CC BY
13
V.A.Aivazyan!, D.S.Khlgatyan1, E.A.Arakelova1, L.A.Manukyan!, G.V.Tsakanova1, R.V.Badalyan2
DEPRESSION OF THE COMPLEMENT ACTIVITY IN BLOOD SERUM OF WORKERS ENGAGED IN THE
CHLOROPRENE RUBBER PRODUCTION
institute of Molecular Biology, National Academy of Sciences, Republic of Armenia 2Medical Sanitary Room, Industrial Plant «NAIRIT», Erevan
Parameters of the immune status were studied in workers engaged in the production of chloroprene rubber and in people working in districts distant from the industrial part of the city. A method of immunofermental analysis was used to determine the complement activity applying conventional, alternative and lectin ways of activation. The outcome of the investigation revealed the depression of the conventional way of activation in workers occupied in the production of chloroprene rubber.
УДК 616-008.922.1-092:582.251.76
В.Г.Зайцев, Б.В.Меклеева, О.В.Островский
ДИЭТИЛДИТИОКАРБАМАТ НАТРИЯ, ПРОНИКАЮЩИЙ ИНГИБИТОР СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ, УСИЛИВАЕТ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ инфузорий рлялмЕстмсливлтим К ИНДУЦИРОВАННОМУ ОКИСЛИТЕЛЬНОМУ СТРЕССУ
Волгоградский государственный медицинский университет
Показано, что индукторы окислительного стресса NaOCl и реактивы Фентона снижают численность инфузорий Paramecium caudatum. Предварительная обработка инфузорий проникающим ингибитором супероксиддисму-тазы значительно повышает их чувствительность к токсическому действию индукторов окислительного стресса.
Ключевые слова: окислительный стресс, инфузории, гипохлорит натрия, гидроксильный радикал, супероксиддисму-таза.
Введение. В настоящее время инфузории широко используются в токсикологических исследованиях [1, 9]. Вероятно, это связано с тем, что парамеции обладают высокой чувствительностью к изменениям внешней среды. Известно, что многие токсические вещества способны вызывать развитие окислительного стресса в живых клетках [5, 6, 8]. Некоторые индукторы окислительного стресса могут проникать через плазматическую мембрану живых клеток и подавлять функциональную активность антиоксидантной системы. Так, например, диэтилдитиокарбамат натрия (ДЭДТК-Na) является эффективным ингибитором медь-содержащей и железо-содержащей су-пероксиддисмутазы (СОД) [7]. Снижение функциональной активности антиоксидантной системы способствует повышению чувствительности клеток к различным индукторам окислительного стресса [3]. Однако исследования подобного рода на простейших не проводили.
Целью нашей работы была оценка возможного влияния обработки клеток инфузорий ДЭДТК-Na на их жизнеспособность при индукции окислительного стресса различными источниками активных форм кислорода.
Материалы и методы исследования. Культуру клеток Paramecium caudatum (дикий штамм)
выращивали на среде Лозина—Лозинского [4] с добавлением дрожжей Saccharomyces cerevisi-ae в качестве источника питания. Клетки, взятые в стационарной фазе роста, инкубировали с ДЭДТК-№ в концентрациях 10 мкМ или 100 мкМ (30 мин), затем — с окислителями (45 мин). Для индукции окислительного стресса использовали: №ОС1 (конечная концентрация 44 мкМ) и реактивы Фентона Си804 (10 мкМ) + Н202 (7,5 мкМ) или соль Мора (10 мкМ) + Н202 (7,5 мкМ). Для оценки эффектов действия исследуемых веществ использовали выживаемость клеток, а также линейную скорость их движения. 100 мкл культуры распределяли в виде 6—10 капель на сухом стекле и окрашивали 100 мкл 0,05% спиртового раствора йода. Концентрацию живых клеток парамеций определяли подсчётом клеток под увеличительным стеклом +4,5 Д. Для повышения точности оценки количества и подвижности живых инфузорий была разработана специальная установка, состоящая из видоизмененной камеры Горяева, микроскопа и веб-камеры, которая позволяет подсчитывать число инфузорий, попадающих в поле зрения микроскопа, а так же их линейную скорость движения [2]. При оценке выживаемости за единицу принимали число клеток в интактной культуре (без
а)
1200-
б)
контроль
ШОмкМ ДЭШК-Na 10мкМ ДЭДТК-Na
100 плкМ ДЗДТК-Ма 10 мкМ ДЭДТК-Na
Рис. 1. Влияние обработки ДЭДТК-Na (время инкубации 30 мин) на численность интактных инфузорий Р. caudatum в культуре (а) и скорость их движения (б). Усредненные данные представлены в виде медианы с указанием 95% ДИ
а)
б)
контроль «ОмкМ ДЭДТК-Na ЮмиН ДЭДТК-Na окислитель
+ОКИСП ягель +ОКИСЛИТ9ЛЬ
контроль ЮрииИ ДЭДТК-Na ЮшН ДЭДТК-Na йы,Слитвль +о«»слитель «окислитель
Рис. 2. Влияние прединкубации культуры Р. саи^аШт с ДЭДТК^э на выживаемость инфузорий в условиях индукции окислительного стресса реактивами Фентона состава 10 мкМ CuSO4 + 7,5 мкМ H2O2 (а) и 10 мкМ соли Мора + 7,5 мкМ H2O2 (б). Усредненные данные представлены в виде медианы с указанием 95% ДИ
индукции окислительного стресса). Статистическую значимость различий в величинах показателей между различными группами оценивали с использованием критерия Манна—Уитни; отличия считали статистически значимыми при р < 0,05. Обобщенные данные представлены в виде медианы с указанием 95%-го доверительного интервала (95% ДИ).
Результаты и обсуждение. При выращивании инфузорий в интактных условиях ДЭДТК-Ма в исследуемых концентрациях не проявил токсического действия. По нашим данным в отсутствие индукторов окислительного стресса ДЭДТК-Ма в концентрациях 10 мкМ и 100 мкМ статистически значимо не влиял на рост и жизнеспособность инфузорий, а также не изменял скорость их движения (рис. 1). В то же время инфузории, подвергнутые действию ДЭДТК-Ма, обладали существенно более высокой чувствительностью к действию окислителя по сравнению с интактными парамециями.
Индукция окислительного стресса Си8О4 + Н202 у инфузорий вызывала гибель относительно небольшой их части (рис. 2а). В то же время другой реактив Фентона, содержащий соль Мора, снижал выживаемость инфузорий достоверно сильнее (рис. 2б). Предварительная обработка инфузорий ДЭДТК-Ма значительно повышала чувствительность парамеций к действию обоих вариантов реактива Фентона, продуцирующих гидроксильный радикал 'ОН. Это изменение чувствительности зависело от концентрации ингибитора СОД. При действии 100 мкМ ДЭДТК-Ма выживаемость инфузорий при окислительном стрессе была примерно в 1,5 раза ниже, чем при концентрации ДЭДТК-Ма 10 мкМ.
МаОС1 оказался для парамеций существенно более токсичным соединением, чем 'ОН. Степень выживаемости парамеций при действии МаОС1 была в 2,5 раза ниже (рис. 3), чем при действии реагентов Фентона. Чувствительность инфузорий к действию МаОС1, как и в случае ре-
контроль 100мкИ ДЭДТК-Na ШмкИ ДЭДТК-Иа окислитель +окисл№тель +окисгитепь
Рис. 3. Влияние прединкубации культуры P. caudatum с ДЭДТК-Na на выживаемость инфузорий в условиях индукции окислительного стресса 44 мкМ NaOCl.
Усредненные данные представлены в виде медианы с указанием 95% ДИ
активов Фентона, заметно усиливалась в присутствии ДЭДТК-№.
Заключение. Наши эксперименты показали, что инфузории Р. саыйаШт достаточно чувствительны к индукции окислительного стресса, что выражается в гибели части клеток уже после 45 мин инкубации с микромолярными концентрациями источников активных форм кислорода.
Обработка парамеций проникающим ингибитором СОД, которая является одним из основных ферментов внутриклеточной антиокси-дантной защиты, значительно снижает устойчивость клеток инфузорий к токсическому действию индукторов окислительного стресса. Инфузории, обработанные ДЭДТК-Ма, являются высокочувствительными к действию окислителей. Мы полагаем, что они могут служить перспективной и удобной моделью для изучения различных аспектов свободно-радикальной биологии и эффектов токсических веществ, механизм действия которых может быть связан с индукцией окислительного стресса.
Список литературы
1. Еропкин М.Ю. Модели, альтернативные использованию лабораторных животных в токсикологии. Достижения и проблемы. // Токсикол. вестн, 1999. — № 5. — С. 7-13.
2. Меклеева Б.В., Коваленко А.В. Эффекты индукторов окислительного стресса на клетки инфузорий Paramecium caudatum // Сб. работ XII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине». — Казань, 2007.
3. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и ан-тиоксиданты. — М.: Слово, 2006. — 556 с.
4. Щеткина Т.Н., Лыков И.Н., Черемных Е.Г. Сравнительная характеристика чувствительности простейших одноклеточных организмов к отдельным факторам окружающей среды // Проблемы региональной экологии, 2007. — № 3. — С. 31-37.
5. Gallego A., Martin-Gonzalez A., Ortega D. et al. Flow cytometry assessment of cytotoxicity and reactive oxygen species generation by single and binary mixtures of cadmium, zinc and copper on populations of the ciliated protozoan Tetrhymena thermophila // Chemos-phere, 2007. — V. 68. — № 4. — P. 647-661.
6. Larsen J. The influence of growth phase and culture conditions of Tetrahymena on effects of cadmium //Toxicology, 1989. — V. 58. — № 2. — P. 211-223.
7. Lushchak V., Semchyshyn H., Lushchak O. et al. Diethyldithiocarbamate inhibits in vivo Cu,Zn-su-peroxide dismutase and perturbs free radical processes in the yeast Saccharomyces cerevisiae cells // Bio-chem. Biophys. Res. Commun., 2005. — V. 338. — № 4. — P. 1739-1744.
8. Riediger S., Behrends A., Croll B. et al. Toxicity of the quinalphos metabolite 2-hydroxyquinoxa-line: growth inhibition, induction of oxidative stress, andgenotoxicity in test organisms//Environ. Toxicol., 2007. — V. 22. — № 1. — P. 33-43.
9. Seregina O.B., Uspenskaya S.I., Leonidov N.B. Primary evaluation of biological activity of polymorph drug modifications on protozoa // Eur. J. Pharm. Sci., 2000. — V. 11. — P. 116.
Материал поступил в редакцию 31.07.08.
V.G.Zaitsev, B.V.Mekleyeva, O.V.Ostrrovskiy
SODIUM DIETHYLDITHIOCARBAMATE, A PENETRATING INHIBITOR OF SUPEROXIDE DISMUTAZA, ENHANCES SENSIBILITY OF INFUSORIA PARAMECIUM CAUDATUM
TO THE INDUCED OXIDATIVE STRESS
Volgograd State Medical University
It is shown that inductors NaOCI of oxidative stress and Fenton reagents reduce the amount of infusoria Paramecium Caudatum. A preliminary treatment of infusoria with superoxide dismutaza penetrating inhibitor significantly enhances their sensibility to the toxic effect of oxidative stress inductors.
