CC BY
39
УДК 634.22:632.38
АНАЛИЗ ЗАРАЖЕННОСТИ ВИРУСОМ ШАРКИ РАСТЕНИЙ РОДА PRUNUS L.
В БЕЛАРУСИ И МОЛДОВЕ Н. В. КУХАРЧИК
РУП «Институт плодоводства», пос. Самохваловичи, Минский район, Беларусь, 223013, e-mail: [email protected]
(Поступила в редакцию 10.03.2016)
Проведен анализ зараженности сортов рода Prunus L вирусом Шарки сливы (Plum pox virus) в Беларуси и Молдове, всего изучено более 200 генотипов. Диагностику вируса проводили методами визуальных наблюдений, иммуноферментного анализа (DAS-ELISA), ПЦР анализа с обратной транскрипцией и иммобилизацией вирусных частиц с помощью вирусоспе-цифических антител (IC-RT-PCR). Определены сорта рода Prunus L., пораженные вирусом в Беларуси, в том числе сливы, алычи, вишни, черешни, клоновых подвоев вишни и черешни (18 генотипов). В Молдове не отмечено сортов, на которых не был диагностирован вирус Шарки сливы. В течение 2013-2014 гг. на карте распространения вируса Шарки сливы новых очагов поражения не отмечено. Исследования выполнены в рамках договора с Белорусским республиканским фондом фундаментальных исследований № Б15МЛД-035 от 1 июля 2015 г. «Оздоровление селекционно-ценных генотипов рода Prunus domestica от известных и ранее не описанных в Молдове изолятов вируса Шарки сливы (Plum pox virus) в культуре in vitro и ex vitro» в РУП «Институт плодоводства» (НАН Беларуси) и Публичном учреждении «Научно-практический институт садоводства, виноградарства и пищевых технологий» (Молдова).
Ключевые слова: Plum pox virus, слива, диагностика, иммуноферментный анализ, ПЦР, Беларусь, Молдова.
The analysis of the infestation rate by Plum pox virus plants of the genus Prunus L. in Belarus and Moldova was carried out, over 200 genotypes were studied. Virus diagnostics were made by visual observation, immunosorbent assay (DAS-ELISA),immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction (IC-RT-PCR) method. Cultivars of Prunus L. infected by virus, including plum, cherry plum, cherry, sweet cherry, clonal rootstocks (18 genotypes), identified in Belarus. In Moldova the varieties, in which the virus Plum pox has not been diagnosed, weren 't observed. New plum pox virus infection during the2013 -2014 year is not installed. Research carried out under a contract with the Belarusian Republican Foundation for Fundamental Research B15MLD-035 "Improvement of the selected genotypes of the genus Prunus domestica _ from known and previously described in Moldova plum pox virus isolates (Plum pox virus) in vitro and ex vitro» in the "Institute for Fruit Growing" and the " Scientific Practical Institute of horticulture and food technology" (Moldova).
Keywords: Plum pox virus, plum, diagnostics, linked immunosorbent assay, PCR, Belarus, Moldova.
Введение
Среди плодовых культур вирус Шарки поражает сливу (Prunus domestica L.), абрикос (P. armeni-aca L.), персик (P. persica L.), черешню (P. avium L.), вишню (P. cerasus L.), алычу (P.cerasifera L.). В промышленных садах вирус распространяется в основном осенью крылатыми тлями, перелетающими на косточковые культуры с травянистых растений (вирус не персистентный) [1-3]. У высокочувствительных сортов при инфицировании вирусом может наблюдаться полная потеря урожая как следствие преждевременного созревания и опадения плодов. У больных деревьев от 20 до 100 % плодов преждевременно опадает, а вес оставшихся снижается в среднем на 20 %. Кроме того, в уцелевших плодах снижается содержание сахаров (на 25 %), а кислотность повышается, что существенно снижает их вкусовые качества и пригодность для плодов переработки [4]. В условиях Молдовы потери урожая у восприимчивых к Шарке сортов сливы составляют 70 % и более.
Основными методами диагностики PPV являются визуальная диагностика, прививка тестируемых почек на специфические индикаторные растения (P. persica L. Batsch cvs., GF 305 и Siberian C); механический перенос на травянистые индикаторные растения (Chenopodium foetidum Schard, Nicotiana clevelandii Gray или N. benthamiana Domin. P.tomentosa Thunb); иммуноферментный и ПЦР анализы.
Основная часть
Визуальную диагностику вируса Шарки сливы проводили в насаждениях в период активной вегетации в конце весны-начале лета, в середине лета и в период созревания плодов (август-сентябрь). Наличие симптомов оценивали на листьях, плодах, побегах [5]. В небольших насаждениях (до 1 га) и приусадебных участках осматривали каждое растение, в насаждениях от 1 га до 3 га - 20 % растений, в насаждениях более 3 га - 10 % растений. В многосортных насаждениях осматривали все сорта отдельно. Обследование не проводилось в условиях экстремально жаркой погоды, а также в течение двух недель после длительного периода температур выше +25 °С. Оптимальные сроки ИФА тестирования вирусов май-начало июля. Для проведения иммуноферментного анализа отбирали листья в первую очередь с визуальными симптомами, поврежденные вредителями, морфологически аномальные. При отсутствии симптомов листья отбирали с разных сторон кроны со средней части побегов. Отбор образцов для ПЦР диагностики проводили независимо от периода вегетации.
Диагностику вируса проводили методами иммуноферментного анализа (DAS-ELISA), в соответствии с методическими указаниями фирмы производителя антител (наборов для диагностики). ПЦР анализ с обратной транскрипцией и иммобилизацией вирусных частиц с помощью вирусоспецифиче-ских антител (IC-RT-PCR) проводили в соответствии с рекомендациями фирмы производителя реагентов для One Step RT-PCR, праймеры представлены в табл. 1. Протокол иммуноферментной диагностики вирусов и IC-RT-PCR -анализа представлены в ранее опубликованных работах [5]. Повтор-ность анализа каждого образца двукратная.
Название праймера Нуклеотидная последовательность (5'^ 3') Температура отжига Размер ПЦР продукта
PPV-P1 аccgagaccactacactccc 62°С 243 пн.
PPV-P2 eagactacagcctcgccaga
Проведен анализ зараженности сортов сливы, алычи, вишни и черешни белорусского [6-8] и молдавского сортимента вирусом Шарки сливы (Plum pox virus). Мониторинг вируса Шарки сливы в ма-точно-черенковых насаждениях, маточниках клоновых подвоев и промышленных садах, проводящийся в течение 2000-2015 гг., позволил оценить поражаемость конкретных сортов вирусом на естественном инфекционном фоне и распространенность вируса в Беларуси и Молдове. Всего изучено более 200 генотипов.
Основные симптомы вируса Шарки сливы на растениях сливы и алычи представлены на рис. 1 и 2. Наиболее четкие признаки заболевания вирусом Шарки сливы можно отметить спустя 3-4 недели после цветения. На листьях восприимчивых сортов наблюдаются широкие расплывчатые полосы и кольца (ширина рисунка - от 2 мм до 2 см), сначала светло-зеленой, затем желтой окраски, которые хорошо просматриваются на свету. Позже на формирующихся или сформировавшихся, окрашенных, а также на полностью созревших плодах появляются темно-фиолетовые пятна, кольца и полосы. У сливы восприимчивых сортов в этих местах развитие плода прекращается, на поверхности плода образуются вдавленности, которые соединяются в кольцевые узоры и переходят на косточку. Ткань под кольцевыми узорами на плоде вплоть до косточки становится красно-бурой (цвета ржавчины), частично отмирает и заполняется камедью. Плоды на больных деревьях приобретают окраску созревших и за месяц-полтора до созревания здоровых плодов опадают. Симптомы на плодах относительно устойчивых сортов сливы отличаются от симптомов на плодах восприимчивых сортов. Они представляют собой мелкие красноватые кольца и дуги, захватывающие только кожицу плодов, без заметных некротических вдавленностей и деформации.
Симптомы на листьях алычи имеют вид пятен, колец и полос различной формы. На плодах в большинстве случаев некрозы и деформация отсутствуют, но могут и проявиться в виде отдельных вдавленных пятен и колец. На растениях абрикоса симптомы начинают проявляться весной, на листьях вдоль жилок появляется желтый узор в виде узких колец и полос. Узор на листьях абрикоса более ажурный, чем на листьях сливы. В период созревания плодов на пораженных листьях, в местах узоров образуются некротические пятна, на плодах - зеленые пятна, окаймленные широкими светло-зелеными кольцами. Часть мякоти около косточки становится сухой, губчатой и безвкусной. На коричневом фоне косточки хорошо видны светло-коричневые округлые пятна, окаймленные желтоватыми кольцами. Плоды становятся очень неровными, бугристыми, мелкими. В начале лета на листьях персика, пораженного вирусом Шарки, вдоль центральной жилки образуются светло-зеленые полосы, часто наблюдается просветление вторичных-третичных жилок, хорошо заметное на просвет. На некоторых сортах наблюдается обесцвечивание лепестков. На плодах образуются большие бугристые кольца. Симптомы на войлочной вишне сходны с симптомами на сливе, но пятна на листьях более мелкие и четкие.
Рис.1. Симптомы вируса Шарки сливы на листьях Рис ■ 2 ■ Симптомы вируса Шарки на листьях алычи
и плодах сливы сорта Комета
Исследования по распространенности вируса Шарки в Молдове, проведенные в промышленных садах, курируемых Публичным учреждением «Научно-практический институт садоводства, виноградарства и пищевых технологий» с 2011 по 2014 гг., показали наличие РРУ у 1-7 % растений в начале обследований с увеличением на 1,5-2 % ежегодно. На сортах сливы зараженность составляет от 11 до 28 %. В ряде новых садов, заложенных в 2011-2013 гг. посадочным материалом от европейских производителей, зараженность Шаркой составила от 30 до 90 % (обследовано 4 хозяйства на площади 50 га). Для Беларуси и Молдовы составлен перечень сортов, на которых диагностировался вирус Шарки сливы.
Сорта сливы, алычи, вишни, черешни, формы подвоев, на которых выявлен вирус Шарки в Бела-руси:сорта сливы домашней: Награда неманская, Витебская поздняя, Эмпресс, Президент. Сорта сливы диплоидной: Комета, Найдена, Ветразь. Сорта вишни и черешни: Вянок, Облачинская, Ипуть. Подвои сливы: ОД-2-3, ВПК-1; ВВА-1, семенной, 140-2, Л-2, ВЦ 8-101, ОВП-6.
Сорта сливы, алычи, на которых выявлен вирус Шарки в Молдове: сорта сливы домашней: Стен-лей, Удлиненая, Президент, Суперпрезидент, Блюфри, Ренклод Альтана, Кишиневская ранняя, Кабардинская ранняя; терн, растущий в лесозащитной полосе; ряд новых гибридов. Сорта сливы диплоидной: Комета. Сорта сливы, алычи, на которых не выявлен вирус Шарки в Беларуси: сорта сливы домашней: Пердригон, Виктория, Даликатная, Эдинбургская, Нарач, Кромань, Венгерка белорусская, Чарадзейка, Монт Роял, Стенли, Фаворито дель Султано, Венера, Блюфри,Мирная, старые местные сорта сливы, Amers, Липотица рана, Джумбокот, ряд новых гибридов. Сорта сливы диплоидной: Лама, Асалода, Скороплодная, Витьба, Мара, Лодва, Сонейка, Прамень, Ветразь-2, ряд новых гибридов.
Составить список сортов сливы, алычи, вишни, черешни, формы подвоев, на которых не выявлен вирус Шарки в Молдове оказалось невозможно. Широкое распространение вируса и высокая его вредоносность вызваны как неконтролируемым завозом и размножением посадочного материала, так и высокой концентрацией насаждений Prunus L. в республике. Кроме того, хорошие условия для репликации вируса Шарки сливы и наличие большого количества высоковосприимчивых культур (абрикос, персик) и сортов позволяют диагностировать вирус с высокой достоверностью даже с использованием только визуального контроля, не говоря о том, что школа плодоводов-вирусологов в Молдове самая успешная на постсоветском пространстве. Для молдавского сортимента сливы составлен список сортов, для которых установлено большое количество свободных от вируса Шарки сливы растений.
Сорта сливы домашней, имеющие свободные от вируса Шарки сливы растения: Венгерка крупная сладкая, Анна Шпет, Ранняя Храмова, Ажен 707, Тулеу Грас, Краса Осени, Чачанская наиболея, Рут-гештетер, Венгерка Молдавская, Ренклод Храмовых, Соперница, Памяти Костиной, Валор, Чачанска Рана, Ченченар, Дымбовица, III-33-75, ряд новых гибридов. Сорта сливы диплоидной: Чук, Жемчужина, Рубиновая, Черноморская, Подарок Друзьям, ряд новых гибридов.
В Молдове вирус Шарки сливы распространен во всех регионах. Для изучения распространенности вируса Шарки сливы по Беларуси было обследовано около 25 га насаждений косточковых культур. В результате визуального обследования симптомы вируса Шарки были обнаружены в пяти областях Беларуси (табл. 2).
Таблица 2. Распространенность вируса Шарки сливы по областям Беларуси (2009-2015 гг.)
Область Обследовано насаждений, га Количество симптоматичных образцов
отобранных, шт. зараженных,%
Брестская 5,0 66 19,7
Витебская 3,7 12 8,3
Гомельская 5,0 34 0
Гродненская 4,4 54 29,6
Минская 6,0 192 16,7
Могилевская 1,8 53 13,2
Обследование насаждений сливы, проведенное в 2013-2014 гг. (второй этап мониторинга вируса Шарки сливы в Беларуси) методами визуальной диагностики, ИФА и ПЦР, позволило детализировать карту распространения вируса Шарки сливы в Беларуси. В течение 2013-2014 гг. на карте распространения вируса Шарки сливы новых очагов поражения не отмечено, что привело к снижению средних показателей распространенности вируса в Беларуси, по сравнению с данными 2012 г. [6].
Заключение
Вирус Шарки сливы диагностирован в условиях Беларуси и Молдовы. Определены сорта рода Prunus L., пораженные вирусом в Беларуси, в том числе сливы, алычи, вишни, черешни, клоновых подвоев вишни и черешни (18 генотипов). В Молдове не отмечено сортов, на которых не был диагностирован вирус Шарки сливы. В течение 2013-2014 гг. на карте распространения вируса Шарки сливы новых очагов поражения не отмечено, что привело к снижению средних показателей распространенности вируса в Беларуси по сравнению с данными 2012 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Nemeth, M. History and importance of plum pox in stone-fruit producton. EPPO Bull., 1994, 24: 525-526.
2. APS-net, march, 2000. Plum pox potyvirus disease of stone fruits. Prepared by Laurene Levy, Vern Daamsteegt, Ralf Scorza and Maria Kolber.
3. Quarantine Pests for Europe. Date sheets on Quarantine Peats for European Communities and for the European and Mediterranean Plant Protaction Organization. Prepead by CABI and EPPO for EC., 1997.
4. Вердеревская, Т. Д. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда / Т. Д. Вердеревская, В. Г. Маринеску. - Кишинев, Штиинца, 1985.
5. Методика диагностики основных вирусных инфекций плодовых и ягодных культур / Н. В. Кухарчик [и др.] // Плодоводство: науч. тр. / РУП «Ин-т плодоводства»; редкол.: В. А. Самусь (гл. ред.) [и др.]. - Самохваловичи, 2015. - Т. 27. - С. 341-349.
6. Salavei, A. Detection of plum pox virus in regions of Belarus / A. Salavei [et al. N. V. Kukharchyk] // 22nd «International Conference on Virus and Other Trandmissible Diseases of Fruit Crops», Rome, 5-8 Jun 2012 / ICVF; Scientific Committee: W. Jelkmann [et al.]. - Rome, 2012. - Р. 152.
7. Malinowski, T. Partial characterisation of biological properties of PPV-C isolates found in Belarus and establishment of in vitro cultures of infected L2 and OWP-6 rootstocks / T. Malinowski, I. Sowik, A. V. Salavei, N. V. Kukharchyk // 22nd «International Conference on Virus and Other Trandmissible Diseases of Fruit Crops», Rome, 5-8 Jun 2012 / ICVF; Scientific Committee: W. Jelkmann [et al.]. - Rome, 2012. - P. 149.
8. Salavei, A.V. Sanitary status of Sharka on Stone fruit trees in Belarus / A. V. Salavei, N. V. Kukharchyk, T. Malinovski // International symposium on Plum pox virus, Sofia, September 5-9, 2010, Bulgaria. - Sofia, 2010. - P. 39.
