CC BY
104
УДК 574.24;52.042
О. В. Карпухина, К. З. Гумаргалиева, А. Н. Иноземцев, Г. Е. Заиков, Х. С. Абзальдинов
ОСОБЕННОСТИ КИНЕТИКИ РОСТА КУЛЬТУРЫ PARAMECIUM CAUDATUM
В МОДЕЛИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
Ключевые слова: окислительный стресс, тяжёлые металлы, инфузории, биотестирование.
Тест-объект Paramecium caudatum характеризуется коротким жизненным циклом, быстрым размножением, поэтому является удобной моделью для изучения отклика организма на внешнее химическое воздействие. В модельных экспериментах показано влияние солей тяжёлых металлов на выживаемость инфузорий. Определены концентрации солей металлов (Cu, Cd, Pb, Zn), токсичные для культуры Paramecium caudatum и диапазон значений рН среды при которых происходило ингибирование роста культуры.
Keywords: oxidative stress, heavy metal, ciliates, biological testing of toxicity.
The тest - object Paramecium caudatum has a short lifecycle, rapid reproduction, so is a convenient model for the study of the body's response to external chemical attack. The model experiments show the effect of salts of heavy metals on the survival of ciliates. The concentrations of metal salts (Cu, Cd, Pb, Zn), are toxic to the culture Paramecium caudatum and pH range of the medium that inhibits growth of the culture it was determined.
Введение
Значительное количество публикаций последних лет посвящено теме влияния тяжёлых металлов на живые организмы [1-5]. Особый интерес представляет способность тяжелых металлов индуцировать окислительный стресс, который рассматривается в качестве ведущего механизма дезорганизации клеточного метаболизма [6].
Окислительный стресс возникает при нарушении баланса про/антиоксидантных процессов в клетке, что может привести к окислительному повреждению липидов, белков, углеводов и нуклеиновых кислот [7]. Одним из способов токсического действия тяжёлых металлов является генерация активных форм кислорода (АФК) путём аутоокисления и реакции Фентона. В большинстве случаев, избыточная генерация АФК приводит к значительным повреждениям клеточной структуры.
Инфузория Раramecium caudatum Ehrenberg является одним из наиболее часто используемых тест-объектов для лабораторных исследований, направленных на определение прямого действия химических соединений [8].
Особенностью организации простейших (Protozoa) является то, что они представляют собой одновременно и клетку, и полноценный организм. Следовательно, реакции простейших на воздействие внешней среды можно рассматривать как более простую модель, по сравнению с многоклеточными организмами.
Protozoa реагируют на тяжелые металлы снижением поглощения пищи, уменьшением роста, иммобилизацией или понижением скорости эндоцитоза, что существенно влияет на выживание Тяжелые металлы могут сконцентрироваться в клеточных мембранах, разрушить их целостность и в результате вызывать гибель одноклеточного организма [9-10]. В представленной работе приведены результаты экспериментальных исследований влияния таких солей тяжёлых
металлов, как кадмий медь, свинец и цинк на клетки Раramecium caudatum.
Экспериментальная часть
Культуру инфузорий инкубировали в стандартных условиях на среде Лозина -Лозинского при t°= 23±2°С, рН=5,5-6,2. Для биотестирования использовали культуру Раramecium caudatum в экспоненциальной фазе роста, так как именно в этот период культура инфузорий обладает наибольшей биомассой и чувствительностью к действию токсинов [11]. Плотность клеточных популяций определяли под микроскопом (увеличение 7х10) с видеорегистрацией в счетной камере Горяева путем подсчета общего количества клеток в 1 мл массовой культуры. Отбор культуры из одного флакона и заполнение клетками камеры Горяева проводили до 5-ти раз. Моделирование окислительного стресса в клетках инфузорий достигалось путем добавления в 1 мл культуральной среды раствора соли металла (хлорид кадмия, ацетат свинца, сульфат меди, сульфат цинка) в конечных концентрациях 1; 5; 10 и 15 мкМ.
Длительность инкубирования в среде, содержащей соль тяжёлого металла составляла 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 час, 2 часа, 6 часов.
На всех этапах эксперимента проводились измерения рН среды (рН-метр контроллер Kelilong PH-221).
В число исследуемых функций инфузорий вошли: выживаемость клеток, интенсивность деления, прирост культуры; характер и скорость движения инфузории, изменение формы клетки.
Ингибирование роста клеток оценивали в соответствии с уравнением: RP= (Nc -Ne) / Nc Х 100,
где RP - отклик - реакция простейших на изменения в среде (%); Nc является количеством интактных клеток (клетки/мл) и Ne - число клеток, подвергшихся действию токсиканта (клеток/мл). Положительные значения RP указывают на
замедление роста культуры, в то время как отрицательные значения указывают на стимуляцию роста культуры Paramecium caudatum.
Все эксперименты были повторены три раза, и результаты были выражены как среднее ± стандартная ошибка значений. Сравнение количественных данных проводили - с помощью критерия Стьюдента (в случае нормального распределения) для связанных и несвязанных выборок. При распределении признака, отличающегося от нормального, применяли непараметрические методы (критерий Вилкоксона и Манна-Уитни). Уровень значимости был принят равным 0,05. Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США).
Результаты и их обсуждение
Paramecium caudatum продемонстрировали высокую чувствительность к солям кадмия, свинца, меди и цинка. В присутствии этих веществ нарушается поведение инфузорий, изменяется вектор двигательной активности организма, уменьшается или увеличивается скорость передвижения, происходит угнетение
репродуктивных функций.
Культивирование клеток с солью тяжёлого металла в концентрации, превышающей 1 мкМ, приводило к появлению атипичных клеток инфузорий, наблюдались грубые морфологические изменения в клеточной стенке в виде множественных округлых выростов. После 6 ч инкубации с растворами солей тяжёлых металлов, количество атипичных клеток в культуре Paramecium caudatum составило от 19,1 ± 0,05 % до 38,3 ± 0,05 % (минимальное - с солью цинка, максимальное количество - в среде с солью меди).
Тяжёлые металлы, поступившие внутрь клетки, нарушали целостность или нативность структуры биологических мембран, что приводило к лизису и гибели клеток. Снижение численности опытных клеток свидетельствовали о деструктивной мембранной патологии, в возникновении которой немаловажную роль играют процессы свободнорадикального окисления (рис. 1).
Выраженная индукция окислительного стресса была обнаружена в клетках при воздействии сульфата меди, хлорида кадмия и ацетата свинца (концентрации 10-15 мкМ).
Кинетический рост культуры клеток предоставляет информацию о токсическом действии исследуемого вещества. Различные выбранные концентрации солей тяжёлых металлов ингибирует рост числа одноклеточных организмов в зависимости от дозы, времени воздействия и природы металла.
Наиболее токсичными для Paramecium caudatum оказались соединения меди и кадмия.
По токсическому действию на цитоплазматическую мембрану ионы металлов можно расположить в следующий ряд: Cu2+ > Cd2+ > Pb2+ > Zn2+.
ON
CL
o:
**
о E
(D §
-0 g
О §
(D <B CD 3
100 1 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
1 мкМ
5мкМ
10мкМ
15 мкМ
...............................контроль —
- - Pb - ■
- —Zn
Рис. 1 - Влияние 1-15 мкМ металлов на выживаемость
•Cd Cu
солеи тяжелых (RP,%) клеток Рагашеешш caudatum после 6 часов инкубации
Изменение химического состава среды привело к переходу культуры в стационарную фазу, в которой увеличения количества клеток не происходило. Поскольку в среде присутствуют токсические вещества, наступила фаза отмирания, которая характеризуется экспоненциальным уменьшением количества жизнеспособных клеток.
В нашем исследовании установлено, что усиление токсичности меди и кадмия наблюдается при низких значениях рН (рис.2).
100 90 80 70605040 30 20-1 10 0
4.3
5.5
6.9
8.8 10.2 рН
□ контроль
ICu
□ Cd
□ Pb QZn
Рис. 2 - Влияние рН среды, содержащей соли металлов на культуру клеток Раramecium caudatum
При наличии в среде солей тяжёлых металлов и при изменениях рН в щелочную (рН = 10,2) или кислую сторону (рН = 4,3) отмечались нарушения двигательной активности инфузорий, появление атипичных клеток. Таким образом, изменение рН привело к замедлению или к полному прекращению роста культуры, и нарушило многие процессы функционирования микроорганизма.
Выводы
В данной работе представлен простой и надежный метод оценки для выявления токсических эффектов тяжёлых металлов в лабораторных
условиях. Окислительный стресс, индуцированный тяжёлыми металлами, может быть изучен на одноклеточных организмах Рагатесшш caudatum и рассматриваться как патологический процесс, влияющий на биологические свойства клеток эукариот, особенно, если невозможно провести токсикологические исследования на клеточных культурах человека.
Показано, что соли металлов (концентрации 1мкМ-15мкМ) вызвали доза-зависимое
ингибирование роста клеток Paramecium caudatum.
Можно сказать, что положительные изменения в процентах отклика подтвердили ингибирование роста обработанных парамеции и это независимо от концентрации клеток.
Установлено, что при опосредованном влиянии солей тяжёлых металлов, растворенных в среде, активность инфузорий зависит от концентрации металла, времени воздействия и природы действующего металла, определяющей специфичность его действия.
Литература
1. Черных Н.А., Овчаренко М.М. Тяжелые металлы в биогеоценозах. - М.: Агроконсалт, 2002. - 200 с.
2. S.k.Agarwal. Heavy Metal Pollution //APH Publishing. 2009. 270 p.
3. Appenroth K.J. Definition of "heavy metals" and their role in biological systems.// In: Sherameti I., Varma A. (eds.) Soil heavy Metals, Soil Biology. Berlin: Springer; 2010: 1929
4. G. Banfalvi. Cellular Effects of Heavy Metals. |//Springer Science & Business Media. 2011 г. 348 p.
5. D.L. Rao J. of Chem. Pharm. Sci. Special Issue 3:172-174 (2014)
6. SW Ryter et al. Antioxid Redox Signal. 9(1):49-89 (2007)
7. H. Sies. Oxidative Stress II. Oxidants and antioxidants // Academic press, London, 1991. 650 p.
8. J. R Nilsson. Protoplasma, 109: 359-370 (1981)
9. Рахлеева А.А., Терехова В.А. Методика определения токсичности отходов, почв, осадков сточных, поверхностных и грунтовых вод методом биотестирования с использованием равноресничных инфузорий Paramecium caudatum Ehrenberg (ФР.1.39.2006.02506). М.: Изд-во МГУ, 2006: 30 c.
10. Hafeburg G., Kothe E. J. of Basic Microbiology; 47: 453467 (2007)
11. Виноходов Д.О. Научные основы биотестирования с использованием инфузорий: дис. ... докт. биол. наук -СПб., 2007.-263 с.
© О. В. Карпухина - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, старший научный сотрудник, Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, Москва, Россия, [email protected], К. З. Гумаргалиева - доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией Стабильности и устойчивости органических веществ и материалов, Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН, Москва, Россия, А. Н. Иноземцев - доктор биологических наук, руководитель лаборатории Эволюции механизмов памяти, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия, Г. Е. Заиков - доктор химических наук, профессор кафедры Технологии пластических масс, Казанский национальный исследовательский технологический университет, Казань, Россия, Х. С. Абзальдинов - кандидат химических наук, доцент кафедры Технологии пластических масс, Казанский национальный исследовательский технологический университет, Казань, Россия.
© O. V. Karpukhina - Ph.D., Leading Researcher, M.V. Lomonosov Moscow State University, Senior Researcher, N.N. Semenov Institute of Chemical Physics, RAS, Moscow, Russia, [email protected], K. Z. Gumargalieva - Doctor of Chemistry, Full Professor, Head of Organic Substances and Materials Stability and Sustainability Laboratory, N.N. Semenov Institute of Chemical Physics, RAS, Moscow, Russia, A. N. Inozemtsev - Doctor of Biology, Head of The Evolution Memory Mechanisms Laboratory, M.V. Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia, G. E. Zaikov - Doctor of Chemistry, Full Professor, Plastics Technology Department, Kazan National Research Technological University, Kazan, Russia, Kh. S. Abzaldinov - Ph.D., Associate Professor, Plastics Technology Department, Kazan National Research Technological University, Kazan, Russia.
