CC BY
87
Диагностика аллергических реакции к натрия бензоату путем определения антител и сенсибилизации гранулоцитов
Титова Н.Д.
Белорусская медицинская академия последипломного образования
- mmmm-
Diagnosis of adverse reactions to sodium benzoate is difficult due to a variety of mechanisms involved in their implementation and the lack of sufficiently reliable methods to determine them. We have surveyed 114 adults and 68 children with allergic diseases using clinical and laboratory tests. To determine the sensitization of granulocytes to the preservative sodium benzoate (E211) used the reaction release of myeloperoxidase by granulocytes (RRM) and the reaction of damaging leukocytes by the antigen (DLA). Positive DLA -test to sodium benzoate was at 5,3% of adults, a positive RRM have 7,8% of adults and 11,8% of children. IgE, IgG, IgA-antibodies to sodium benzoate were determined by ELISA. IgEantibodies were detected in 10.4% of adults and 16,2% of children, IgG-antibodies in 2,1% and 8,8%, IgA-antibodies in 4,2% and 11,8% respectively. Application in practice of complex techniques will increase the accuracy of the diagnosis of allergy to sodium benzoate. TITOVA N.D. Diagnosis of allergic reactions to sodium benzoate by the detection of antibodies and sensitization of granulocytes
В Республике Беларусь и за рубежом в процессе изготовления пищевых продуктов широко используются консерванты. Один из наиболее распространенных консервантов - натрия бен-зоат [3].
Натрия бензоат (Е211), природный консервант, входит в состав некоторых плодов. При рН пищевой среды не выше 4,5 бензоаты превращаются в свободную бензойную кислоту. Антибактериальное действие бензоата натрия связано с подавлением в клетках активности ферментов, ответственных за окислительно-восстановительные реакции. Он угнетает рост преимущественно дрожжей, плесневых грибов и бактерий масляно-кислого брожения [1, 2]. Кроме того, натрия бен-зоат уменьшает активность ферментов, расщепляющих жиры и крахмал. Наиболее часто используется в газированных напитках и консервах, маргаринах, а также в лекарствах от кашля, поскольку обладает отхаркивающим действием. Также натрия бензоат широко используется в косметике, красках для волос [1-3].
Натрия бензоат при пероральном приеме быстро и практически полностью всасывается и выводится на 90% с мочой в течение 24 часов, всасывание через кожные покровы также довольно высокое - до 40%. Основными метаболитами натрия бензоата являются гиппуровая и бензоил-глюкуроновая кислоты, которые образуются в результате конъюгации бен-
зойной кислоты с глицином или глюкуро-новой кислотой в печени и почках [11].
Установлено, что бензоаты и натрия бензоат могут провоцировать анафилактические реакции, крапивницу, отек Квинке, бронхиальную астму, гиперактивность у детей [9, 11]. Также натрия бензоат может быть триггером персистирующего ринита [12].
При взаимодействии с витамином С образуются бензол (сильный канцероген). Бензоат натрия подавляет неспецифический иммунитет (фагоцитоз, межклеточный киллинг).
Механизм развития непереносимости натрия бензоата изучен мало. Предполагается участие как 1дЕзависимых, так и 1дЕнезависимых аллергических и неаллергических реакций, а также индукция псевдоаллергических реакций в связи с прямым действием на чувствительные клетки, выделяющие медиаторы. Возможны дисметаболические эффекты, обусловленные ингибицией простаглан-динсинтетазы и усилением образования лейкотриенов [4, 7, 9].
Цель исследования - диагностика аллергических реакций на бензоат натрия у больных аллергическими заболеваниями путем определения 1дЕ, 1дА антител и специфических реакций на него гранулоцитов.
Материалы и методы
Нами было обследовано 114 взрослых (60 женщин и 54 мужчины в возрасте от
18 до 65 лет) с аллергическими заболеваниями: бронхиальная астма легкой и средней степени тяжести (БА) - 68, ато-пический дерматит (АД) - 21, сочетание АД+БА - 7, хроническая рецидивирующая крапивница (ХРК) - 18. Также было обследовано 68 детей (36 мальчиков и 32 девочки в возрасте от 3 до 14 лет) с аллергическими заболеваниями: БА - 36 детей, АД - 20, сочетание БА и АД - 12. Пациенты находились в аллергологи-ческих отделениях Минской городской больницы № 10, Витебской областной больницы, Витебской областной детской больницы.
Клиническое обследование включало общие анализы крови и мочи, ЭКГ спирографию (больные с БА), УЗИ органов брюшной полости, ФГДС, кожные пробы (с бытовыми, пыльцевыми и пищевыми аллергенами). Забор крови для лабораторных исследований проводился до постановки кожных проб. Непереносимость пищевых продуктов промышленного производства с наличием в их составе пищевых добавок (красители, консерванты и др.) отмечали 30 из 114 (26,3%) взрослых пациентов и 24 из 68 (35,3%) детей. Учитывались все возможные реакции: тошнота, сыпи, колики, понос, рвота, затруднение дыхания, кашель, зуд на любые окрашенные или консервированные продукты, напитки, мороженое, шоколад, конфеты, йогурты, печенье и др. Шесть пациенток жаловались на непереносимость косметических средств (зуд, покраснение); у двоих были покраснение кожи на лице и жжение на краску для волос; у одного - сыпь на стиральный порошок.
Родители почти всех детей, включенных в исследование, отмечали непереносимость пищевых добавок. Однако данные проведенного нами подробного анкетирования показали, что у 24 из 68 детей наиболее вероятно наличие реакций на пищевые добавки. У 6 детей развивались реакции на прием ярко-окрашенных газированных напитков по типу крапивницы и зуда, возникающие в
№5^ 2011
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |71
течение 10-15 минут после употребления напитков, у 12 детей с атопическим дерматитом родители отмечали резкое ухудшение состояния кожи и появления зуда после нарушения диеты и употребления детьми конфет, пирожных, йогуртов, других кондитерских изделий. У 2 детей были аллергические реакции в виде сыпи и зуда на лекарственные препараты в форме суспензии и другие лекарства в сиропах. У 3 детей (с БА) родители отмечали затруднение дыхания, головную боль после употребления копченостей, колбас, сосисок, в которых в качестве ан-тиоксидантных и антимикробных средств преимущественно содержатся сульфиты, нитриты и бензоаты, а также усилитель вкуса глютамат натрия.
У одной девочки 7 лет с АД скари-фикационные пробы и 1дЕантитела к пищевым и бытовым аллергенам были отрицательными, в то же время в сыворотке крови выявлялись 1дЕантитела к натрия бензоату. По данным анамнеза, у нее была сыпь на аспирин, ампициллин, высыпания на коже после применения смягчающего крема для рук; реакций на пищевые продукты не отмечалось.
Контрольную группу составили 25 взрослых и 20 детей без аллергических заболеваний.
Для выявления специфических 1дЕ и ^-зависимых реакций гранулоцитов на натрия бензоат (Е211) использована реакция выброса миелопероксидазы гра-нулоцитами (РВМ) и реакция антиген-ин-дуцированного повреждения лейкоцитов (РАПЛ) [5,6].
В РВМ после инкубации гранулоци-тов с 0,01% раствором натрия бензоата гранулоциты, связавшие 1дЕ и ^-анти-тела, активируются и секретируют мие-лопероксидазу. Прирост ее активности в надосадочной жидкости оценивают по интенсивности окраски субстрат-хромо-генной смеси (тетраметилбензидина и перекиси водорода) [5].
В РАПЛ после инкубации гранулоци-тов с 0,01% раствором натрия бензоата в лунки добавляют по 0,05 мл 0,1% раствора трипановой синьки и подсчитывают процент окрашенных (поврежденных) гранулоцитов в лунках с красителем и в контрольных пробах. Реакция считается положительной, если более 15% гранулоцитов в опытных по сравнению с контрольными пробами окрашиваются синькой [6].
Определение специфических 1дЕ, и 1дА-антител проводилось методом иммуноферментного анализа [4] с использованием набора моноклональных антител производства ООО «Полигност»
(Санкт-Петербург). Выбор разведений исследуемых сывороток крови проводился на основе обработки кривых их титрования, при котором значения исследуемого параметра с известной вероятностью попадают на средний участок кривой титрований (для 1дЕантител это был титр 1:4, для IgG-антител - 1:100, для IgA-антител - 1:25).
Результаты оценивали с помощью анализатора ADAP Anthos Labtec Instruments при длине волны 450/620 нм. Результаты учитывали в соответствии с правилами иммуноферментного анализа. Анализ считали действительным, если при замере на анализаторе оптическая плотность в отрицательной лунке не превышала 0,300 е.д. оптической плотности. Все пробы дублировали. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программ MS Excel, Statsoft Statistica 7.
Результаты и обсуждение
К натрия бензоату положительные реакции в РАПЛ были выявлены у 6 из 114 (5,3%), в РВМ - у 8 из 102 (7,8%) взрослых пациентов (табл. 1). У 5 обследованных, по данным анамнеза, имелась непереносимость напитков (в виде сыпи, кожного зуда) в составе которых имелся консервант натрия бензоат, трое не отмечали каких-либо реакций при употреблении продуктов, содержащих данный консервант. Положительная РВМ и РАПЛ к натрия бензоату встречались в контрольной группе у 1 из 25 обследованных. Между опытной (пациенты с аллергическими заболеваниями) и контрольной группой (пациенты без аллергических заболеваний) имелись достоверные различия (см. табл. 1). В группе пациентов с аллергическими заболеваниями достоверно чаще встречались реакции гранулоцитов на натрия бензоат.
У 48 взрослых и 68 детей с аллергическими заболеваниями были опреде-
Таблица 1 | Результаты РВМ и РАПЛ к натрия бензоату у больных с аллергическими заболеваниями
Реакции Больные аллергией Контрольная группа (n = 25)
РВМ (n = 102) 8 (7,8%)* 1 (4%)
РАПЛ (n = 114) 6 (5,3%)* 1 (4%)
* Достоверность различий с контрольными группами (Манна-Уитни U-тест), p=0,005.
лены 1дЕ, и 1дА-антитела к натрия бензоату.
1дЕантитела к натрия бензоату у взрослых в сыворотке крови выявлялись у 5 (10,4%) из 48, ^-антитела - у 1(2,1%), 1дА-антитела - у 2 (4,2%) (табл. 2).
К натрия бензоату IдЕЕ антитела в сыворотке крови определялись у 11 детей, (16,2%), ^-антитела были в сыворотке крови у 6 детей (8,8%), 1дА-антитела к бензоату натрию были обнаружены у 8 детей (11,8%) (табл. 2).
У 20 детей контрольной группы 1дЕан-титела к натрия бензоату не выявлялись. Низкий уровень ^-антител к натрия бензоату обнаружен у одного ребенка. 1дА-антитела к натрия бензоату выявлены у 2 детей контрольной группы.
Следовательно, наличие 1дЕантител к натрия бензоату было характерно для детей и взрослых с аллергическими заболеваниями (р<0,05).
При сравнении групп взрослых и детей с аллергическими заболеваниями было выявлено, что 1дЕ антитела и сенсибилизация гранулоцитов в РВМ встречаются примерно с одинаковой частотой.
и 1дА-антитела к бензоату натрия обнаруживаются в сыворотке крови у детей с аллергическими заболеваниями почти в два раза чаще, чем у взрослых (р<0,05). Достоверных различий между контрольными группами взрослых и детей не выявлено (р>0,05).
У детей между 1дЕ^ антителами и 1дЕ1дА антителами к бензоату натрия
Таблица 2| Антитела к натрия бензоату у взрослых и детей с аллергическими заболеваниями
Виды антител Взрослые Дети
Больные аллергией (n=48) Контрольная группа (n=25) Больные аллергией (n=68) Контрольная группа (n=20)
IgE- антитела 5 (10,4%)* 0 11 (16,2%)* 0
IgG-антитела 1(2,1%)** 2 (8%) 6 (8,8%)** 1(5%)
IgA-антитела 2 (4,2%)** 1 (4%) 8 (11,8%)** 2(10%)
'Достоверные различия с контрольными группами, р <0,05. "Достоверные различия между группами детей и взрослых, р <0,05.
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ
№5^ 2011
72
определялась умеренная корреляция (соответственно r = 0,487 и r = 0,413, p<0,05). Сенсибилизация гранулоцитов в РВМ выявлялась у 8 (11,8%) детей и имела высокую корреляцию с 1дЕантителами (r = 0,770, p<0,05) и умеренную с IgG-антителами (r = 0,420, p<0,05) и IgA-ан-тителами (r = 0,428, p<0,05). У взрослых с аллергическими заболеваниями сенсибилизация гранулоцитов в РВМ имела умеренную корреляцию с 1дЕантитела-ми (r = 0,324, p<0,05) и IgG-антителами (r = 0,399, p<0,05). Эти данные указывают на то, что сенсибилизация гранулоцитов у детей в отличие от взрослых имеет в большей степени 1дЕзависимый механизм. Между IgEIgG антителами и IgG-IgA антителами к натрия бензоату определялась слабая положительная связь (соответственно r = 0,151 и r = 0,250, p<0,05). Между результатами РАПЛ и РВМ выявлялась умеренная корреляционная взаимосвязь (r=0,476, p<0,05), что подтверждает определение в этих тестах сходных (гранулоцитарных) механизмов аллергических реакций.
При сравнении лабораторных и клинических данных было выявлено, что у 7 из 11 детей наличие ^Еантител к натрия бензоату в сыворотке крови совпадало с анамнестическими данными (реакции по типу крапивницы на напитки, кондитерские изделия, косметику). У 4 детей с БА родители не замечали каких-либо побочных реакций на продукты, содержащие данный консервант. Тем не менее у 3 из этих детей наряду с IgE антителами присутствовали также IgG и/или IgA-антитела к натрия бензоату, что, возможно, имело протективное значение.
Из 5 взрослых с IgE антителами к натрия бензоату 3 человека (у одного сочетание БА и ХрК, двое с ХРК) имели четкую анамнестическую связь между употреблением газированных напитков, копченостей, колбас с симптомами заболевания, 2 обследованных не замечали такой связи.
Диагностика побочных реакций на натрия бензоат затруднена в связи с различными механизмами их реализации, отсутствием достаточно достоверных методов их определения [4, 5]. Для диагностики непереносимости натрия бензо-ата используются клинические методы, провокационные тесты, кожные скарифи-кационные, аппликационные, прик-тесты, а также определение специфических IgE-антител и другие методы in vitro. Для выявления клинических признаков непереносимости натрия бензоата выясняют, были ли любые реакции (неприятные ощущения в животе, колики, понос, рво-
та, высыпания на коже) на напитки (кола, соки, тархун и др.), кондитерские изделия (пирожные, конфеты, мороженое и др.), лекарства, косметические средства (содержащие консервант), а также любые консервированные пищевые продукты [8]. Для диагностики аллергии и установления связи между приемом определенной пищи и симптомами болезни большое значение имеет ведение больным пищевого дневника.
По данным зарубежных исследователей, кожные (prick) тесты и аппликационные (patch) тесты к пищевым добавкам (натрия бензоату, тартразину, солнечному желтому, амаранту и др.) редко оказываются положительными и не совпадают с данными анамнеза и перорального тестирования [10]. Диагностика гиперчувствительности к натрия бензоату базируется в основном на двойном плацебо контролируемом пероральном тестировании. Однако провокационные тесты могут привести к развитию тяжелой системной реакции и редко оказываются положительными (в среднем в 2-3 случаях из 100 пациентов с хронической крапивницей) [11, 13], даже при наличии лабораторных доказательств аллергии [14].
Натрия бензоат и другие пищевые добавки, являясь гаптенами, после соединения с белками, полисахаридами, липидами и другими макромолекулами-носителями превращаются в высокоим-муногенные комплексы, к которым могут синтезироваться антитела [4, 7].
К наиболее информативным in vttro тестам, позволяющим выявлять наличие антител к пищевым добавкам, относятся радиоаллергосорбентный тест и иммуно-ферментный анализ с определением IgE и иногда IgG-антител [4, 7-9]. Кроме того, для выявления непереносимости натрия бензо-ата применяют клеточный тест (Cellular Allergen Stimulation Test - CAST), основанный на увеличении продукции сульфидолейкотри-енов базофилами периферической крови под влиянием пищевых добавок [14]. В этом плане применение нами более простых и информативных методов обнаружения сенсибилизации гранулоцитов, позволяет выявить вклад этих клеток в развитие аллергии на пищевые добавки, такие как натрия бензоат. Комплексное определение клеточной сенсибилизации и антител в сыворотке крови у больных к пищевым добавкам позволяет улучшить диагностику аллергических реакций.
Выводы
1. Антитела класса IgE достоверно чаще выявляются у детей и взрослых с аллергическими заболеваниями по
сравнению контрольными группами. Достоверных различий между частотой нахождения IgG- и IgA-антител к натрия бензоату у детей и взрослых с аллергическими заболеваниями и контрольными группами выявлено не было.
2. IgG- и IgA-антитела к бензоату натрия обнаруживаются в сыворотке крови у детей с аллергическими заболеваниями чаще, чем у взрослых (p<0,05).
3. Выявленная в РВМ и РАПЛ сенсибилизация гранулоцитов (нейтрофилов, эо-зинофилов, базофилов) к натрия бензоа-ту чаще встречается у детей и взрослых с аллергическими заболеваниями, чем в группах сравнения, и имеет диагностическое значение (p<0,05).
4. Между наличием антител IgE, IgG и IgA и сенсибилизацией гранулоцитов к натрия бензоату существуют корреляционные взаимосвязи различной степени выраженности. Высокая корреляция ^Еантител и сенсибилизации гранулоцитов у детей указывает на ее ^Езависимый механизм.
5. Практическое применение комплекса методов, включающего определение IgE, IgG, IgA-антител и сенсибилизации гранулоцитов (в РВМ и РАПЛ), повышает точность диагностики аллергии к натрия бензоату, учитывая ее разнообразные механизмы.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Болотов В.М., Нечаев А.П., Сарафанова Л.А. Пищевые красители: классификация, свойства, анализ, применение. - СПб.: ГИОРД, 2008. - 240 с.
2. Булдаков А.С. Пищевые добавки. - М.: ДеЛи-принт, 2003. - 436 с.
3. Гигиенические требования к качеству и безопасности пищевых добавок и их применению: Санитарные правила и нормы 13-10 Рб 2002. - Минск: Минздрав РБ, 2003.
4. НовиковД.К., Новиков П.Д. Клиническая иммунопатология. - М., 2009. - 366 с.
5. Новиков П.Д. Новикова Н.Д. Инструкция на метод «Метод диагностики аллергии в реакции выброса мие-лопероксидазы гранулоцитами». - МЗ РБ, 2005. - 6 с.
6. Новиков П.Д., Титова Н.Д., Янченко В.В, Кар-пук И. Ю. Инструкция по применению «Метод диагностики аллергии на местные анестетики и пищевые красители с помощью реакции антигенин-дуцированного повреждения лейкоцитов». - МЗ РБ, 2010. - 36 с.
7. Ройт А. и др. Иммунология. - М.: 2000. - 450 с.
8. Титова Н.Д. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2008. - № 2 - P. 41-46.
9. Cantani A. Pediatric Allergy, Asthma and Immunology. - Springer, 2008. - Р. 700-708.
10. Heung-Woo Park, Chang-Han Park, Su-Hwa Park et al. // J. Allergy Clin. Immunol. -2008. - Vol. 121, N 4. - Р. 1059-1061.
11. Nair B. // Int. J. Toxicol. - 2001. - Vol. 20, suppl. 3 -P. 23-50.
12. Pacor M.L., DiLorenzo G, MartinelliN. et al. // Allergy. - 2004. - Vol. 59, N 2. - P. 192-197.
13. Wilson B.G., Bahna S.L. // Ann. Allergy Asthma Immunol. - 2005. - Vol. 95, N6. - P. 499-507.
14. Worm M, Vieth W, Ehlers I. et al. // Clin. Exp. Allergy. - 2001. - Vol. 31, N2. - P. 265-273.
Поступила 07.02.2011 г.
№5« 2011
МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ |73
