CC BY
217УДК: 578.834.1:616-092 DOI: 10.37279/2224-6444-2020-10-2-69-77
ДИАГНОСТИКА COVID-19: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ В ОТРАСЛИ
Горбунов А. А., Сорокина Л. Е., Чегодарь Д. В., Кубышкин А. В., Фомочкина И. И.
Кафедра общей и клинической патофизиологии, Медицинская академия имени С.И.Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И.Вернадского», 295051, бульвар Ленина 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Фомочкина Ирина Ивановна, доктор медицинских наук, профессор кафедры общей и клинической патофизиологии, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «] КФУ им.В. И. Вернадского», e-mail: fomochkina_i@mail.ru
For correspondence: Fomochkina I. I., MD, Professor of the Department of General and Clinical Pathophysiology of Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, e-mail: fomochkina_i@mail.ru
Information about authors:
Gorbunov A. A., https://orcid.org/0000-0002-2886-6178 Sorokina L. E., http://orcid.org/0000-0002-1862-6816 Chegodar D. V., https://orcid.org/0000-0001-8067-6411 Kubyshkin A. V., https://orcid.org/0000-0002-1309-4005 Fomochkina I. I., https://orcid.org/0000-0003-3065-5748
РЕЗЮМЕ
SARS-CoV-2 - это новый представитель мира вирусологии, относящийся к коронавирусам и способный вызвать широкий диапазон заболеваний дыхательной системы: от незначительных проявлений рутинной вирусной инфекции до респираторного дистресс-синдрома с тяжелой дыхательной недостаточностью. Патогенез новой коронавирусной инфекции (COVID-19) связан со способностью SARS-CoV-2 связываться с АПФ-рецепторами и в последующем активировать IL-6 - главный стимулятор «цитокинового шторма» в организме. Именно благодаря таким особенностям патогенеза вируса необходимо раннее и точное выявление как активных форм, так и вирусоносительства. В представленном обзоре рассматривается весь спектр основных методов диагностики, со сравнением эффективности и указанием условий использования, новой коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2: от применяющихся на данный момент методов (ОТ-ПЦР, ИФА) к потенциально возможным (OT-LAMP, CRISPR), а также тем, которые находятся в стадии разработки (хемилюминесценция).
Ключевые слова: SARS-CoV2, COVID-19, диагностика, ОТ-ПЦР, ИФА.
COVID-19 DIAGNOSTICS: CURRENT STATE OF THE PROBLEM AND PROSPECTS IN THE BRANCH
Gorbunov A. A., Sorokina L. E., Chegodar D. V., Kubishkin A. V., Fomochkina 1.1.
Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU
SUMMARY
SARS-CoV-2 is a new representative of the world of virology related to coronaviruses and can cause a wide range of diseases of the respiratory system: from colds to acute respiratory distress-syndrome with severe respiratory failure. The pathogenesis of a new coronavirus infection (COVID-19) is associated with the ability of SARS-CoV-2 to bind to ACE receptors and subsequently activate IL-6, the main stimulator of the "cytokine storm". Due to such features of the viral pathogenesis, early and accurate detection of active forms, as well as virus carriage are needed. In review, the whole spectrum of the main diagnostic methods is represented, with a comparison of the effectiveness and conditional indication of COVID-19: from the currently used methods (RT-PCR, ELISA) to potentially possible (OT-LAMP, CRISPR), as well as those still under development (chemiluminescence).
Key words: SARS-CoV-2, COVID-19, diagnostics, RT-PCR, ELISA.
Первая половина наступившего 2020 года ознаменовалась важными для всего человечества событиями в области общественного здравоохранения: 30 января на втором заседании Чрезвычайного комитета ВОЗ эпидемия, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2, была признана «чрезвычайной ситуацией, имеющей международное значение» [1; 2]. Пандемия привлекла к себе внимание специалистов во всем мире, так
как ранее коронавирусные инфекции у людей не выходили за пределы допустимого уровня биологического риска, однако последствия произошедших мутаций этих вирусов указывают на то, что трансформации последних могут приводить к непредвиденным последствиям. Таким образом, на сегодняшний день все более актуальным становится вопрос о необходимости своевременной высокоточной диагностики ко-
2020, т. 10, № 2
ронавирусной инфекции. Повсеместное внедрение диагностических тестов позволит не только уточнить эпидемиологическую ситуацию, но и сформировать целостное представление об основных патогенетических звеньях заболевания, а также повысить качество проводимых лечебных и профилактических мероприятий.
Коронавирусы, получившие свое название благодаря некоторым морфологическим особенностям, являются членами крупного ареала РНК-вирусов ШЬоуша. Согласно современной номенклатуре они входят в порядок Nidovirales, субпорядок Cornidovirinneae, семейство Coronaviridae, подсемейство Orthocoronavirinnae. В контексте данного обзора особый интерес представляют виды из подродов Sarbecovirus и Merbecovirus, среди которых имеются возбудители опасных инфекционных заболеваний человека, а именно SARS-CoV, МЕЯ^-СоУ и SARS-CoV-2. В 2002-2003 гг. вирус SARS-CoV вызвал вспышку атипичной пневмонии в 24 странах, что привело к заражению 8096 человек. Распространение MERS-CoV наблюдалось в 2015 г. в Южной Корее, где показатели заболеваемости и смертности составили 2494 человек и 872 человека соответственно [1].
Генетическая информация коронавирусов представлена в виде плюс-цепи линейной одно-цепочечной РНК. Транскрипционный процесс у коронавирусов происходит путем синтеза с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) негативной цепи, служащей в дальнейшем матрицей для наработки плюс-цепей РНК. Размеры геномов у большинства известных коронавирусов
варьируют от 27 до 32 тысяч нуклеотидов [1]. Нуклеиновая кислота нового возбудителя, SARS-Со^2, была выявлена в декабре 2019 г. у пациента с пневмонией в городе Ухань провинции Хубэй в Китае. 7 января 2020 г. после тщательного микробиологического анализа данный возбудитель был отнесен к семейству Coronaviridae, а болезнь, которую вызывает вирус, ВОЗ назвали COVID-19 [2]. Его геном представлен +sРНК длиной 30кЬ (29891 нуклеотид, G+C=38%) и имеет следующий порядок: [5-ОК^з-структурные белки: S-E-М-К-3']. Вирус состоит из 4 структурных полипротеинов: S - поверхностный, спаечный белок; М - мембранный белок; Е - оболочечный белок; N - нуклеокапсидный белок [3]. У данного вируса имеется по меньшей мере 6 открытых рамок считывания (ORFs). Первая рамка - ОЯЛа/Ь -занимает примерно 2/3 длины генома и кодирует 16 неструктурных белков (^р1-16). Между ORF1a и ОЯЛЬ происходит сдвиг на 1 рамку считывания, что приводит к образованию двух полипептидов: рр1а и рр1аЬ. Эти полипептиды в дальнейшем обрабатываются вирус-кодиру-емой химотрипсиноподобной протеазой (или основной протеазой), а также одной или двумя папаиноподобными протеазами с расщеплением двух полипептидов на 16nsps [3, 4]. Неструктурные белки формируют в двумембранных везикулах репликационно-транскрипционный комплекс (РТК), в котором синтезируется набор субгеномных РНК между открытыми рамками считывания ОЯЛ. Организация генома вируса SARS-CoV-2, по данным ряда авторов [5-8], показана на рис.1.
Рис. 1. Упрощенная схема геномной организации бетакоронавирусов (масштаб не соблюден). 5'-UTR - 5'-нетранслируемая область, ORF1a/b (replicase /transcriptase) кодирует 16 неструктурных белков (NSP), S - белок зубца короны (spike), E - малый белок оболочки (envelope), M - мембранный глико-протеин (membrane), N - нуклеокапсидный белок (nucleocapsid), 3'-UTR - З'-нетранслируемая область
В патогенезе SARS-CoV-2 важную роль играет субъединица S1 гликопротеина S, которая связывается с мембранный белком - анги-отензинпревращающим ферментом 2 (АПФ2) на поверхности альвеолоцитов II типа, энте-роцитов тонкого кишечника, эндотелиоцитов, а также гладкомышечных клеток [9; 10; 11]. АПФ2 представляет собой компонент ренин-ангиотензиновой системы, металлопротеиназу, уравновешивающую функцию АПФ и отрица-
тельно регулирующую уровень ангиотензина II (рисунок 2.). Первым этапом жизненного цикла вируса является рецепторная адсорбция вирусной частицы на поверхности клетки-мишени в результате специфического связывания первой субъединицы спайкового белка S1 с клеточным рецептором. Для SARS-CoV-2 таковым является как раз АПФ2 [12].
После рецепторного связывания с поверхностью клетки-мишени последующие стадии -
общие для всех коронавирусов: рецептор-опосредованный эндоцитоз завершается проникновением вирусного нуклеокапсида в цитоплазму клетки-хозяина, где вирионная РНК выступает в качестве мРНК для синтеза двух протяжённых полипротеинов рр1а и рр1аЬ длиной порядка 2000 и 7000 аминокислотных остатков, соответственно. рр1аЬ включает в себя рр1а и образуется в результате игнорирования рибосомой
в 20-30 % случаев стоп-сигнала из-за шпильки, смещающей рамку считывания [13]. Надо иметь в виду, что рр1а и рр1аЬ не существуют в клетке как единые молекулы и котрансляционно нарезаются протеазами на 16 неструктурных белков, регулирующих дальнейшую репликацию и, в частности, преобразующих складки эндоплазма-тического ретикулума в своеобразные «фабрики» для поздних стадий репликации вируса [14].
Рис.2. Принципиальная схема роли ренин-ангиотензиновой системы в развитии острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), острой легочной недостаточности (ОЛН) и атипичной коронавирус-ной пневмонии. Анг I - ангиотензин I, Анг II - ангиотензин II, AT1R - рецептор ангиотензина II типа
1, AT2R - рецептор ангиотензина II типа 2, АПФ - ангиотензин превращающий фермент, Spike -субъединица S1 гликопротеина S для связывания с рецептором АПФ (Yumiko Imai, et al., Circulation
Journal, 2020).
Одним из важнейших неструктурных белков является РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp), которая синтезирует комплементарную вирионной нить РНК негативной полярности, которая, в свою очередь, выступает в качестве матрицы для синтеза геномных РНК (войдут в состав дочерних вирионов). Помимо этого, RdRp синтезирует на матрице геномной РНК серию субгеномных РНК негативной полярности (сгРНК-) с разрывом цепи и переносом её к З'-концу матрицу, в результате чего все сгРНК-этой серии имеют одинаковые 5' - и З'-фланги и центральные части различной степени вложенности друг в друга. Далее сгРНК- используются в качестве матрицы для синтеза субгеномных матричных РНК позитивной полярности, с которых считываются структурные белки. Сборка дочерних вирионов происходит в эндоплазмати-ческом ретикулуме, и затем они покидают клетку хозяина путём экзоцитоза [4].
Морфологическим субстратом патогенеза средне-тяжелых и тяжелых форм СОУГО 19 является диффузное альвеолярное повреждение: вирус вызывает повышение проницаемости клеточных мембран и усиленный транспорт жидкости, богатой альбумином, в интерстици-альную ткань лёгкого и просвет альвеол - раз-
вивается интерстициальный и альвеолярный отек. При этом нарушается синтез сурфактанта, развивается коллапс альвеол, в результате резкого нарушения газообмена развивается острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) [15; 16]. Иммуносупрессивное состояние больного способствует развитию оппортунистических бактериальных и микотических инфекций респираторного тракта. Данные о длительности и напряженности иммунитета в отношении SARS-CoV-2 в настоящее время отсутствуют. Иммунитет при инфекциях, вызванных другими представителями семейства коронавирусов, нестойкий, и возможно повторное инфицирование.
Инфекционный процесс сопровождается выработкой антител двух типов: ^М и IgG. ^М-антитела производятся первыми, их уровень быстро нарастает в начале инфекции, достигая максимума в острый период болезни, а затем постепенно снижается, полностью исчезая к моменту выздоровления. IgG-антитела появляются в крови в острой стадии инфекционного процесса, но максимальная их выработка происходит обычно через 10-14 дней после перенесенной инфекции. Есть данные о том, что уровень IgG и ^М против внутреннего и поверхностного ну-клеопротеина SARS-CoV-2 коррелировал с ней-
трализующей активностью. Время сероконвер-сии имеет решающее значение для определения оптимальных сроков сбора образцов сыворотки с целью изучения динамики болезни и разработки моноклональных антител в качестве терапевтического агента [17].
Приоритетной проблемой и направлением в борьбе с новой коронавирусой инфекцией является разработка и внедрение валидных и быстрых методов выявления SARS-CoV-2.
«Золотым стандартом» на данный момент является полимеразная цепная реакция (ПЦР) с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР), направленная на обнаружение генов N, E, RdRp и др. [18]. Есть сообщения о разработке двух одноступенчатых количественных ОТ-ПЦР-анализов, обнаруживающих области ORFlb и N вирусного генома [20]. Наборы для количественной ПЦР на основе флуоресценции в течение короткого промежутка времени стали широко использоваться для лабораторного подтверждения заболевания в Китае; тогда же стал доступен целый ряд коммерческих тестов [1]. Для лабораторного подтверждения заболевания необходимы положительные результаты как по гену ORFlab, так и по гену N.
Несколько позже китайскими учеными был разработан новый анализ ОТ-ПЦР в реальном времени, нацеленный на РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp)/хеликазу (Hel) (COVID-19-RdRp/HEL-анализ) с низким пределом обнаружения (1,8 ТСГО50/мл с геномной РНК и 11,2 копии РНК/реакция с транскриптами РНК in vitro). Сравнительный анализ его с RdRp-P2, используемым в настоящее время в европейских лабораториях, показывает более высокую точность в определении возбудителя. Так, COVID-19-RdRp/Hel был положительным для дополнительных 42 RdRp-P2-отрицательных образцов (119 из 273 (43,6%) против 77 из 273 (28,2%) P<0,001) COVID-19-RdRp/Hel не вступал в перекрестную реакцию с другими патогенными коронавирусами человека и респираторными патогенами в клеточной культуре и клинических образцах, в то время как анализ RdRp-P2 перекрестно реагировал с SARS-CoV в клеточной культуре [20; 21]. Еще одной разновидностью ОТ-ПЦР (на основе SYBR Green) стал альтернативный протокол-набор для диагностики COVID-19, состоящий из фарингеаль-ного тампона для самостоятельного сбора образцов, реактивов для очистки РНК на основе Тризола и др. [22].
До сих пор обсуждается спектр сред организма, определение возбудителя COVID-19 в которых будет наиболее точным и простым в применении. Так, в литературе имеются данные о
результате ПЦР-тестирования образцов стула и ротоглотки и изучение корреляционных связей полученных данных [23]. В более крупном исследовании проанализировано в общей сложности 1070 различных образцов, собранных у 205 пациентов с COVID-19 [24]. Наиболее точные результаты получены при анализе бронхоальве-олярного лаважа (93%), за которым следовали мокрота (72%), мазки из носа (63%), анализ содержимого кисти фибробронхоскопа (46%), мазки из глотки (32%), анализ образцов стула (29%) и кровь (1%); при этом ни один из 72 образцов мочи не дал положительного результата. Благодаря простоте сбора материала, еще одной средой для выявления генома SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР стал конденсат выдыхаемого воздуха (ЕВС) в качестве образца. В перспективе, данный вариант отбора проб для определения возбудителя может быть использован в масштабных скрининговых исследованиях пациентов с подозрением на COVID-19 [25].
Несмотря на все достоинства ОТ-ПЦР, при анализе и сопоставлении результатов были выявлены и проблемы, основной из которых стала необходимость повторной постановки реакции, в том числе с образцами, полученными из нижних дыхательных путей, в ситуации отрицательного результата ОТ-ПЦР и наличия клинических проявлений COVID-19 [26]. Проанализировав опубликованные наборы праймеров и их соответствие 77 общедоступным последовательностям генома SARS-CoV-2 было установлено, что пять наборов праймеров ОТ-ПЦР (нацеленных на Orf1ab или ген N потенциально могут давать ложноотрицательные результаты, связанные с влиянием эволюционных процессов на вирусный геном. Для минимизации рисков получения ложноотрицательных или сомнительных результатов целесообразно ориентироваться на консервативный ген ^р12 (RdRp), проводить комплексное клинико-лабораторное обследование (например, ОТ-ПЦР и компьютерную томографию органов грудной полости), придерживаться высоких стандартов в вопросах процедуры отбора проб, следовать стандартам надлежащей лабораторной практики и т.п. [27].
Наряду с ОТ-ПЦР, актуальными методами диагностики новой коронавирусной инфекции, основывающимся на молекулярном строении SARS-CoV-2, являются петлевая изотермическая амплификация с обратной транскрипцией (ОТ^АМР) и амплификация рекомбинантной полимеразы обратной транскрипции (ОТ-РЯА), которые обладают рядом преимуществ: высокой специфичностью, быстротой и легкостью в использовании. Предлагаемые методы, используемые для детекции MERS-CoV, можно при-
менять и для раннего выявления SARS-CoV-2. Еще одним вариантом экспресс-скрининговой диагностики (требуемое время составляет до 30 минут) является обратная транскрипционная петлевая изотермическая амплификация (RT-LAMP) [28]. Многообещающей с точки зрения быстроты (время постановки варьирует от 15 до 40 минут) и высокой чувствительности (97,6%) стала разработка китайских исследователей на основе LAMP, в которой в качестве амплифици-рующего фрагмента взят ген ORF1ab [29].
Несмотря на то, что главное предназначение CRISPR/Cas технологии заключается в проведении геномного редактирования, тем не менее отдельные компоненты этих систем находят применение и в других областях [30; 31]. Так, в частности, с использованием CRISPR/Cas технологии недавно разработана высокоспецифичная и чувствительная CRISPR-nCoV система детекции нового коронавируса SARS-CoV-2 [32]. В ее основе лежит RPA амплификация, сопровождаемая транскрипцией полученных амплико-нов, несущих в составе одного из праймеров на 5'-конце экстрапоследовательность нуклеоти-дов, соответствующую фаговому промотору Т7, с помощью которого Т7 РНК полимераза нарабатывает множество копий молекул РНК, после чего включается нацеленная на разрушение молекул РНК Cas13a нуклеаза, формирующая со специальной sgРНК рибонуклеопротеидный комплекс, причем данная sgРНК несет гидовую последовательность, узнающую выбранную мишень на бетакоронавирусной РНК. При этом в растворе присутствует еще специальный репор-терный рибоолигонуклеотид. Нуклеаза Cas13a после активации фермента специфичной РНК, соответствующей участку-мишени SARS-CoV, за счет своей коллатеральной активности расщепляет уже неспецифически все присутствующие в реакционной смеси молекулы РНК, а так как специально добавленные репортерные молекулы РНК несут флуорохром и гаситель, то после физического разобщения последних, вследствие разрушения всех подряд молекул РНК, флуоресцентный краситель начинает светиться, что и регистрируется с помощью соответствующих устройств. Чувствительность данного теста находится на уровне единичных молекул вируса, а время, затрачиваемое на всю детекцию, составляет 40 минут, из которых 30 минут уходит на RPA амплификацию, а 10 минут - на CRISPR детекцию.
Другой группой исследователей была разработана система детекции SARS-CoV-2 также на основе CRISPR/Cas технологии, названная All-In-One-Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) [33]. В ней так же, как и в описанном выше
подходе, на первой стадии применяется RPA амплификация с той лишь разницей, что далее используется Cas12a нуклеаза, которая разрушает ДНК, и поэтому не требуется использование праймера с Т7 промотором, а в качестве репор-терных молекул служат подобные олигонукле-отиды с дезоксирибозой, несущие соответствующие флуорохром и гаситель флуоресценции. Подобная же работа по детекции SARS-CoV-2 с помощью CRISPR/Cas технологии с нуклеазой Cas12 выполнена еще одним международным коллективом, с той лишь разницей, что детекция результатов амплификации осуществляется двумя методами - регистрацией флуоресценции и тонкослойной хроматографией на бумаге [34].
Описан метод диагностики SARS-CoV-2 с использованием Cas12 нуклеазы с использованием тонкослойной хроматографии, получивший название SARS-CoV-2 DETECTR test. При этом на первой стадии для наработки продуктов амплификации применяется LAMP технология [35]. Данный тест завершается менее чем за 40 минут, из которых в течение первых 20-30 минут проводится петлевая амплификация, после чего 10 минут необходимо для Cas12 нуклеазы и разрушения репортерных олигонуклеотидов. Дополнительно две минуты затрачиваются на хроматографию. Анализ нескольких десятков образцов, как здоровых, так и больных с помощью SARS-CoV-2-DETECTR test продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность: 95% для положительных результатов и 100% - для отрицательных. Сравнение ОТ-ПЦР с SARS-CoV-2 DETECTR test позволяет надеяться на то, что последний при сходной чувствительности будет иметь некоторое преимущество по времени и доступности используемого оборудования, однако невозможен в количественном варианте.
В последнее время широкое применение для определения точной величины титра антител к SARS-CoV-2 находит иммуноферментный анализ (ИФА) [36]. Метод основан на взаимодействии иммобилизованного в лунках планшета антигена коронавируса со специфическими антителами из исследуемой пробы сыворотки и последующем выявлении полученного комплекса конъюгатом (меченными пероксидазой хрена специфическими антителами к IgG). Связанная пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена. В лунках развивается окраска, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антител в определяемой пробе. Для уточнения диагноза проводят повторные исследования клинического материала с интервалом 2-4 недели. Снижение
или увеличение титра антител напрямую связано с течением инфекционного процесса [37; 38]. Описаны протоколы ИФА для выявления антител к SARS-CoV-2, а также накоплены данные, полученные с помощью коммерческих наборов [36].
В доступной литературе уже есть результаты первых исследований на основе ИФА, посвященных изучению гуморального ответа на SARS-CoV-2. Так, выполнение анализов с использованием рекомбинантного вирусного ну-клеокапсида (N) по изучению IgA, IgM и IgG в 208 образцах плазмы из 82 подтвержденных и 58 вероятных случаев заболевания COVID-19 показало диагностическую ценность определения IgM [39]. Медиана времени обнаружения антител IgM и IgA составила 5 дней, в то время как IgG был обнаружен на 14-й день после появления симптомов, причем положительная частота составила 85,4%, 92,7% и 77,9% соответственно. В подтвержденных и вероятных случаях положительные показатели IgM-антител составили 75,6% и 93,1% соответственно. Эффективность обнаружения новой коронавирусной инфекции путем определения IgM с помощью ИФА была выше, чем у метода ОТ-ПЦР, спустя 5 дней после появления первых симптомов. Положительная частота обнаружения значительно возрастала (до 98,6%) при комбинированном анализе IgM с помощью ИФА и ОТ-ПЦР для каждого пациента по сравнению с одним тестом ОТ-ПЦР (51,9%).
Иммунологическое тестирование было также проведено у 16 пациентов в Гонконге с использованием образцов сыворотки крови, собранных через 14 дней или более после появления симптомов [4]. Были зарегистрированы следующие показатели серопозитивности: 94% для анти-N IgG (n=15), 88% для анти-N IgM (n=14), 100% для анти-RBD (рецепторсвязывающий домен) IgG (n=16) и 94% для анти-RBD IgM (n=15). Уровни IgG анти-SARS-CoV-2-N или анти-SARS-CoV-2-RBD коррелировали с титром нейтрализации вируса (R 2 >0 9). В исследовании, выполненном группой китайских ученых под руководством Fan Wu и Aojie Wang, охарактеризована реакция со стороны антител у 175 выздоровевших пациентов, у которых новая коро-навирусная инфекция протекала в легкой форме [40]. Параллельно ученые контролировали уровни специфических нейтрализующих антител (NAbs) к SARS-CoV-2 (анализ нейтрализации на основе псевдотипированных лентивирусных векторов) и S-связывающих антител (ИФА с использованием белков RBD, S1 и S2). SARS-CoV-2-специфичные NAbs были обнаружены у пациентов с 10-15-го дня после начала заболева-
ния и сохранялись после исчезновения симптомов. Перекрестной реактивности с SARS-CoV не наблюдалось. Титры NAbs коррелировали с S-связывающими антителами, нацеленными на области S1, RBD и S2. Пациенты пожилого и среднего возраста имели достоверно более высокие титры NAb в плазме крови (р<0,0001) и S-связывающих антител (р=0,0003), чем молодые пациенты. Интересен тот факт, что имела место положительная корреляция титров NAbs с уровнем С-реактивного белка в плазме крови, и отрицательная с количеством лимфоцитов у пациентов на момент поступления, что указывает на связь между гуморальным и клеточным иммунным ответом при COVID-19.
В исследовании Catalan-Dibene J., опубликованном в "Nature Reviews Immunology", продемонстрировано наличие вирусспецифичных В-клеток памяти, распознающих рецептор-свя-зывающий домен белка S у инфицированных SARS-CoV-2 пациентов [41]. Вирусологи наблюдали перекрестную активность антител у этих пациентов против S-белков SARS-CoV-2, но не против RBD SARS-CoV-1. С помощью секвенирования получено 206 специфичных к SARS-CoV-2 RBD моноклональных антител; причем два клона показали 98-99% блокирование вирусного входа, что коррелировало с высокой конкурирующей способностью против рецептора АПФ.
Проведен сравнительный анализов специфичности и эффективности определения антител (IgG и IgM) посредством ИФА и им-мунохроматографической серодиагностики с применением коллоидного золота (ИХГ) [42]. В исследовании использовано 63 образца для ИФА и 91 образец плазмы для ИХГ и обнаружена чувствительность комбинированного ИФА IgM и ИФА IgG, которая составила 87,3%, а также чувствительность ИХГ- 82,4%. Оба метода показали специфичность 100%. Liu Y. и соавторы сообщили об оценке N-и S-белковых IgM и IgGс помощью ИФА у 214 подтвержденных пациентов с COVID-19 [43]. Чувствительность S-основанного ИФА обнаружения IgM была значительно выше, чем у N-основанного ИФА. Рост чувствительности по обнаружению IgM и IgG наблюдался с увеличением числа дней от начала заболевания: так, положительная частота N-и S-основанных IgM и IgG была менее 60% на ранней стадии (0-10-й день) заболевания и повышалась через 10 дней.
Следует отметить, что серологические методы обладают рядом преимуществ: возможность выявления пациентов с высоким уровнем иммунного ответа для формирования когорты потенциальных доноров сывороток из реконвалесцентов;
скрининговое выявление тех, кто уже обладает иммунитетом (как среди медицинских работников, так и в популяции в целом) и т.д. При этом многие аспекты серологической диагностики продолжают оставаться предметом для дальнейших исследований, а именно: коррелируют ли титры антител со степенью иммунологической толерантности к COVID-19; какие именно изо-типы антител и уровни реактивности могут свидетельствовать о силе иммунного ответа; защищены ли пациенты с антителами к SARS-CoV-2 от повторного заражения; насколько реагенты для ИФА, созданные на основании азиатского штамма могут быть использованы для пациентов, инфицированных вирусами европейского происхождения и т.п. Серологический метод не лишен и недостатков, к которым можно отнести: чувствительность менее 60% на ранней стадии заболевания (день 0-8); необходимость обнаружения антител против 2 разных антигенов во избежание ложноотрицательных результатов; возможное наличие у пациентов системных заболеваний соединительной ткани и/или нарушений пуринового обмена, которые могут привести к ложноположи-тельной реактивности и т.п. [44; 45].
В связи с этим ряд исследователей рекомендуют «двойной» контроль: серологическую и молекулярную диагностику, который в комплексе дает максимальную валидность и исключает диагностические «упущения». Так, в исследовании Zhao R. и соавторы изучали динамику общего количества антител, IgM и IgG, против SARS-CoV-2 в серийных образцах крови, полученных у 173 подтвержденных пациентов с COVID-19 [46]. Антитела были обнаружены у <40% пациентов в течение 1 недели с момента начала заболевания и быстро увеличились до 94,3% - IgM и 79,8% - IgG к 15-му дню от начала заболевания. Напротив, выявляемость РНК с помощью ОТ-ПЦР снизилась с 66,7% в образцах, собранных до 7-го дня, до 45,5% между 15-м и 39-м днями. Таким образом, обнаружение РНК с помощью молекулярных методов и серологическая диагностика в комплексе значительно повышают чувствительность при выполнении диагностики COVID-19. При этом во избежание ложноотрицательных результатов целесообразно обнаружение антител против 2 различных (S- и N-основанных) антигенов [45].
В связи с вышеописанными особенностями и недостатками имеющихся диагностических инструментов в диагностике COVID-19 много нерешенных вопросов, которые требуют дальнейшего внимания исследователей, как с точки зрения совершенствования имеющихся методов, так и со стороны решения фундаментальных научных задач.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Сегодня уже стало очевидно, что новый вирус SARS-CoV-2 через некоторое время встанет в одну линейку с существующими вирусами и будет периодически приводить к вспышкам COVID-19. В связи с этим, оптимальное планирование профилактических и лечебных мероприятий требует налаживания точной диагностики. Чем больше чувствительность и специфичность тест-систем, тем более точно можно определить состояние пациента и спланировать лечебную тактику. С этой целью ведется разработка новых методов и подходов для раннего выявления вируса. На данный момент «золотым стандартом» диагностики COVID-19 является ОТ-ПЦР с КТ органов грудной клетки. Однако продолжаются исследования по разработке инновационных молекулярно-биологических методик, основанных на изотермической амплификации и ее модификации, хемилюменисцен-ции, CRISPR/Cas технологии и ряда других, что позволит существенно расширить возможности диагностики.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Wang M., Wu Q., Xu W. Clinical diagnosis of 8274 samples with 2019-novel coronavirus in Wuhan. doi :10.1101/2020.02.12.20022327v1.full.pdf.
2. WHO, Novel Coronavirus (2019-nCoV).
3. Chan J. F., Yuan S., Kok K. H., To K. K., Chu H., Yang J., Xing F., Liu J., Yip C. C. A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet. 2020 . pii: S0140-736(20)30154-9. https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/ PIIS0140-6736(20)30154-9/fulltext
4. Chen Y., Li L. SARS-CoV-2: virus dynamics and host response. Lancet Infect Dis. 2020. pii: S1473-3099(20)30235-8. https://www.thelancet.com/journals/ laninf/article/PIIS1473-3099(20)30235-8/fulltext
5. te Velthuis A.J., Fodor E. Influenza virus RNA polymerase: insights into the mechanisms of viral RNA synthesis. Nat Rev Microbiol. 2016;18:473-493.
6. Kirchdoerfer R.N., Ward A.B. Structure of the SARS-CoV nsp12 polymerase bound to nsp7 and nsp8 co-factors. Nature communications. 2019;10(1):1-9.
7. Ogando N.S., Ferron F., Decroly E., Canard B., Posthuma C., Snijder E. The Curious Case of the Nidovirus Exoribonuclease: Its Role in RNA Synthesis and Replication Fidelity. Front Microbiol, 2019;10:1813.
8. Gao Y., Yuan Y., Li T.T., Wang W.X., Li Y.X., Li A. Evaluation the auxiliary diagnosis value of antibodies
assays for detection of novel coronavirus (SARS-Cov-2) causing an outbreak of pneumonia (COVID-19). 2020:03.26.20042044.
9. Rice G.I., Thomas D.A., Grant P. J., Turner A.J., Hooper N.M. Evaluation of angiotensin-converting enzyme (ACE), its homologue ACE2 and neprilysin in angiotensin peptide metabolism. Biochem J 2004;383:4-51.
10. Imai Y., Kuba K., Ohto-Nakanishi T., Penninger J.M. Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE2) in Disease Pathogenesis. Circulation Journal Vol.74, March 2010.
11. Lin L., Lu L., Cao W., Taisheng Li. Hypothesis for potential pathogenesis of SARS-CoV-2 infection - a review of immune changes in patients with viral pneumonia. Emerging Microbes & Infections, 2020. doi:10.1080/2222 1751.2020.1746199.
12. Gu J., Han B., Wang J. COVID-19: Gastrointestinal manifestations and potential fecal-oral transmission. Gastroenterology. PMID 32142785 doi:10.1053/j.gastro.2020.02.054
13. Lan J., Ge J., Yu J., Shan S., Zhou H., Fan S., Zhang Q., Shi X., Wang Q., Zhang L., Wang X. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 2020 Mar 30. https://www. nature.com/articles/s41586-020-2180-5
14. Ortega J.T., Serrano M.L., Pujol F.H., Rangel H.R. Unrevealing sequence and structural features of novel coronavirus using in silico approaches: The main protease as molecular target EXCLI Journal 2020;19:400-409.
15. Adhikari S. P., Meng S., Wu Y. J., Mao Y. P., Ye R. X., Wang Q. Z., Sun C., Sylvia S., Rozelle S., Raat H., Zhou H. Epidemiology, causes, clinical manifestation and diagnosis, prevention and control of coronavirus disease (COVID-19) during the early outbreak period: a scoping review. Infectious diseases of poverty, 2020; 9(1): 1-12. doi:10.1186/s40249-020-00646-x.
16. Dhama K., Sharun K., Tiwari R., Dadar M., Malik Y.S., Singh K.P., Chaicumpa W. COVID-19, an emerging coronavirus infection: advances and prospects in designing and developing vaccines, immunotherapeutics, and therapeutics. Hum Vaccin Immunother 2020;18:1-7. doi:45310.1080/21645515.2020.1735227.
17. Hanff T.C., Harhay M.O., Brown, T.S., Cohen J.B., Mohareb A.M. Is there an association between COVID-19 mortality and the renin-angiotensin system — a call for epidemiologic investigations. Clin. Infect. doi:10.1093/ cid/ ciaa329 (2020).
18. Yu F., Du L., Ojcius D.M., Pan C., Jiang S. Measures for diagnosing and treating infections by a novel coronavirus responsible for a pneumonia outbreak originating in Wuhan, China. Microbes Infect. 2020. pii:S1286-4579(20)30025-3. https://reader.elsevier.com/ reader/sd/pii/S1286457920300253?token=F533A90BB95 2A07098709C62274972C65700B71A42CC8179DA9ADB 1C06E6257A7C447B6DBB151968FF1420353399BF4A
19. Chu D.K.W., Pan Y., Cheng S.M., Hui P., Krishnan P., Liu Y., Ng D.Y. M., Wan K.C., Yang P., Wang Q., Peiris M., Poon L.M. Molecular Diagnosis of a Novel Coronavirus
(2019-nCoV) Causing an Outbreak of Pneumonia, Clinical Chemistry, 2019;66(4):549-555. doi:10.1093/clinchem/ hvaa029
20. Moran A., Beavis K.G., Matushek S.M., Ciaglia C., Francois N., Tesic V., Love N. The Detection of SARS-CoV-2 using the Cepheid XpertXpress SARS-CoV-2 and Roche cobas SARS-CoV-2 Assays. J. Clin. Microbiol. 2020. pii: JCM.00772-20. https://jcm.asm.org/content/ jcm/early/2020/04/17/JCM.00772-20.full.pdf
21. Chan J.F., Yip C.C., To K.K., Tang T.H., Wong S.C., Leung K.H., Fung A.Y., Ng A.C., Zou Z., Tsoi H.W., Choi G.K., Tam A.R., Cheng V.C., Chan K.H., Tsang O.T., Yuen K.Y. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-RdRp/Hel real-time reverse transcription-polymerase chain reaction assay validated in vitro and with clinical specimens. J. Clin. Microbiol. 2020. pii: JCM.00310-20. https://jcm.asm.org/content/early/2020/02/28/JCM.00310-20.long
22. Won J., Lee S., Park M., Kim T.Y., Park M.G., Choi B.Y., Kim D., Chang H, Kim VN, Lee C.J. Development of a Laboratory-safe and Low-cost Detection Protocol for SARS-CoV-2 of the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19). Exp. Neurobiol. 2020. https://www.en-journal. org/journal/view.html?uid=513&vmd=Full#T1
23. Gorse G.J., Donovan M.M., Patel G.B. Antibodies to Coronaviruses Are Higher in Older Compared with Younger Adults and Binding Antibodies Are More Sensitive than Neutralizing Antibodies in Identifying Coronavirus-Associated Illnesses. J. Med. Virol. 2020. doi:10.1002/ jmv.25715
24. Wang W., Xu Y., Gao R. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 2020;323(18):1843-1844. doi:10.1001/jama.2020.3786.
25. Khoubnasabjafari M., Jouyban-Gharamaleki V., Ghanbari R., Jouyban A. Exhaled breath condensate as a potential specimen for diagnosing COVID-19. Bioanalysis Published online: 15 April 2020. doi:10.4155/bio-2020-0083
26. Tahamtan A., Ardebili A. Real-time RT-PCR in COVID-19 detection: issues affecting the results. Expert. Rev. Mol. Diagn. 2020. doi:10.1080/14737159.2020.175 7437
27. Xia J.G., Zhao J.P., Cheng Z.S., Hu Y., Duan J., Zhan Q.Y. Non-invasive respiratory support for patients with novel coronavirus pneumonia: clinical efficacy and reduction in risk of infection transmission. Chin. Med. J. (Engl). 2020. https://journals.lww.com/cmj/Citation/ publishahead/Non_invasive_respiratory_support_for_ patients_with.99377.aspx
28. Lamb L.E., Bartolone S.N., Ward E., Chancellor M.B. Rapid Detection of Novel Coronavirus (COVID-19) by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification medRxiv, 2020. doi:10.1101/2020.02.19.20 025155v1
29. Yu L., Wu S., Hao X., Li X., Liu X., Ye S., Han H., Dong X., Li X., Li J., Liu J., Liu N., Zhang W., Pelechano V., Chen W-C., Yin X. Rapid colorimetric detection of
COVID-19 Coronavirus using a reverse tran-scriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic plat-form: iLACO medRxiv February 24, 2020. doi:10.1101/2020.02.20.20025874v1
30. Kuluev B. R., Baimiev An. Kh., Chemeris D. A., Matniyazov R. T., Gerashenkov G. A., Nikonorov Yu. M., Baimiev Al. Kh., Chemeris A. V. CRISPR application loci not for genome editing. Biomics. 2017;9:271-283.
31. Chemeris D. A., Kiryanova O. Yu., Gerashenkov
G. A., Kuluev B. R., Rozhnova N. A., Matniyazov R. T., Baimiev An. Kh., Baimiev Al. Kh., Gubaidullin I. M., Chemeris A. V. Bioinformatics resources for CRISPR / Cas editing genomes. Biomics. 2017;9:203-228.
32. Hou T., Zeng W., Yang M., Chen W., Ren L., Ai J., Wu J., Liao Y., Gou X., Li Y., Wang X., Su H., Gu B., Wang J., XuT. Development and Evaluation of A CRISPR-based Diagnostic For 2019-novel Coronavirus medRxiv 2020.02.22.20025460. doi:10.1101/2020.02.22.20025460
33. Ding X., Yin K., Li Z., Liu C. All-in-One Dual CRISPR-Cas12a (AIOD-CRISPR) Assay: A Case for Rapid, Ultrasensitive and Visual Detection of Novel Coronavirus SARS-CoV-2 and HIV virus at the Point of Care Dimensions? March 2020 5(17)/ https://app. dimensions.ai/details/publication/pub.1127229539
34. Curi L., Federico P.-B., Gimenez C.A. An ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS- CoV-2 sequence detection method based on CRISPR- Cas12. bioRxiv. doi:10.1101/2020.02.29.971127.
35. Broughton J.P., Deng X., Yu G., Fasching C.L., Servellita V., Singh J., Miao X., Streithorst J.A., Granados A., Sotomayor-Gonzalez A., Zorn K., Gopez A., Hsu E., Gu W., Miller S., Pan C.Y., Guevara H., Wadford D.A., Chen J.S., Chiu C.Y. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020 Apr 16.https://www.nature. com/articles/s41587-020-0513-4
36. Amanat F., Stadlbauer D., Strohmeier S. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nat Med. 2020. doi:10.1038/s41591-020-0913-5
37. Gonzalez-Reiche A., Hernande M. Introductions and early spread of SARS-CoV-2 in the New York City area Research Gate 2020.5(16) https://www.researchgate.net/ publication/341754585_Introductions_and_early_spread_ of_SARS-CoV-2_in_the New York City area
38. Hu Z., Song C., Xu C., Jin G., Chen Y., Xu X., Ma
H., Chen W., Lin Y., Zheng Y. Clinical characteristics of 24
asymptomatic infections with COVID-19 screened among close contacts in Nanjing, China. Sci China Life Sci. 2020. 63, 706-711. doi:10.1007/s11427-020- 1661-4
39. Dudley J.P., Lee N.T. Disparities in Age-Specific Morbidity and Mortality from SARS-CoV-2 in China and the Republic of Korea. Clin Infect Dis. 2020 Mar 31. pii:ciaa354. doi:10.1093/cid/ciaa354/5813861
40. Wu F., Wang A., Liu M., Wang Q., Chen J., Xia S., Ling Y., Zhang Y., Xun J., Lu L., Jiang S., Lu H., Wen Y., Huang J. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in a COVID-19 recovered patient cohort and their implications April 20, 2020. doi:110.1101/2020.03.30.200 47365v2
41. Catalan-Dibene J. Human antibodies can neutralize SARS-CoV-2. Nat. Rev. Immunol. 2020 Apr 14. https://www.nature.com/articles/s41577-020-0313-6
42. Xiang J., Yan M., Li H., Liu T., Lin C., Huang S., Shen C. Evaluation of Enzyme-Linked Immunoassay and Colloidal Gold- Immunochromatographic Assay Kit for Detection of Novel Coronavirus (SARS-Cov-2) Causing an Outbreak of Pneumonia (COVID-19) March 01, 2020. doi:110.1101/2020.02.27.20028787v1
43. Liu Y., Liu Y., Diao B., Ren F., Wang Y., Ding J., Huang Q. Diagnostic Indexes of a Rapid IgG/IgM Combined Antibody Test for SARS-CoV-2. doi:10.1101/2 020.03.26.20044883. PPR:PPR130625.
44. Wang Q., Du Q., Guo B., Mu D., Lu X., Ma Q., Guo Y., Fang L., Zhang B., Zhang G., Guo X. A method to prevent SARS-CoV-2 IgM false positives in gold immunochromatography and enzyme-linked immunosorbent assays. J Clin. Microbiol. 2020 Apr 10. pii:JCM.00375-20. https://jcm.asm.org/content/ early/2020/04/09/JCM.00375-20.long
45. Okba N.M.A., Müller M.A., Li W., Wang C., Geurtsvan Kessel C.H., Corman V.M., Lamers M.M., Sikkema R.S., de Bruin E., Chandler F.D., Yazdanpanah Y., Le Hingrat Q., Descamps D., Houhou-Fidouh N. Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2-Specific Antibody Responses in Coronavirus Disease 2019 Patients. Emerg Infect Dis. 2020 Apr 8;26(7). https:// wwwnc.cdc.gov/eid/article/26/7/20-0841_article
46. Zhao R., Li M., Song H. Serological diagnostic kit of SARS-CoV-2 antibodies using CHO-expressed full-length SARS-CoV-2 S1 proteins. medRxiv. 2020;27:20042184.
