Диагностика вируса шарки сливы на косточковых культурах Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 578.85/86.083.2:577.152

Диагностика вируса шарки сливы на косточковых культурах

57 %, кэ и др. В индивидуальных садах можно применять фьюри, 10 %, вэ, фуфанон, 57 %, кэ, кеми-фос, 57 %, кэ, искру М, 52,5 %, кэ, инта-вир, впр и др. в соответствии с Государственным каталогом пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации на данный период. Эти пестициды эффективны также против других вредителей сада. В первой декаде мая в большинстве случаев также наблюдается интенсивный лёт бабочек плодожорки, но в это время продолжается цветение садов и обработки исключены.

Интенсивный лёт бабочек II генерации начинается с третьей декады июня и продолжается по первую декаду августа, значит, с конца июня и в июле можно также применять пестициды, но не позднее, чем за 2040 дней до съема плодов.

При низкой численности восточной плодожорки (менее 3 бабочек на 1 ловушку в сутки) можно вывесить в саду клеевые феромонные ловушки из расчета 50 ловушек на 1 га в производственных садах или 2 ловушки на 100 м2 в ЛПХ в целях борьбы. Клеевые вкладыши в ловушках меняют по мере их заполнения насекомыми.

Период интенсивноголёта восточной плодожорки III генерации более растянут по сравнению со второй из-за понижения температуры воздуха. Почти во все годы наблюдений наиболее интенсивный лёт бабочек III генерации приходился на I и II декады сентября. В это время для защиты урожая зимних сортов плодовых и после уборки более ранних сортов можно снова применить пестициды, которые снизят повреж-денность плодов и уменьшат зимующий запас вредителя.

Таким образом, для организации успешной борьбы с восточной плодожоркой необходимо знать, имеется ли этот вредитель в вашем саду, какова его численность и периоды лёта бабочек. Ответы на эти вопросы можно получить с помощью феро-монных ловушек, которые вывешивают в саду на деревьях на высоте 1,52 м из расчета 1 ловушка на 2-5 га.

П.А. ПОХОДЕНКО, младший научный сотрудник Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и питомниководства М.Т. УПАДЫШЕВ, заведующий отделом защиты растений

Потивирус шарки сливы (PPV), вызывающий существенное снижение урожая косточковых культур и ухудшающий товарные качества плодов (Вердеревская, Маринеску, 1985), относится к ограниченно распространенным на территории Российской Федерации карантинным организмам.

Ключевым элементом любой технологии получения безвирусных клонов является диагностика латентной вирусной инфекции. Важным шагом в направлении совершенствования диагностики стало внедрение в практику метода иммуноферментного анализа - ИФА (Clark, Adams, 1977). Данный метод позволяет в краткие сроки (2-3 дня) в лабораторных условиях осуществлять тестирование нескольких сотен образцов.

Однако получение диагностических сывороток возможно далеко не ко всем вирусам и фитоплазмам плодовых культур, а сам метод ИФА имеет недостаточную чувствительность при выявлении вирусов в конце вегетации и в состоянии покоя растений, в тканях коры и древесины, а также в культурах in vitro. Как правило, использование метода ИФА ограничивается двумя месяцами после начала вегетации растений.

Указанных недостатков лишены методы молекулярной диагностики с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), являющиеся в настоящее время наиболее современными технологиями определе-

ния патогенов (Olmos et al., 2002). К преимуществам ПЦР-теста относятся чрезвычайно высокие специфичность и чувствительность. Проведение анализа возможно в течение всего одного дня.

ПЦР-тесты для диагностики различных патогенов плодовых культур (вирусы, вироиды, фитоплазмы, бактерии, грибы и др.) активно разрабатываются и внедряются во всем мире (Candresse et al., 1995; Kümmert et al., 2004). Однако в России было проведено крайне ограниченное число исследований по молекулярной диагностике вирусов плодовых культур (Филимонова и др., 2000, Добржанская и др., 2001), вследствие чего ПЦР-тесты по-прежнему редко применяются в вирусологической практике.

Эксперименты проводили на базе лаборатории вирусологии ВСТИСП. Объектом служил вирус шарки сливы. В серологических тестах применяли сэндвич-вариант иммуноферментного анализа (DAS - ELISA) по методике М. Кларка и А. Адамса (1977) с использованием диагностических наборов на основе поликло-нальных антител из НИИ садоводства Молдовы и фирмы «Bio-Rad» (США). Регистрацию результатов проводили на планшетном фотометре «Stat Fax 2100» при длине волны 405 нм. Оценку зараженности образцов осуществляли в соответствии с «Методическими указаниями по экспресс-диагностике вирусов на ягодных культурах» (2002).

Молекулярную диагностику проводили методом ОТ-ПЦР с праймера-ми и реакционными смесями, разработанными в ООО «Агродиагности-ка». Амплификацию выполняли на программируемом термостате «Тер-цик», а регистрацию результатов осу-

Таблица 1

Результаты тестирования разных органов сливы и вишни войлочной методами ИФА и ПЦР в осенний период на вирус шарки

Листья Почки Юэра Древесина

ИФА ПЦР ИФА ПЦР ИФА ПЦР ИФА ПЦР

Слива - + - - - + - +

Вишня войлочная + + - + - - - +

ществляли на трансиллюминаторе Vilber Lourmat TCP - 20.МС с выводом изображений электрофореграмм ПЦР-продуктов на компьютер.

Известно, что осенью и в период покоя косточковых культур частицы вируса PPV не удается обнаружить даже методом электронной микроскопии (Калашян, 1973). В наших экспериментах при тестировании методом ИФА разных органов растения (листья, почки, кора, древесина) в осенний период сероположительный результат наблюдался в листьях изо-лята вишни войлочной (табл. 1).

При тестировании методом ИФА коры изолятов вишни войлочной и сливы результат был сероотрица-тельным. Низкий титр вируса и неравномерное (локальное) распределение его в тканях являются основными причинами отрицательных результатов ИФА в этих образцах.

Выделение вируса и его диагностика методом ПЦР были успешными в листьях и древесине вишни войлочной и сливы, в почках вишни войлочной, в коре сливы. Вирус не выявлялся в почках сливы и в коре вишни войлочной, что, вероятно, связано с методом выделения РНК из тканей растения. В целом вирус PPV выделялся и диагностировался ме-

Таблица 2

Результаты тестирования сливы (in vitro и после адаптации) методами ИФА и ПЦР на вирус шарки

Сорт (клон)

Растения in vitro Растения после адаптации

ИФА ПЦР ИФА ПЦР

Фиолетовая — + - +

(клон 1)

Фиолетовая - + + +

(клон 2)

Утро - + + +

Ренклод - + + +

тамбовский

тодом ПЦР наиболее успешно в древесине и листьях обеих культур. Следовательно, древесина наиболее пригодна для тестирования растений в период покоя, а метод выделения РНК, используемый нами, может быть рекомендован в работе с листьями и древесиной.

При оздоровлении растений от вирусов с использованием метода культуры тканей важное значение имеет чувствительность метода диагностики. Часто метод ИФА не позволяет выявлять вирусы в пробирочных растениях, поскольку концентрация вирусов в них, как правило, низкая. Это затрудняет корректную диагностику вирусов in vitro и выбраковку зараженных растений,

1234 56 7 8 9 10 11 К-Ю

ПЦР-анализ растений сливы разных сортов на вирус шарки

Растения после адаптации: 1 — Фиолетовая (клон 1); 2 — Фиолетовая (клон 2); 3 — Утро; 4 — Ренклод тамбовский. Растения in vitro: 6 — Утро, 7 — Фиолетовая, 8 — Ренклод тамбовский. Образцы различного происхождения: 9 — слива изолят (кора), 10 — слива изолят (древесина). (К—) отрицательный контроль, (К+) положительный контроль; а — фрагмент кДНК, соответствующий внутреннему контролю размером 560 пар нуклеотидов; б — фрагмент кДНК размером 268 п.н.

что в конечном итоге приводит к увеличению затрат времени, материалов и финансовых ресурсов при проведении технологического процесса оздоровления. После адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям происходит накопление вирусов в тканях растений, что обеспечивает их успешную диагностику методом ИФА.

Поэтому нами был проведен сравнительный анализ результатов выявления вирусов в пробирочных растениях и растениях после адаптации методами ИФА и ПЦР. При тестировании пробирочных растений методом ИФА вирус шарки сливы не выявлялся, что связано с низкой концентрацией вируса в растении (табл. 2).

Вместе с тем в растениях после адаптации вирус диагностировался методом ИФА у сортов Фиолетовая (клон 2), Утро, Ренклод тамбовский. Вирус PPV не выявлялся методом ИФА в клоне 1 сорта Фиолетовая, что также объясняется низкой концентрацией вируса в растении. С применением ПЦР-анализа удалось детектировать вирус шарки сливы как в растениях in vitro (рисунок), так и в растениях после адаптации в отличие от ИФА.

Следовательно, метод ПЦР при тестировании растений in vitro оказался предпочтительнее по сравнению с ИФА. Аналогичные результаты, подтверждающие его высокую эффективность при тестировании пробирочных растений сливы на вирус шарки, получены и другими исследователями (Добржанская и др., 2001).

Таким образом, в период покоя косточковых культур метод ПЦР позволяет с высокой степенью достоверности осуществлять их тестирование на вирус PPV в древесине растений, тогда как чувствительность метода ИФА в данный период часто бывает недостаточной для выявления вирусной инфекции. С применением ПЦР-анализа удалось успешно диагностировать вирус шарки сливы как в растениях in vitro, так и в растениях после адаптации. Метод ИФА при тестировании растений in vitro оказался менее чувствительным, чем ПЦР.