CC BY
87
Дифференциальная диагностика ОРВИ методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени
Е.Б. Файзулоев1 ([email protected]), С.А. Лободанов1 ([email protected]), А.А. Никонова1 ([email protected]), А.Н. Каира1 ([email protected]), Г.М. Полухина2 ([email protected]), С.В. Трушакова3 ([email protected]), Е.С. Шевченко3 ([email protected]),
М.А. Калинкина4 ([email protected]), В.В. Зверев1 ([email protected])
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва 2Дзержинская городская больница, г. Дзержинский, Московская область 3НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва "Инновационно-технологический центр «Биологически активные соединения и их применение» РАН, Москва
Резюме
В структуре общей инфекционной заболеваемости на острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) приходится более 90%. Некоторые возбудители ОРВИ, такие как вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, аденовирусы, способны вызывать тяжелые заболевания, нередко сопровождающиеся осложнениями, а среди пациентов групп риска - высокой летальностью. Традиционные методы этиологической диагностики ОРВИ - имму-нофлуоресцентное выявление антигенов вируса, выделение вируса в культурах чувствительных клеток, определение нарастания титра антител в парных сыворотках - имеют ряд серьезных ограничений, связанных прежде всего с недостаточной чувствительностью (иммунофлуоресцентные методы), высокой длительностью, трудоемкостью, неуниверсальностью процедуры (методы культуральный и парных сывороток). В настоящей работе показана высокая диагностическая ценность метода мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени для выявления широкого спектра респираторных вирусов. Мультиплексный формат постановки ПЦР в режиме реального времени значительно сокращает время и стоимость анализа, что делает этот метод удобным и эффективным инструментом эпидемиологического надзора и научных исследований.
Ключевые слова: мультиплексная ПЦР в режиме реального времени, респираторные вирусы, ОРВИ, этиологическая диагностика
Differential Diagnosis of Respiratory Viral Infections by Multiplex Real-Time PCR
E.B. Faizuloev1 ([email protected]) S.A. Lobodanov1 ([email protected]) A.A. Nikonova1 ([email protected]), A.N. Kaira1 ([email protected]), G.M. Poluhina2 ([email protected]) S.V. Trushakova3 ([email protected]) E.S. Shevchenko3 ([email protected]) M.A. Kalinkina4 ([email protected]) V.V. Zverev1 ([email protected])
1 I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, RAMS, Moscow
2 Dzerzhinsky City Hospital, Moscow Region
3 D.I. Ivanovsky Institute of Virology of The Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow
4 Center of Innovations and Technologies «Biologically Active Compounds and Their Applications»of the RAS, Moscow
Abstract
More than 90% of the infectious diseases are acute respiratory viral infections (ARVIs). Most of the ARVIs agents, like influenza viruses, respiratory syncytial virus, parainfluenza viruses and adenoviruses, are able to cause severe diseases, often followed by secondary complications or lethality in high risk patients. The usage of the conventional methods of diagnosis of ARVIs, like immunofluorescent detection of viral antigens, virus isolation by cell culture, serological tests are limited because of their insufficient sensitivity or long duration. In the current study we use our own in-house multiplex real-time PCR assay for detection of a wide range of respiratory viruses, which has high diagnostic value. We found that multiplex format of real-time PCR significantly reduces the duration and cost of analysis and can be effectively used by epidemiological services and academic research organizations.
Key words: multiplex real-time PCR, respiratory viruses, respiratory viral infections, etiological diagnosis
Введение
По данным Роспотребнадзора, в России на долю гриппа и острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) приходится более 90% всех зарегистрированных инфекционных заболеваний. Некоторые возбудители ОРВИ, такие как вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, аденовирусы, способны вызывать тяжелые заболевания, нередко сопровождающиеся осложнениями, а среди пациентов групп риска - высокой летальностью. Затруднения при дифференциальной диагностике этих инфекций вынуждают вести статистический учет по сумме всех случаев, включая их в комплекс ОРВИ. Этиологический диагноз ОРВИ можно поставить только с помощью лабораторных методов. Традиционные методы диагностики ОРВИ - иммунофлуоресцентное выявление антигенов вируса в структурах эпителиальных клеток респираторного тракта, выделение вируса в культурах чувствительных клеток, определение нарастания титра антител в парных сыворотках - имеют ряд серьезных ограничений, связанных прежде всего с недостаточной чувствительностью (имму-нофлуоресцентные методы), высокой длительностью, трудоемкостью, неуниверсальностью процедуры (культуральный метод). Выявление антител к вирусам в сыворотках с помощью твердофазного ИФА является ретроспективным методом и не обнаруживает возбудителя, а регистрирует ответ организма на инфекцию. Таким образом, проблема быстрой дифференциальной диагностики ОРВИ остается актуальной.
Цель настоящей работы - оценить диагностическую ценность метода мультиплексной полимераз-ной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) при дифференциальном выявлении широкого спектра респираторных вирусов: гриппа А (ВГА) и B (ВГВ), парагриппа типов 1, 2, 3, 4 (ВПГ1 - 4), аденовирусов (АДВ), респираторно-син-цитиального (РСВ), риновирусов (РВ), энтеровирусов (ЭВ), коронавирусов (КВ) и бокавирусов (БВ).
Материалы и методы
В работе использованы лабораторные штаммы респираторных вирусов: РВ 16-го типа; ВПГ 2-го и 3-го типов; РСВ (штамм Long); АДВ типов 2, 3, 5, 7 и 8; эталонные и эпидемические штаммы вирусов гриппа: A(H2N2)/Ленинград /549/80, A(H0N1)/ PR/8/34, А(H3N2)/Миссисипи/1/85, A(H2N2)/Q™-гапур/1/57, А(H2N2)/Ленинград/134/57, A(H2N2)/ Краснодар/101/59, А(Н^1)/Чили/1/83, A(H3N2)/ Рязань/6103/86, В/Ленинград/179/86, A(H1N1)/ Соломоновы Острова/3/06, А(H3N2)/Калифор-ния/7/04, А(H3N2)/Техас/1/77, А(Н^1)/Брис-бен/59/07, А(H3N2)/Брисбен/10/07, A(H1N1)/ Москва/80/08, А(H3N2)/Владивосток/6/08, В/ Владимир/25/08, В/Флорида/7/04, В/Малай-зия/2506/04, А(H3N2)/Панама/2007/99; лабораторные штаммы ЭВ: ECHO типов 3, 6, 7 и 30, Кокса-ки В (не типирован), полиовирусы 1-го, 2-го и 3-го
типов (вакцинные штаммы Сэбина). Также в работе использованы образцы РНК РВ типов 2, 8, 14, 15, 16, 17, 20, 59, 70, 72, 86, ВПГ1, ВПГ4, КВ 229Е, КВ ОС43 и ДНК БВ.
Все клинические образцы, использованные в работе (n = 780), представляли собой соскобы или смывы из полости носа детей и взрослых с симптомами ОРВИ и были собраны в течение последних лет (с 2007 по 2011 г.) в различных лечебно-профилактических организациях (ЛПО) на территории г. Москвы и Московской области, а следовательно, содержат актуальные (т.е. циркулирующие в настоящее время) вирусы. В работе также были использованы образцы от людей без симптомов респираторной вирусной инфекции (n = 20). Образцы исследовались на наличие: вирусов гриппа А и В - выделением в культуре клеток MDCK (n = 267), нуклеиновых кислот (НК) 12-ти респираторных вирусов - методом ПЦР-РВ с помощью зарубежного лабораторного образца набора реагентов [13] (n = 226). Часть образцов не анализировалась на наличие респираторных вирусов каким-либо из методов (n = 287).
Анализ нуклеотидных последовательностей, подбор праймеров и зондов проводили с помощью компьютерных программ Vector NTI Advance 9.0 (InforMax Inc., США), FastPCR, а также интернет-программы BLAST (NCBI - Национальный центр биотехнологической информации, США). Праймеры и меченные флуоресцентными красителями зонды были синтезированы в ЗАО «Синтол» (Россия). При постановке обратной транскрипции (ОТ) использовались реактивы фирмы «СибЭнзим» (Россия). При постановке ПЦР-РВ применялась Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ («Синтол», Россия).
Для выделения вирусных РНК и ДНК использовали коммерческие наборы Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Германия), ZR Viral RNA Kit (Zymo Research, США). В основе коммерческих наборов лежит модификация метода выделения НК, предложенная R. Boom с соавт. [6].
Выявление и идентификацию вирусов гриппа А и В в культуре клеток MDCK проводили по методу H.W. Davies с соавт. [10]. Перед заражением монослой клеток дважды отмывали основной средой (среда Игла с глутамином и гентамицином), потом вносили вируссодержа-щую жидкость и инкубировали в термостате при 36 - 37 оС в течение 30 - 60 минут. Затем добавляли поддерживающую среду (основная среда с 2 мкг/мл ТРСК-трипсина 1:1000) и ставили в термостат на 48 - 72 часа. Индикацию вируса осуществляли по развитию цитопатического действия и последующему титрованию в реакции гемагглютинации. Изучение антигенной структуры гемагглютинирующих изолятов проводили в реакции торможения гемагглютинации с использованием референс-штаммов, а также приготовленных к ним сывороток по общепринятому методу, рекомендованному ВОЗ [2].
При постановке мультиплексной реакции ОТ эквимолярную смесь праймеров для ОТ смешивали с 10 мкл РНК (по 2 пмоль каждого праймера) и прогревали в течение пяти минут при 65 °С. Далее в 30 мкл реакционной смеси, содержащей, помимо смеси праймеров и РНК, буфер для ОТ, 0,5 мМ дНТФ, 5 ед. ингибитора рибонуклеаз, 40 ед. ревертазы вируса лейкоза Молони, в течение 30 минут при 42 °C получали кДНК. Фермент инактивировали нагреванием при 95 °C в течение пяти минут. Далее образцы анализировали методом ПЦР-РВ с использованием флуоресцентно-меченных различными красителями зондов TaqMan. Амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, которая содержала 20 мкл 2,5х реакционной смеси для ПЦР-РВ, смесь от двух до четырех пар праймеров (по 6 пмоль каждого праймера), от двух до четырех зондов (по 5 пмоль каждого зонда), 2,5 ед. Hot Start Taq ДНК-полимеразы и 5 мкл кДНК. Реакцию проводили в термоциклере АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, Россия) или ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Программа ПЦР: 95 °C - 120 с; 95 °C - 20 с, 58 °C - 40 c - 45 циклов.
Диагностическую чувствительность набора реагентов рассчитывали определением доли совпавших результатов по отношению к «истинно положительным», выражая ее в процентах. За «истинно положительные» принимали образцы, в которых референтными методами были выявлены респираторные вирусы.
Диагностическая специфичность метода мультиплексной ПЦР-РВ оценивалась по числу отрицательных реакций (в процентах к общему количеству реакций), зарегистрированных при тестировании 20 образцов от людей без симптомов ОРВИ.
Воспроизводимость оценивали при трехкратном тестировании методом мультиплексной ПЦР-РВ 35 образцов и вычислении процента сопоставляемых результатов.
Результаты и обсуждение
Был проведен компьютерный анализ известных геномных последовательностей различных групп респираторных вирусов, на основе которого к консервативным областям вирусных геномов были подобраны последовательности десяти пар праймеров и десяти зондов. Праймеры и зонды были направлены к следующим участкам вирусных геномов: ВГА и ВГВ - к M-гену; РСВ - к гену нуклеопротеина (N); ЭВ и РВ - к 5-нетрансли-руемому участку генома; АДВ - к гену гексона; ВПГ1 - 3 - к гену гемагглютинин-нейраминидазы (HN); ВПГ4 - к гену фосфопротеина. Также были подобраны праймеры и зонд для выявления внутреннего положительного контроля (ВПК), представленного нереспираторным РНК-содержащим вирусом.
Далее были скомпонованы по три реакционных смеси для мультиплексной ОТ и ПЦР-РВ: пер-
вая смесь - для выявления АДВ, ЭВ, ВПК; вторая смесь - ВГА, ВГВ, РВ, РСВ; третья смесь - ВПГ1 - 4. Также были сформированы пулы положительных контрольных образцов, которые наряду с ВПК анализировались при постановке каждой реакции и контролировали все этапы анализа - выделение НК, ОТ и ПЦР. Таким образом, был создан экспериментальный образец набора реагентов (ЭНР) на основе метода мультиплексной ПЦР-РВ для дифференциального выявления НК десяти основных групп респираторных вирусов.
В реакциях моноспецифической и мультиплексной ПЦР-РВ специфичность подобранных прайме-ров и зондов была показана на лабораторных штаммах вирусов, перечисленных в разделе «Материалы и методы». Специфичность ПЦР на стадии разработки тест-системы дополнительно подтверждали элек-трофоретическим анализом ампликонов. Чувствительность выявления НК лабораторных штаммов респираторных вирусов как в моноспецифической, так и в мультиплексной ПЦР-РВ составила 100%.
В работе были определены основные показатели эффективности разработанного ЭНР на основе метода мультиплексной ПЦР-РВ - диагностические чувствительность и специфичность, а также воспроизводимость.
С целью оценки диагностической чувствительности ЭНР панель клинических образцов от больных с симптомами ОРВИ (п = 226) проанализировали с помощью ЭНР и зарубежного (голландского) аналога - лабораторного образца набора реагентов для выявления методом мультиплексной ПЦР-РВ 12-ти респираторных вирусов [9, 13]. ПЦР-анализ позволил выявить различные респираторные вирусы в 51,3 и 50% случаев с использованием ЭНР и зарубежного аналога соответственно. Результаты анализа 226 образцов двумя тест-системами совпали на 97%. Несовпадения в шести случаях были связаны с неодинаковой чувствительностью тест-систем, предположительно обусловленной высоким генетическим разнообразием, характерным для РНК-содержащих вирусов. Один образец, идентифицированный ЭНР как ЭВ, в зарубежной системе был определен как рино-вирус. Диагностическая чувствительность ЭНР в среднем по разным респираторным вирусам составила 95,6%, в частности ВГА выявлялся в образцах с чувствительностью 100%, ВГВ - 97%.
Далее результаты анализа 267-ми клинических образцов от больных с гриппоподобными симптомами традиционными методами (методом изоляции вирусов гриппа А и В в культуре клеток MDCK с последующей идентификацией вируса в РТГА) были сопоставлены с результатами, полученными с помощью ЭНР. В целом вирусы гриппа были выявлены методом мультиплексной ПЦР-РВ в 104 образцах (48 - ВГА и 56 - ВГВ), культуральным методом - в 84 образцах (35 - ВГА и 49 - ВГВ). Результаты выявления вирусов гриппа двумя методами совпали на 89,4%. Следует отметить, что в четырех образ-
цах культуральным методом были идентифицированы вирусы гриппа (два - ВГА и два - ВГВ), тогда как в ПЦР эти образцы были негативными (то есть ложноотрицательными). Вместе с тем наблюдалась и обратная картина, когда выявление РНК-вирусов гриппа в ПЦР-РВ не подтверждалось выделением в культуре клеток. Так, были выявлены 22 образца, в которых методом мультиплексной ПЦР-РВ были идентифицированы РНК ВГА и ВГВ (13 и 9 образцов соответственно), но отрицательные в культу-ральном методе. С целью подтвердить наличие в этих образцах РНК ВГА и ВГВ их повторно анализировали методом ПЦР-РВ, но с праймерами и зондами, направленными к другим генам вирусов (к гену NS2 для ВГА и к гену NP для ВГВ) [13]. Во всех 22-х спорных образцах было подтверждено наличие РНК соответствующих вирусов, что позволило исключить гипотезу о ложноположительных результатах в ПЦР-РВ. Таким образом, в ПЦР-РВ вирусы гриппа достоверно выявлены в большем количестве образцов, чем в культуре клеток (104 против 84), что позволяет сделать вывод о том, что метод мультиплексной ПЦР-РВ не только не уступает в диагностической чувствительности методу выделения вирусов гриппа в культуре клеток, но и превосходит его.
Методом выделения в культуре клеток в 35 образцах были выявлены вирусы гриппа А(Н^1) и A(H3N2) (33 совпадения с ПЦР) и в 49 образцах - вирусы гриппа В (47 совпадений с ПЦР). Таким образом, диагностическая чувствительность метода мультиплексной ПЦР-РВ составила 94,3% для ВГА и 95,9% для ВГВ.
Диагностическая специфичность метода мультиплексной ПЦР-РВ оценивалась по числу отрицательных результатов (в %), зарегистрированных при тестировании 20 образцов от людей без симптомов ОРВИ. Добровольцы для этого теста были отобраны из числа сотрудников НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН. Основным критерием отбора добровольцев для исследования было отсутствие у них симптомов ОРВИ на протяжении не менее чем двух недель. Каждый из 20 образцов анализировали методом мультиплексной ПЦР-РВ на наличие НК 11-ти респираторных вирусов. Общее количество тестов на наличие отдельных вирусов составило 220 (20 х 11), два из которых дали положительный результат - в одном из образцов был выявлен АДВ, в другом - РВ. Значения пороговых циклов 36,6 и 37,2 свидетельствуют о низкой концентрации вирусных НК в образцах, что может быть показателем недавно перенесенной респираторной инфекции либо хронической персистен-ции аденовируса. Диагностическая специфичность метода мультиплексной ПЦР-РВ, рассчитанная на основе результатов выявления 11-ти респираторных вирусов в образцах от клинически здоровых людей, составила 99,1%.
Одним из важных параметров диагностической ценности тест-систем является воспроизводимость
получаемых результатов. С целью оценки воспроизводимости выявления различных респираторных вирусов была сформирована отдельная панель образцов (п = 35), составленная из контрольных образцов для всех анализируемых ЭНР вирусов, клинических образцов с высоким и низким содержанием НК вирусов, а также двумя отрицательными пробами. Воспроизводимость оценивалась при трехкратном тестировании ЭНР 35 образцов. При анализе всей панели получено два отрицательных результата для двух слабоположительных образцов, содержащих вирусы АДВ и РСВ. Расчет, произведенный на основе результатов ПЦР-анализа, позволил оценить воспроизводимость метода как 98,1%.
Таким образом, в результате проведенных лабораторных испытаний на панелях охарактеризованных референтными методами клинических образцов была показана высокая диагностическая ценность метода мультиплексной ПЦР-РВ и используемого ЭНР, в том числе диагностическая чувствительность - не менее 95%, диагностическая специфичность - 99,1% и воспроизводимость - 98,1%.
Результаты анализа ЭНР клинических образцов на наличие НК десяти респираторных вирусов были объединены, что позволило представить результаты исследования 691 образца в обобщенном виде (рис. 1). Так, среди всех проанализированных ЭНР клинических образцов НК ВГВ выявлены в 122 образцах, ВГА - в 73, РВ - в 50, РСВ - в 20, смешанная инфекция - в 18, АДВ - в 16, ВПГ3 - в 13, ВПГ2 - в десяти, ВПГ1 - в шести, ЭВ - в шести, ВПГ4 - в четырех. Доля различных респираторных вирусов в этиологии ОРВИ по результатам ПЦР-анализа 691 клинического образца варьировала от 17,7 (ВГВ) до 0,6% (ЭВ). Доля образцов, в которых были выявлены НК респираторных вирусов, составила 49% от общего количества. На рисунке 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая этиологическую структуру ОРВИ в группе обследованных пациентов.
Диаграмма хотя и не отражает реальную этиологическую структуру ОРВИ в Московском регионе, но дает представление о возможностях метода мультиплексной ПЦР-РВ и основанного на нем набора реагентов. Как видно из диаграммы, все десять вирусов, анализ на наличие которых проводился в процессе лабораторных испытаний, в клинических образцах были выявлены.
ПЦР-анализ панели из 691 образца от больных с симптомами ОРВИ на наличие НК десяти групп респираторных вирусов позволил установить возбудителя всего в 49% случаев, что побудило нас искать вероятные причины гиподиагностики. Возбудителями ОРВИ являются множество вирусов - представителей различных семейств, родов, серотипов и генотипов. Одна из гипотез, объясняющая невысокий уровень диагностики ОРВИ, состояла в том, что список вирусов, анализируемых ЭНР, был неполным и не включал каких-то важных возбудителей ОРВИ. Лабораторные испытания ЭНР
Рисунок 1.
Доля различных респираторных вирусов в этиологической структуре ОРВИ по результатам ПЦР-анализа 691 клинического образца
с использованием референтных методов и аналогов показали, что при проектировании набора не была учтена важная роль в этиологии ОРВИ коро-навирусов и открытых в 2005 году бокавирусов [5], которые не вошли в перечень из десяти групп респираторных вирусов, анализ на наличие которых должен был обеспечивать ЭНР.
С целью проверить эту гипотезу были дополнительно спроектированы последовательности прай-меров и зондов для выявления РНК КВ (к гену NSP13) и ДНК БВ (к гену VP1), показана их специфичность на контрольных образцах и принципиальная возможность их введения в состав ЭНР. На наличие РНК КВ и ДНК БВ был проведен ПЦР-анализ клинических образцов, по результатам которого доля образцов, в которых была определена РНК КВ, составила 6,7% (24 из 356), а ДНК БВ - 19,1% (17 из 89). По данным научной литературы, частота выявления ДНК БВ у детей разных возрастных групп составляет от 3 до 19% [1, 8, 11], а РНК КВ - от 2,5 до 10% [4, 9]. Приведенные данные показывают, что дополнение ЭНР компонентами для выявления бокавирусов и коронавирусов позволяет значительно увеличить долю случаев ОРВИ с установленной этиологией и повысить эффективность дифференциальной диагностики ОРВИ.
В состав ЭНР были введены компоненты, позволяющие дополнительно выявлять КВ и БВ, что потребовало увеличения количества реакционных смесей, необходимых для ПЦР-анализа (с трех до че-
тырех). Распределение вирус-специфических прай-меров и зондов по реакционным смесям представлено в таблице 1.
Первоначальный вариант ЭНР, предназначенный для дифференциального выявления десяти групп респираторных вирусов, при анализе 691 респираторного образца обеспечил выявление НК различных респираторных вирусов в 338 случаях (49%). При анализе дополнительно собранной панели клинических образцов (п = 89) на наличие 12-ти респираторных вирусов (в том числе КВ и БВ) доля образцов, в которых были выявлены НК респираторных вирусов, составила уже 66,3%. В отечественной и зарубежной литературе, описывающей применение метода ПЦР для этиологической диагностики ОРВИ, частота выявления респираторных вирусов варьирует от 24 до 92% [3, 7, 12, 13].
В ходе лабораторных испытаний ЭНР было отмечено, что частота выявления респираторных вирусов в образцах, полученных из различных ЛПО, существенно различалась - этот показатель варьировал от 10 до 84%. Одним из возможных объяснений такой разницы может быть несоблюдение правил сбора, хранения и транспортировки клинических образцов в отдельных ЛПО. Сущность этих правил заключается во взятии образца не позднее 3 - 5-го дня с момента появления симптомов ОРВИ, соблюдении инструкции по взятию образца, незамедлительном замораживании образца, транспортировке и хранении до постановки
Таблица 1.
Распределение вирус-специфических праймеров и зондов по реакционным смесям 1 - 4
Краситель Реакционная смесь
FAM АДВ - ВПГ4 В ГА
R6G ЭВ ВГВ ВПГ3 -
ROX КВ РСВ ВПГ2 БВ
Cy5 ВПК РВ ВПГ1 -
анализа при температуре не выше -20 °С. В связи с этим представилось интересным оценить частоту выявления респираторных вирусов в образцах, полученных участниками коллектива разработчиков ЭНР от себя и членов своих семей, поскольку в данном случае правила сбора, хранения и транспортировки клинических образцов в большинстве случаев были соблюдены. С этой целью была составлена выборка из 28 образцов (19 образцов от взрослых и девять - от детей) от людей с симптомами ОРВИ и проанализирована методом мультиплексной ПЦР-РВ. Доля образцов, положительных по НК респираторных вирусов, составила для этой выборки 71,4% (из 28 образцов - 20 положительных, в том числе шесть образцов от детей и 14 - от взрослых). Относительно большая доля положительных результатов по данной выборке служит косвенным подтверждением того, что одним из важнейших факторов, влияющих на эффективность ПЦР-диагностики, является соблюдение правил сбора, хранения и транспортировки клинических образцов.
Образцы, в которых не были обнаружены НК респираторных вирусов, могут также содержать не столь распространенные или малоизученные вирусы, анализ на наличие которых в настоящей работе не проводился. Следует также заметить, что в настоящей работе образцы не анализировались на присутствие в них бактериальных патогенов, некоторые из которых, наряду с вирусами, способны вызывать заболевания с симптомами ОРВИ.
Важно отметить, что среди положительных образцов, проанализированных на наличие от 10-ти до 12-ти респираторных вирусов, было выявлено преимущественно по одному вирусу. Смешанная инфекция определялась только в 2,5 - 5% случаев и была представлена в основном сочетаниями двух вирусов. Это свидетельствует о высокой специфичности ПЦР-РВ-анализа и отсутствии перекрестных реакций между праймерами, зондами и РНК негомологичных вирусов. Сочетания вирусов в образцах, в которых выявлена смешанная инфекция (ВГВ + РСВ, АДВ + ВПГ2, ЭВ + ВПГ4, ВГА + ВПГ1, ВГА + РВ, ВПГ4 + РВ, ВГВ + ВГА, БВ + РВ и др.), представлены в основном вирусами разных семейств и филогенетически отдаленных групп, что исключает возможность выявления двух вирусов в
результате неспецифического отжига праймеров и зондов.
Применение мультиплексной ПЦР-РВ эффективно дополняет классические вирусологические методы и может применяться эпидемиологическими службами для быстрой расшифровки вспышек ОРВИ и мониторинга эпидемиологической обстановки. Внедрение разработанного ЭНР в вирусологических лабораториях Центров гигиены и эпидемиологии Ро-спотребнадзора позволит улучшить качество эпидемиологических исследований, повысить процент респираторных заболеваний с установленной этиологией, что в конечном счете позволит с большей эффективностью планировать профилактические и противоэпидемические мероприятия.
Быстрая этиологическая диагностика ОРВИ создаст предпосылки для своевременного реагирования санитарно-эпидемиологических и медицинских служб на изменение эпидемиологической ситуации. Применение мультиплексной ПЦР в диагностике инфекций дыхательных путей позволит совершенствовать медицинскую помощь, назначать препараты для этиотропного лечения, снизить частоту неоправданного назначения антибактериальных препаратов.
Выводы
1. Разработан набор реагентов, позволяющий методом мультиплексной ПЦР-РВ в четырех пробирках выявлять в клинических образцах 12 основных возбудителей ОРВИ: ВГА, ВГВ, ВПГ1, 2, 3 и 4, АДВ, РСВ, РВ, ЭВ, КВ и БВ.
2. Установлено, что диагностические чувствительность, специфичность и воспроизводимость набора реагентов на основе метода мультиплексной ПЦР-РВ составляют в среднем для различных респираторных вирусов 95, 99 и 98%.
3. Выявление в клинических образцах вирусов гриппа методом мультиплексной ПЦР-РВ не уступает по чувствительности культуральному методу, а диагностическая чувствительность выявления вирусов гриппа А и В составляет в среднем 95%.
4. При строгом соблюдении правил сбора, хранения и транспортировки клинических образцов выявить вероятного возбудителя методом мультиплексной ПЦР-РВ можно в 70 - 80% случаев ОРВИ.
Литература
1. Мажуль Л.А., Исаева Е.И., Злобин В.И., Вязов С.О. Бокавирус человека // Вопросы вирусологии. 2009. Т. 54. № 6. С. 4 - 8.
2. Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. МУ 3.3.2.175803. Утв. 28.09.2003 г.
3. Яцышина С.Б., Шипулин Г.А. Совершенствование лабораторной диагностики гриппа и ОРЗ / Сборник научных работ: Грипп и гриппопо-добные инфекции. - СПб.: Роза мира, 2008. C. 43 - 49.
4. Abdul-Rasool S., Fielding B.C. Understanding human coronavirus HCoV-NL63 // Open Virol. J. 2010. V. 4. R 76 - 84.
5. Allander T., Tammi M.T., Eriksson M. et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102 (36). P 12891 - 12896.
6. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M. et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P 495 - 503.
7. Freymuth F., Vabret A., Cuvillon-Nimal D. et al. Comparison of multiplex PCR assays and conventional techniques for the diagnostic of respiratory virus infections in children admitted to hospital with an acute respiratory illness // J. Med. Virol. 2006. V. 78. P. 1498 - 1504.
8. Fry A.M., Lu X., Chittaganpitch M. et al. Human bocavirus: a novel parvovirus epidemiologically associated with pneumonia requiring hospitalization in Thailand // J. Infect. Dis. 2007. V. 195 (7). P 1038 - 1045.
9. Gaunt E.R., Hardie A., Claas E.C. et al. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method // J. Clin. Microbiol. 2010. V. 48 (8). P. 2940 - 2947.
10. Davies H.W., Appleyard G., Cunningham P et al. The use of a continuous cell line for the isolation of influenza viruses // Bull. World Health Organ. 1978. V. 56 (6). P 991 - 993.
11. Longtin J., Bastien M., Gilca R. et al. Human bocavirus infections in hospitalized children and adults // Emerg. Infect. Dis. 2008. V. 14 (2). P 217 - 221.
12. Robin B., Sandra N., Sigvard O. et al. Multiplex real-time PCR for detection of respiratory tract infections // J. Clin. Virol. 2008. V. 41. P. 53 - 56.
13. Templeton K.E., Scheltinga S.A., Mattihias F.C. et al. Rapid and sensitive diagnosis of influenza A, influenza B, respiratory syncytial viruses 1, 2, 3 and 4 infections by multiplex real-time PCR // J. Clin. Microbiol. 2004. V. 42. P. 1564 - 1569.
информация роспотребнадзора
о совершенствовании эпиднадзора и профилактики дифтерии, столбняка, коклюша
Приказ от 28.12.2011 г. № 947 (извлечения)
В соответствии с решением коллегии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 16.12.2011 г. и в целях совершенствования эпидемиологического надзора и профилактики дифтерии, столбняка, коклюша п р и к а з ы в а ю:
1. Руководителям управлений Роспотребнадзора по субъектам РФ, Главным врачам ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъектах Российской Федерации совместно с руководителями органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации:
1.1. Организовать тщательное расследование каждого случая заболевания коклюшем с установлением предполагаемого источника заражения, особенно среди детей первого года жизни.
1.2. Обеспечить взятие, транспортировку биологического материала и проведение диагностических исследований на дифтерию и коклюш строго в соответствии с действующими нормативными и методическими документами, предусмотрев наличие в лабораториях, осуществляющих диагностические исследования на коклюш и дифтерию, необходимого набора питательных сред, контрольных штаммов и расходных материалов.
1.3. Проводить периодическое тематическое обучение специалистов бактериологических лабораторий лечебно-профилактических организаций и ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» с обязательным проведением практических занятий по лабораторной диагностике дифтерии и коклюша и тестовым контролем знаний.
1.4. С целью оценки эффективности иммунизации проводить серологический мониторинг напряженности коллективного иммунитета против дифтерии, столбняка и коклюша в индикаторных группах населения в соответствии с нормативными и методическими документами.
1.5. Проводить широкое информирование населения о мерах профилактики дифтерии, столбняка и коклюша и негативных последствиях отказов от проведения профилактических прививок.
2. Руководителям управлений Роспотребнадзора по субъектам РФ рекомендовать руководителям органов управления здравоохранением субъектов РФ:
2.1. Пересмотреть планы профилактических прививок против дифтерии и столбняка, предусмотрев обязательное планирование иммунизации неработающего населения трудоспособного возраста и пенсионеров, мигрантов, социально дезадаптированных лиц. Обеспечить достоверность представляемых отчетных сведений об иммунизации. Провести анализ обоснованности причин непривитости детей и взрослых против дифтерии.
2.2. Обеспечить соблюдение интервалов между прививками АКДС-вакциной не более 3,5 - 4 мес при вакцинации детей в декретированные сроки.
< ... >
4. Руководителям управлений Роспотребнадзора по субъектам Северо-Кавказского и Дальневосточного федеральных округов совместно с руководителями органов управления здравоохранением субъектов Северо-Кавказского и Дальневосточного федеральных округов организовать проведение лабораторного подтверждения диагноза «коклюш».
5. Руководителям управлений Роспотребнадзора по Воронежской, Мурманской, Омской, Свердловской областям, Республикам Тыва, Коми, Ингушетия, Санкт-Петербургу, Ханты-Мансийскому и Ненецкому автономным округам провести анализ причин низких уровней защищенности от дифтерии отдельных групп детей и взрослых.
6. Руководителю управления Роспотребнадзора по Калужской области (А.А. Кручинин) совместно с органами управления здравоохранением Калужской области:
6.1. Провести анализ допущенных нарушений в схемах иммунизации детей первого года жизни против дифтерии и коклюша в связи с задержками поставок вакцины АКДС в 2011 году на территорию Калужской области.
6.2. Во взаимодействии с территориальным органом Федеральной миграционной службы определить численность мигрантов, прибывающих на территорию Калужской области, для организации иммунизации лиц, не имеющих прививок против дифтерии и столбняка.
7. Директору ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (В.А. Алёшкин):
< . >
7.5. Продолжить совместно с НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН изучение иммунологических свойств набора кандидатных штаммов для решения вопроса о включении их в состав вакцины АКДС и бесклеточной коклюшной вакцины.
7.6. Представить в срок до 01.05.2012 г. в Роспотребнад-зор на утверждение проект пересмотренных методических указаний МУ 4.2.698-98.
8. Директорам ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (В.А. Алешкин), ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (И.А. Дятлов), ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Л. Пастера» Роспотребнадзора (А.Б. Жебрун), ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Ро-спотребнадзора (В.И. Покровский):
8.1. В срок до 01.03.2012 г. представить в Роспотребнад-зор предложения по доработке и внедрению в практику ускоренных молекулярно-генетических методов диагностики дифтерии и коклюша, а также по внедрению метода ИФА для углубленной оценки состояния антитоксического иммунитета.
8.2. В срок до 01.04.2012 г. представить в Роспотребнад-зор предложения об организации системной работы с заинтересованными учреждениями стран СНГ, ШОС, Тамо-
