин были изучены в 12 (13,3%) случаях мезотелиомы. Реакция на калретинин и тромбомодулин имеет большое значение в дифференциальном диагнозе мезотелиомы. Калретинин выявляли в клетках мезотелиомы, при этом определялось окрашивание ядра и цитоплазмы (рис. 4). Во всех 12 наблюдениях окрашивание было положительным (100%). В контрольной группе аденокарциномы калретинин изучен в 6 случаях. Он отсутствовал в клетках раковой опухоли у 2 больных при метастазе рака легкого, также в 2 наблюдениях при метастазах рака яичников. Однако получена положительная реакция с калретинином и тромбомоду-лином в 2 наблюдениях метастаза серозных папиллярных аденокарцином яичников, что свидетельствовало о не-
Рисунок 3. Иммунонегативная реакция мезотелиомы на СЕА. стрептавидин-биотиновый метод (х 400).
серозных папиллярных аденокарциномы яичников и ме-зотелиомы.
Реакция на тромбомодулин была положительной в 12 случаях мезотелиомы и отсутствовала при метастазах железистого рака в 4 случаях. При обработке антителами к тромбомодулину клеточные мембраны окрашиваются менее четко, чем при обработке антителами к мезоте-лину, в связи с чем положительную реакцию на тром-бомодулин можно пропустить. По данным литературы, экспрессию тромбомодулина по своей диагностической ценности в дифференцировке мезотелиомы и аденокарциномы сравнивают с экспрессией СЕА [10; 12]. Реакция клеток мезотелиомы на лейкоцитарный антиген CD15 во всех наблюдениях была отрицательной (см. таблицу).
Мезотелиому и аденогенный рак дифференцировали в 30 наблюдениях, из них в 18 окончательно диагностирована мезотелиома, в 8 — аденогенный рак легкого, в 2 — рак яичников, в 2 — рак молочной железы.
Для диагностики метастазов аденокарциномы разных органов (19 пациентов) использовали иммуноцито-химическое исследование с антителами к СЕА, Вег-ЕР4 и CD15. На эти антигены клетки мезотелиомы, в отличие от раковых клеток, дают отрицательные реакции [4; 9; 15]. Одним из основных антигенов, экспрессия которых исключает мезотелиому и которые рекомендуют исследовать для диагностики аденогенного рака, является
таблица
Иммуноцитохимические исследования мезотелиомы и аденокарциномы
Иммунологический маркер Иммуноцитохимическаяреакция
при мезотелиоме при аденокарциноме
Моноклональный раково-эмбриональный антиген (Carci-noembryonic Antigen Clone II-7, CEA) Отрицательная Обычно положительная; отрицательная в 33,3% случаев
Поликлональный раково-эмбриональный антиген (Polyclonal Carcinoembryonic Antigen, CEA) Отрицательная (положительная в 3,1% случаев) Положительная
Виментин (Vimentin Clone V9) Положительная только в некоторых опухолях
Эпителиальный мембранный антиген (Epithelial Membrane Antigen Clone E29, ЕМА) Положительная мембранная Положительная цитоплазматическая
Пан-цитокератины (Cytokeratin Clone C MNF 116, Cytokera-tin Clone C AE1/AE3) Положительная с обоими антигенами Более выражена с MNF 116
Эпителиальный антиген (Epithelial Antigen Clone Ber-EP4) стойко отрицательная стойко положительная
Калретинин (Calretinin Clone DAK-Calret 1) стойко положительная Обычно отрицательная, положительная в 33,3% случаев
Мезотелин (Mesothelial Cell Clone HBME-1) стойко положительная Отрицательная
тромбомодулин (Thrombomodulin Clone 1009) стойко положительная Отрицательная
Лейкоцитарный антиген CD15 (Granulocyte-Associated Antigen Clone, C3D-1) стойко отрицательная Положительная в 16,1% случаев
Рисунок 4. Иммунопозитивная реакция на калретинин в мезотелиоме. стрептавидин-биотиновый метод (х 400).
которой мезотелиомоподобной реактивности. Учитывая это, можно предположить родственное происхождение
CEA. Положительная реакция на него клеток опухоли свидетельствует о том, что экссудат вызван развитием метастаза раковой опухоли. Клетки реактивного мезо-телия и мезотелиом оставались неокрашенными в 96,9% случаев. Другим маркером аденокарциномы является эпителиальный антиген (Ber-EP4), реакция которого выражена на мембране и в цитоплазме нормальных эпителиальных клеток и клеток карциномы различного происхождения. Однако экспрессия этих маркеров наблюдается не при всех аденокарциномах, например, при аденокарциноме яичников реакция на моноклональный CEA отсутствует.
Кроме описанных антигенов при иммуноцитохимиче-ском типировании клеток экссудата рекомендовано использовать моноклональные антитела к CD15. Наиболее интенсивная реакция отмечена с клетками гистио-цитарно-макрофагальной природы. В 16,1% случаев отмечены положительная реакция с раковыми клетками и отсутствие реакции с мезотелиальными. Лейкоцитарный антиген CD15 в комплексе с антителами к CEA применяется для дифференциации раковых клеток (CD15 + CEA+) и клеток злокачественной мезотелиомы (CD15 — CEA-) [1; 14].
Во всех 19 наблюдениях контрольной группы диагноз аденогенного рака установлен при гистологическом исследовании первичной опухоли. Злокачественная ме-зотелиома плевры при гистологическом исследовании диагностирована у 36 (40,0%) больных, иммуногистохи-мическое исследование проведено у 19 (21,1%). Нередко цитологический диагноз мезотелиомы является единственным морфологическим диагнозом ввиду возможных осложнений при проведении открытой биопсии легкого.
При иммуногистохимическом исследовании отмечено, что реакция с антителами к Her-2/neu при мезоте-лиоме была отрицательной во всех случаях. Экспрессия супрессорного гена p53 отмечена во всех наблюдениях в количестве 0,58—33,8%, гена Ki-67 — также во всех наблюдениях в количестве 8,75—83,7%. В большинстве наблюдений выявлено 14 митозов в 10 полях зрения, в 1 наблюдении — 4 в 10 полях зрения. Еще в одном наблюдении митотическая активность отсутствовала.
заключение
Использование иммуноморфологии при исследовании серозных жидкостей дополняет и совершенствует цитологическую диагностику, нередко позволяет проводить дифференциальную диагностику между первичными и метастатическими поражениями плевры. При диагностическом иммуноцитохимическом исследовании необходимо правильно определить набор антител для решения поставленных задач, позволяющих идентифицировать опухолевые клетки. При проведении иммуноцитохимических реакций важно получить достаточное количество сохранных опухолевых клеток.
Чтобы избежать потери клеток при проведении реакции, необходимо использовать в работе препараты со специальным адгезивным покрытием (полизиновые) и избегать излишнего физического воздействия на монослой клеток.
Для клеток злокачественной мезотелиомы, находящихся в плевральной жидкости, наиболее значимы реакции на калретинин, мезотелин и тромбомодулин при положительной реакции на виментин и кератины. Для метастазов аденогенного рака в серозные полости в большинстве наблюдений характерна иммунопозитивная реакция на CEA, Ber-EP4, ЕМА, цитокератины, в то время как реакция на калретинин, мезотелин и тромбомодулин почти всегда отрицательная, иногда отмечается положительная реакция на CD15 и виментин.
ЛИТЕРАТУРА
1. Глузман Д. Ф., Скляренко Л. М., Надгорная В. А., Крячок И. А. Диагностическая иммуноцитохимия опухолей. — Киев: Морион, 2003. — С. 78—88.
2. Липова В. А., Котов В. А. Дифференциальная диагностика опухолей по клеточному составу серозных жидкостей. / Учеб. пособ. для врачей. — СПб, 2003. — С. 2—38.
3. Профилактика, ранняя диагностика и лечение злокачественных новообразований. Лекционный курс в рамках подпрограммы «О мерах по развитию онкологической помощи населению Российской федерации» / Под общей ред. акад. РАН и РАМН М. И. Давыдова. — М., 2005. — С. 23—37.
4. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. С. В. Петрова, Н. Т. Райхлина. — Казань: Титул, 2004. — С. 38—60.
5. Akoudad H., Boudel K., Belmadani K. et al. Mesotheliome peri-cardique. A propos d'un cas // Ann. Сardiol. Angeiol. — 1999. — Vol. 48, N 6. — P. 435—440.
6. Ascoli V., Carnovale-Scalzo C., Taccogna S., Nardi F. Utility of HBME-1 immunostaining in serous effusions // Cytopathology. — 1997. — Vol. 8, N 5. — P. 328—335.
7. Betta P. G. The role of immunohistochemistry in the diagnosis of malignant mesothelioma // Monaldi Arch. Chest. Dis. — 1998. — Vol. 53, N 2. — P. 186—187.
8. Brockstedt U., Gulyas M., Dobra K. et al. An optimized battery of eight antibodies that can distinguish most cases of epithelial mesothelioma from adenocarcinoma // Am. J. Clin. Pathol. — 2000. — Vol. 114, N 2. — P. 203—209.
9. Carella R., Deleonardi G., D'Errico A. et al. Immunohistochemical panels for differentiating epithelial malignant mesothelioma from lung adenocarcinoma: a study with logistic regression analysis // Am. J. Surg. Pathol. — 2001. — Vol. 25, N 1. — P. 43—50.
10. Cury P. M., Butcher D. N., Fisher C. et al. Value of the mesothe-lium-associated antibodies thrombomodulin, cytokeratin 5/6, calretinin, and CD44H in distinguishing epithelioid pleural mesothelioma from adenocarcinoma metastatic to the pleura // Mod. Pathol. — 2000. — Vol. 13, N 2. — P. 107—112.
11. Dejmek A., Hjerpe A. Reactivity of six antibodies in effusions of mesothelioma, adenocarcinoma and mesotheliosis: stepwise logistic regression analysis // Cytopathology. — 2000. — Vol. 11, N 1. — P. 8—17.
12. Kennedy A. D., King G., Kerr K. M. HBME-1 and antithrombomodulin in the differential diagnosis of malignant mesothelioma of pleura // J. Clin. Pathol. — 1997. — Vol. 50, N 10. — P. 859—862.
13. Melloni G., Puglisi A., Ferrarori G. M. et al. Il trattamento del me-sotelioma pleurico maligno // Minerva. chir. — 2001. — Vol. 56, N 3. — P. 243—250.
14. Ordonez N. G. Value of the Ber-EP4 antibody in differentiating epithelial pleural mesothelioma from adenocarcinoma. The M.D. Anderson experience and a critical review of the literature // Am. J. Clin. Pathol. — 1998. — Vol. 109, N 1. — P. 85—92.
15. Ordonez N. G. Value of cytokeratin 5/6 immunostaining in distinguishing epithelial mesothelioma of the pleura from lung adenocarcinoma // Am. J. Surg. Pathol. — 1998. — Vol. 22, N 10. — P. 1215—1221.
16. Ordonez N. G. The immunohistochemical diagnosis of epithelial mesothelioma // Hum. Pathol. — 1999. — Vol. 30, N 3. — P. 313—323.
17. Rieck G., Neumann V., Muller K. et al. Lange Uberlebenszeiten bei Patienten mit malignen Mesotheliomen. Gibt es einen Bezug zur histolo-
gischen Subtypisierung? // Atemwegs- und Lungenkrankh. — 2002. — Vol. 28, N 8. — P. 371—372.
18. Travis W. D., Brambilla E., Konrad Muller-Hermelink H.,
Harris C. C. Pathology and Genetics of Tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. — Lyon: IARC Press, 2004. — P. 125—144.
Поступила 17.04.2007
O. G. Grigoruk1, V. N. Bogatyrev2, A. F. Lazarev1, L. M. Bazulina3 THE DIAGNOSIS OF MALIGNANT PLEURAL MESOTHELIOMA BY IMMUNOCYTOCHEMISTRY
1 Altai Affiliation of N. N. Blokhin RCRC RAMS
2 Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow
3 Altai Regional Cancer Center, Barnaul
We performed a light microscopy study using immunocytochemical techniques to describe cytological characteristics of pleural mesothelioma in 90 patients. The paper presents data about most important tumor-specific immunocytochemical markers for the diagnosis of mesothelioma and adenocarcinoma.
Key words: mesothelioma, adenocarcinoma, differential diagnosis, immunocytochemical study.
