CC BY
41
УДК 616.12008.331.1
ДИАГНОСТИКА НЕДОСТАТОЧНОСТИ 11в-ГИДРОКСИЛАЗЫ ПО ДАННЫМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ У БОЛЬНЫХ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ
Р. К. Галахова, Л. И. Великанова, Н. В. Ворохобина, И. П. Серебрякова ГОУ ДПО Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Росздрава,
Россия
DIAGNOSING ^-HYDROXYLASE INSUFFICIENCY
BASED ON HIGH-EFFECTIVE LIQUID CHROMATOGRAPHY IN PATIENTS
WITH ARTERIAL HYPERTENSION
R. K. Galakhova, L. I. Velikanova, N. V. Vorokhobina, I. P. Serebryakova St-Petersburg Medical Academy of Postgraduate Studies, Russia
© Коллектив авторов, 2011 г.
Обследовано 105 больных с артериальной гипертензией, из них у 62 обнаружена гиперплазия коры надпочечников по данным компьютерной томографии органов брюшной полости. Сочетание использования традиционных методов исследования гормонов (иммуноферментного и радиоиммунологического) и метода высокоэффективной жидкостной хроматографии при проведении функциональных проб с дексаметазоном и кортико-тропином у больных с артериальной гипертензией позволяет выявить особенности стероидогенеза и установить лабораторные критерии стертой формы врожденной гиперплазии коры надпочечников вследствие дефекта 11Р-гидроксилазы.
Ключевые слова: врожденная гиперплазия коры надпочечников, 11 в-гидроксилаза, артериальная гипер-тензия, высокоэффективная жидкостная хроматография.
A total of 105 patients with arterial hypertension were observed. Of these 62 patients revealed adrenal hyperplasia according to the computed tomography of abdominal cavity. The combination of traditional methods of measuring hormone levels (enzyme immunoassay and radioimmunoassay) and high-effective liquid chromatography during functional tests with dexamethasone and synacthen depot can reveal new features of adrenal steroidogenesis and new laboratory criteria for diagnosing nonclassical congenital adrenal hyperplasia due to 11 в-hydroxylase deficiency in patients with arterial hypertension.
Keywords: congenital adrenal hyperplasia, 11p-hydroxylase, arterial hypertension, high-effective liquid chromatography.
Введение. В связи с развитием диагностических возможностей отмечается увеличение числа больных с гиперплазией коры надпочечников (ГКН) [1, 2]. Одной из причин ГКН является врожденная гиперплазия коры надпочечников (ВГКН). Это группа заболеваний с аутосомно-ре-цессивным типом наследования, в основе которых лежит дефект различных ферментов коры надпочечников, принимающих участие в биосинтезе кортизола и альдостерона [3, 4]. Согласно классификации ВГКН, в основу которой положены клиническая симптоматика и время появления признаков заболевания, выделяют несколько форм заболевания: сольтеряющую и простую вирильную формы, которые могут быть обусловлены снижением активности фермента 21-гидроксилазы (21-Г) или 3Р-гидрокси-
стероиддегидрогеназы (3Р-ГСД), гипертоническую форму вследствие дефекта 11Р-гидрокси-лазы (11Р-Г) или 17а-гидроксилазы (17а-Г) и стертую (неклассическую форму), причиной которой может быть легкий дефект 21-Г, 3Р-ГСД или 11р-Г [3, 5].
Около 5-8% всех случаев ВГКН обусловлены недостаточностью 11Р-Г [5, 6]. В основе дефекта этого фермента лежат точечные мутации в гене CYP11В [7]. При этом нарушается превращение 11-дезоксикортизола в кортизол и 11-дезокси-кортикостерона в кортикостерон. Постоянный дефицит кортизола по механизму отрицательной обратной связи стимулирует секрецию адрено-кортикотропного гормона (АКТГ). Это приводит к повышению концентрации тех стероидов, которые образуются на этапах, предшествующих
Original data
ферментативному блоку (так называемые субстраты дефектного фермента), а также тех, в синтезе которых дефектный фермент не участвует [5, 6]. Значительное влияние на клинические проявления ВГКН при дефекте 11 р-Г оказывают выделяющиеся в избытке промежуточные продукты надпочечникового стероидогенеза (кор-тикостерон и 11-дезоксикортикостерон), которые обладают выраженной минералокортикоид-ной активностью. Их накопление способствует увеличению концентрации натрия в плазме, что приводит к развитию артериальной гипертен-зии, которая возникает в первые годы жизни ребенка и устойчива к традиционной гипотензивной терапии [4, 5]. Повышение секреции АКТГ вызывает увеличение продукции андрогенов уже в периоде раннего внутриутробного развития и приводит к вирилизации наружных гениталий у девочек (ложный женский гермафродитизм).
При гетерозиготном носительстве дефектного гена, кодирующего фермент 11Р-гидроксила-зы, возможно развитие стертой формы ВГКН. В этом случае заболевание проявляется различными симптомами гиперпродукции андрогенов, связанных по времени возникновения с периодом полового созревания у лиц женского пола.
Диагностика ВГКН включает определение уровня АКТГ и кортизола с помощью иммуно-ферментного анализа (ИФА). Однако ИФА обладает рядом недостатков: количественное определение кортикостероидов позволяет обнаруживать лишь конечные продукты стероидогенеза, не дает возможности сделать заключение о диагностически важном соотношении между различными стероидами и их метаболитами. Кроме того, метод обладает малой специфичностью, так как селективность реакции антитела с конкретным стероидом не абсолютна, поэтому в присутствии гормонов, имеющих близкое строение и сходные наборы функциональных групп, антитело может вступать с ними в перекрестные реакции.
Учитывая недостатки метода ИФА, большую роль играет метод высокоэффективной жидкостной хроматографии кортикостероидов (ВЭЖХ), который дает возможность получать информацию о количестве как конечных продуктов, так и предшественников надпочечникового стерои-догенеза из одной пробы биологического материала, а также оценивать их соотношения. Метод ВЭЖХ также позволяет оценивать содержание свободных форм кортикостероидов в моче, которое является надежным показателем скорости секреции стероидных гормонов.
Основным маркером недостаточности Hß-Г является повышение уровня 11-дезоксикортизо-ла (S) в плазме, который служит субстратом этого фермента. При классической форме ВГКН вследствие дефекта Hß-Г уровень 11-дезокси-кортизола повышается в несколько раз по сравнению с нормой, а уровень кортизола снижается [8, 9]. Диагностика стертой формы дефекта Hß-Г требует исследования базального и стимулированного уровней S при проведении пробы с «си-нактеном-депо» по методике И. Г. Дзенис с соавторами [10, 11].
Диагностические критерии стертой формы дефекта Hß-Г совместно разработаны сотрудниками кафедры эндокринологии им. акад. В. Г. Баранова и НИО лабораторной диагностики СПбМАПО [12].
Материалы и методы. Обследованы 105 больных, обратившихся по поводу повышения артериального давления. Всем пациентам была проведена компьютерная томография органов брюшной полости, которая выявила в части случаев увеличение размеров надпочечников (ГКН). Таким образом, пациенты были разделены на группы: первая группа составила 62 пациента (30 мужчин и 32 женщины) с ГКН в возрасте от 20 до 41 года (средний возраст 35,4 ± 2,2 года), вторая группа — 43 больных (25 мужчин и 18 женщин) от 18 до 36 лет (средний возраст 27,2 ± 1,2 года) без ГКН. Все пациенты имели нормальную массу тела (индекс массы тела 23,1 ± 0,7). Контрольную группу составили 30 практически здоровых человек (средний возраст 28,2 ± 3,5 года) с нормальной массой тела и нормальным артериальным давлением.
Методом ИФА определяли в крови уровни АКТГ, кортизола, дегидроэпиандростерон-суль-фата (ДЭА-С), А4-андростендиона, 17-гидро-ксипрогестерона (17-ОНП); методом радиоиммунологического анализа (РИА) — альдостерона и активность ренина плазмы (АРП). Методом ВЭЖХ исследовали уровни кортизола (F), кортизона (Е), кортикостерона (В), 11-дезоксикорти-костерона (DOC), 11-дезоксикортизола (S) в крови и экскрецию свободного кортизола (UFF) и свободного кортизона (UFE) с мочой. Пациентам проводили пробы с 2 мг дексаметазона и с синтетическим аналогом кортикотропина (синактен-депо) по методике И. Г. Дзенис с соавторами [11]. Для диагностики стертой формы ВГКН с дефектом Hß-Г уровни кортикостероидов при проведении пробы с синактеном оценивали по данным ВЭЖХ [12].
Статистическая обработка данных осуществлена с использованием программного пакета
Statistica for Windows (версия 5.5). Сравнение количественных показателей осуществлялось c использованием непараметрических методов (критерии Манна—Уитни, Вилкоксона, корреляции Спирмена). Статистически значимыми различия считались при уровне р < 0,05.
Результаты. Традиционные методы обследования с определением содержания в крови АКТГ и кортизола в динамике при проведении пробы с дексаметазоном, а также альдостерона и АРП при проведении ортостатической пробы дали возможность у больных с ГКН (группа 1) установить функциональный гиперкортизолизм (21 человек) и низкорениновый гиперальдостеронизм
(8 человек). 33 пациента с нормальными уровнями в крови кортизола и альдостерона были отнесены в группу гормонально неактивной ГКН. Данные гормонального обследования представлены в табл. 1.
У больных с гормонально неактивной ГКН уровни в крови АКТГ, кортизола и альдостерона статистически значимо не отличались от соответствующих показателей у здоровых. У данных больных был сохранен ритм секреции кортизола, а его уровень при проведении пробы с дексаме-тазоном статистически значимо не отличался от соответствующего показателя в группе контроля (табл. 1).
Таблица 1
Состояние гипофизарно-адреналовой и ренин-альдостероновой систем у больных с артериальной гипертензией (АГ) по данным иммуноферментного и радиоиммунологического методов
исследования(М±m)
Показатель Пациенты с гиперплазией коры надпочечников и АГ Пациенты с АГ без гиперплазии коры надпочечников, n = 43 Здоровые, n = 30
низкорениновый гиперальдостеро-низм, n = 8 гиперкортизолизм функциональный, n = 21 гормонально неактивная гиперплазия коры надпочечников, п = 33
АКТГ в 9 ч, пг/мл 27,2 i 8,1 29,1 i 4,5 26,4 ± 3,6 39,4 i 5,9** 18,2 i 3,2
АКТГ в 21 ч, пг/мл 14,8 i 11,9 16,7 i 5,6 16,7 ± 2,5 18,5 i 6,3 10,1 i 1,5
Кортизол в 9 ч (Ку), нмоль/л 474,7 i 56,8 719,6 i 59,2** 438,9 ± 19,2 473,9 i 41,5 386,5 i 26,4
Кортизол в 21 ч (Кв), нмоль/л 203,7 i 40,1 163,3 i 19,1 218,2 ± 34,9 221,9 i 34,1 164,7 i 24,9
(Кв/Ку) x 100% 37,9 i 7,1 25,7 i 3,2 44,3 ± 5,9 48,7 i 9,3 44,4 i 3,7
Кортизол (дмт), нмоль/л 28,2 i 7,1 42,9 i 9,7 37,9 ± 8,3 42,8 i 18,1 33,4 i 2,8
Альдостерон, пг/мл 136,6 i 10,4** 94,8 i 14,7 76,5 ± 11,8 103,8 i 8,6* 69,7 i 4,8
Активность ренина плазмы, нг/мл/ч 0,28 i 0,07** 1,3 i 0,4 1,1 ± 0,3 1,6 i 0,4 0,9 i 0,1
Примечание: * — р < 0,05; ** — р < 0,01 (уровень статистической значимости различий по сравнению с группой здоровых лиц); дмт — уровень показателя при проведении пробы с 2 мг дексаметазона.
Количественное определение кортикостеро-идов в крови методом ВЭЖХ в динамике при проведении пробы с синактен-депо позволило выявить среди больных с гормонально неактивной ГКН 10 пациентов со стертой формой ВГКН с дефектом llß-гидроксилазы. У данных больных были увеличены в крови уровни DOC до 8,9 ± 3,7 нг/мл (р < 0,01) и S до 19,7 ± 6,9 нг/мл (р < 0,01), статистически значимо снижены индексы F/E, UFF/UFE и экскреция с мочой UFF
и UFE (табл. 2). При проведении пробы с синактен-депо установлено увеличение в сравнении с базальным уровнем S до 30,1 ± 6,7 нг/мл (р < 0,01) (более чем на 50%), индекса F/S менее чем в 2 раза. Отмечено снижение прироста уровня В и индекса F/E по сравнению с контрольной группой. При проведении пробы с дексаметазоном отмечено снижение более чем на 50% уровня в крови S до 7,5 ± 3,1 нг/мл в сравнении с соответствующим фоновым показателем (табл. 2).
Original data
Таблица 2
Данные ОФ ВЭЖХ кортикостероидов в сыворотке крови и моче у пациентов с артериальной гипертензией с врожденной гиперплазией коры надпочечников с дефектом 11 в-гидроксилазы
(М ± m)
Показатель Здоровые, n = 30 Пациенты с классической формой ВГКН с дефектом Hß-гидроксилазы, n = 6 Пациенты со стертой формой ВГКН с дефектом Hß-гидроксилазы
гиперплазия коры надпочечников, n = 10 без гиперплазии коры надпочечников, n = 5
Кортизол (F), нг/мл 65,9 i 5,6 27,1 i 3,1** 53,9 i 11,4 38,0 i 9,6*
Кортизон (E), нг/мл 18,6 i 1,8 13,0 i 1,6* 20,5 i 7,3 21,6 i 4,4
Кортикостерон (В), нг/мл 2,2 i 0,3 1,3 i 0,2* 4,7 i 1,6 1,3 i 0,3
11-дезоксикортикостерон (DOC), нг/мл 2,5 i 0,5 11,8 i 2,8* 8,9 i 3,7* 7,5 i 2,0*
11-дезоксикортизол (S), нг/мл 2,3 i 0,4 9,9 i 0,7* 19,7 i 6,9** 10,1 i 2,4*
F/E 3,5 i 0,2 2,0 i 0,5** 2,6 i 0,5* 1,7 i 0,2**
F/S 30,1 i 5,2 1,9 i 1,1** 4,5 i 2,3** 4,6 i 1,3**
Свободный кортизол мочи (UFF), мкг/с 14,0 i 3,7 5,2 i 0,6** 10,5 i 0,9* 10,3 i 3,0
Свободный кортизон мочи (UFE), мкг/с 43,0 i 1,6 29,1 i 2,9* 45,7 i 5,5 64,5 i 19,6*
UFF/UFE 0,32 i 0,2 0,18 i 0,03** 0,25 i 0,03** 0,16 i 0,04**
Кортикостерон (B) (кт), нг/мл 37,9 i 6,8 10,1 i 0,8* 18,5 i 3,3* 17,9 i 1,4
11-дезоксикортизол (S) (кт), нг/мл 2,5 i 0,8 34,2 i 3,** 30,1 i 6,7** 21,3 i 3,2
F/E 10,3 i 2,5 4,9 i 0,3* 5,4 i 0,8* 5,9 i 0,7*
F/S 305,2 i 30,0 3,2 i 1,6** 6,3 i 1,9** 11,2 i 2,4**
Примечание: * — р < 0,05; ** — р < 0,01 (уровень статистической значимости различий по сравнению с группой здоровых лиц); кт — уровень показателя при проведении пробы с кортикотропином.
У больных с артериальной гипертензией без ГКН (группа 2) установлено увеличение в крови уровня альдостерона (р < 0,01) (табл. 1). При проведении пробы с синактен-депо у 5 больных установлена недостаточность 11Р-гидроксилазы на основании увеличения по сравнению с ба-зальным уровнем S до 21,3 ± 3,2 нг/мл (более чем в 2 раза), индекса F/S менее чем в 2,4 раза, анд-ростендиона до 5,8 ± 1,5 нмоль/л (более чем на 50%), уменьшения в сравнении с контролем прироста уровня В и индекса F/E. У данных больных были увеличены в крови АКТГ, АРП, S, DOC; снижены индексы F/E и UFF/UFE и уровень кортизола в крови (табл. 2). При проведении пробы с 2 мг дексаметазона отмечено снижение уровня S до 5,9 ± 1,5 нг/мл (более чем на 50%) по сравнению с его базальными значениями.
У 6 больных с классической формой ВГКН с дефектом 11Р-Г в отличие от больных со стер-
той формой ВГКН с дефектом 11 ß-Г по данным ВЭЖХ отмечено снижение уровней в крови F до 27,1 ± 3,1 нг/мл (р < 0,001), E до 11,0 ± 1,6 нг/мл (p = 0,002), B до 1,1 ± 0,2 нг/мл (р < 0,01), экскреции с мочой UFF до 5,9 ± 1,9 мкг/с (р = 0,005) и UFE до 29,1 ± 2,9 мкг/с (р < 0,05) в сравнении с группой контроля. При проведении пробы с си-нактен-депо у данных больных уровень S был увеличен в сравнении с его базальным уровнем более чем в 3 раза, а индекс F/S базальный статистически значимо не отличался от индекса F/S после стимуляции синактен-депо (табл. 2).
Таким образом, количественное определение кортикостероидов в крови и моче методом ВЭЖХ играет важную роль в диагностике стертой формы ВГКН с дефектом Hß-гидроксилазы у больных с артериальной гипертензией, что имеет большое значение для выбора тактики лечения.
Выводы
1. Сочетание использования традиционных методов исследования гормонов (иммунофер-ментный и радиоиммунологический анализ) и метода высокоэффективной жидкостной хроматографии при проведении функциональных проб с дексаметазоном и синактен-депо позволяет диагностировать классическую и стертую формы ВГКН вследствие дефекта 11Р-гидроксилазы у больных с артериальной гипертензией.
2. Повышение в крови базальных уровней 11-дезоксикортикостерона и 11-дезоксикортизола, уменьшение индексов кортизол/кортизон крови, свободный кортизол/свободный кортизон мочи, увеличение в крови уровня 11-дезоксикортизола более чем на 50% и индекса 11-дезок-
сикортизол/кортизол менее чем в 2,5 раза при проведении пробы с синактен-депо, снижение уровня 11-дезоксикортизола более чем на 50% при проведении пробы с дексаметазоном свидетельствуют о стертой форме врожденной гиперплазии коры надпочечников с дефектом llß-гидро-ксилазы у больных с артериальной гипертензией.
3. Снижение уровней в крови кортизола, кортизона и кортикостерона, экскреции с мочой свободного кортизола и свободного кортизона, увеличение уровня в крови 11-дезоксикортизола более чем в 3 раза при проведении пробы с корти-котропином являются дополнительными критериями классической формы врожденной гиперплазии коры надпочечников с дефектом Hß-гид-роксилазы.
Литература
1. Подзолков В. И. Проблемы артериальной гипертензии и пограничных состояний в XXI веке / В. И. Подзолков // Врач. — 2002. — № 1. — С. 14-17.
2. Шевченко Ю. Л. Современные аспекты диагностики и лечения симптоматических артериальных гипертоний над-почечникового генеза / Ю. Л. Шевченко, П. С. Ветшев, Л. И. Ипполитов // Терапевт. арх. — 2003. — № 4. — С. 8-15.
3. Соболева Е. Л. Неклассическая форма врожденной гиперплазии коры надпочечников (этиология, патогенез, диагностика) / Е. Л. Соболева и др. // Журн. акуш. и жен. болезней. — 2006. — Т. 55. — № 2. — С. 53-57.
4. Калинченко Н. Ю. Клинико-гормональная и молекулярная характеристика врожденной дисфункции коры надпочечников вследствие дефицита Р450с11 (11в-гидроксилазы): описание двух случаев заболевания / Н. Ю. Калинченко и др. // Пробл. эндокринол. — 2003. — Т. 49. — № 3. — С. 39-42.
5. White P. C. Disorders of steroid 11P-hydroxylase isozymes / P. C. White, K. M. Curnow, L. Pascoe // Endocr. Rev. — 1994. — Vol. 15. — P. 421-438.
6. Sahin Y., Kelestimur F. The frequency of late-onset 21-hydroxylase and 11P-hydroxylase deficiency in women with polycystic ovary syndrome / Y. Sahin, F. Kelestimur // Eur. J. Endocrinol. — 1997. — Vol. 137. — Р. 670-674.
7. Krone N. Genetics of congenital adrenal hyperplasia / J. Clin. Endocr. Metab. — 2009. — Vol. 23. — Р. 181-192.
8. Великанова Л. И. Диагностическое значение высокоэффективной жидкостной хроматографии кортико-стероидов при заболеваниях гипофизарно-надпочечниковой системы / Л. И. Великанова и др. // Пробл. эндокринол. — 2005. — Т. 51. — № 6. — С. 9-12.
9. Гампер Н. Л. Определение кортикостероидов плазмы крови методом микроколоночной обращенно-фазовой жидкостной хроматографии / Н. Л. Гампер, Е. М. Королева, Л. И. Великанова // Аналитическая химия. — 1996. — Т. 29. — С. 16-24.
10. Дзенис И. Г. Стероидогенез в надпочечниках при синдроме поликистозных яичников / И. Г. Дзенис и др. // Пробл. репродукции. — 1997. — № 3. — С. 18-22.
11. Дзенис И. Г. Диагностика гетерозиготного носительства мутантного гена 21-гидроксилазы / И. Г. Дзенис и др. // Акуш. и гинекол. — 1995. — № 1. — С. 21-23.
12. Великанова Л. И. Способ диагностики стертой формы врожденной гиперплазии коры надпочечников с дефектом 11 в-гидроксилазы / Л. И. Великанова и др. // Патент РФ № 2279090. — 27.06.2006.
Авторы:
Галахова Равиля Камильевна — аспирант кафедры эндокринологии им. акад. В. Г. Баранова ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава
Великанова Людмила Иосифовна — д. б. н., зав. НИЛ хроматографии НИИ эндокринологии, профессор кафедры эндокринологии им. акад. В. Г. Баранова ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава
Ворохобина Наталья Владимировна — д. м. н., профессор, зав. кафедрой эндокринологии им. акад. В. Г. Баранова ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава
Серебрякова Инна Павловна — к. м. н., ассистент кафедры эндокринологии им. акад. В. Г. Баранова ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава
Адрес для контакта: [email protected]
