CC BY
30
УДК616-002.4:616.336
Силина Е.В., Севковский И.А., Свирский А.А., Махлин А.М., Валек Л.В.,
Мараховский К.Ю. ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ КАЧЕСТВЕННО-КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ БИОМАРКЕРОВ КИШЕЧНОГО ВОСПАЛЕНИЯ У НОВОРОЖДЕННЫХ С ХИРУРГИЧЕСКОЙ СТАДИЕЙ НЕКРОТИЗИРУЮЩЕГО ЭНТЕРОКОЛИТА Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр
детской хирургии»
Некротизирующий энтероколит (НЭК) является одним из самых тяжелых заболеваний недоношенных новорожденных, при котором уровень смертности в группе пациентов, с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) и гестационным возрастом менее 30 недель, нуждающихся в хирургическом лечении, может достигать 80%. [1,3,11]. Многочисленные исследования показали, что этиология НЭК мульти-факториальна [2,5,12], но доказанные эффективные прогностические и превентивные мероприятия для данного заболевания разработаны недостаточно [4,7]. Из-за особенностей проявления заболевание не всегда удается диагностировать до клинической манифестации. Дефицит достоверных методов ранней диагностики может привести к ухудшению состояния пациента и неблагоприятным клиническим исходам.
Одной из основных проблем клинического характера является дифференциальная диагностика НЭК с другой патологией недоношенных новорожденных детей из-за не специфичности проявлений, обусловленных физиологической незрелостью, прежде всего, кишечника [6]. Эта незрелость приво -дит к проблемам с барьерной функцией, нарушению всасывания, изменениям состава микрофлоры кишечника и отклонениям в регуляции кровообращения. Пусковым механизмом НЭК являются ишемия и цирку-ляторные нарушения в кишечнике на фоне стрессовых ситуаций, вызывающих у новорожденных централизацию кровообращения или локальное нарушение мезентериального кровотока, в результате чего через слизистую кишечной трубки с нарушенной
барьерной функцией, происходит транслокация микрофлоры в кровеносное русло, изъязвление слизистой, коагуляционный некроз и перфорация [5]. Разработка методов для раннего выявления этих нарушений, приведет к совершенствованию подходов диагностики НЭК.
Метод диагностики должен надежно верифицировать патологию на начальном этапе развития, быть дешевым, портативным, точным, неинвазивным, простым в использовании, иметь высокую разрешающую способность, чувствительность и специифи-чность [8]. Определение конкретного биомаркера или панели биомаркеров может позволить обнаруживать случаи некротического энтероколита на ранней стадии [10]. Идеальные биомаркеры должны помочь дифференцировать некротический энтероколит от сепсиса и других заболеваний недоношенных новорожденных, и тем самым избежать операции. Среди группы потенциальных молекулярных прогностических факторов [10] в качестве индикатора для дифференциальной диагностики НЭК от других болезней у новорожденных выделяют фекальный кальпротектин (ФК) [9,13].
Кальпротектин - основной белок цитолиза, связывающий ионы кальция и цинка, и обладающий бактериостатическим и фунгицидным действием. Вызывает апоптоз, проявляет хемотаксическую активность. Устойчив к ферментному расщеплению, стабилен в кале в течение 7 дней при комнатной температуре. Кальпротектин выделяется в больших количествах с калом при повреждении слизистой оболочки кишечника, является маркером активности
лейкоцитов и воспаления в желудочно-кишечном тракте [20, 21, 22, 23]. Фекальные концентрации кальпротектина увеличиваются у новорожденных с НЭК.
По данным литературы увеличение кальпротектина в кале выше 500 мкг/г позволяет рассматривать его в качестве маркера повреждений кишечника и может использоваться у недоношенных детей с прогрессирующим течением НЭК [24].
Цель исследования. Определить наибо -лее информативные неинвазивные методы диагностики некротизирующего энтероко -лита у новорожденных, в том числе и недоношенных.
Материалы и методы исследования. Научно исследовательская работа проводилась в рамках исследований и разработок общегосударственного отраслевого назначения, направленных на научно-техническое обеспечение деятельности Минздрава по теме: «Разработать и внедрить алгоритм оказания медицинской помощи новорожденным при некротизирующем энтероколите» в период с 2015 по 2016 годы. Были обследованы пациенты с некротизирующим энтероколитом, поступившие для хирургического лечения осложнений заболевания в РНПЦ детской хирургии. В рамках проводимого исследования были выполнены тесты по неинвазивному определению показателей кальпротектина, лактоферрина, трансферрина в кале у пациентов двух групп: у первой с некротизирующим энтероколитом, и второй с нарушением пассажа по желудочно-кишечному тракту при другой тяжелой патологии (ВПС, сепсисе, болезни Гиршпрунга и др). Кроме того, эти показатели определены у здоровых доношенных новорожденных группы контроля на 3-5 сутки жизни, находившихся в физиологическом отделении роддома 1 Городской клинической больницы г. Минска.
Определение концентрации фекального кальпротектина, трансферрина, лактоферри-на и скрытой крови проводилось при помощи набора для экспресс-анализа «Мульти Тест». «Мульти Тест» - это высокочувствительный, комбинированный иммунохроматографический экспресс-тест для качественного определения в кале
гемоглобина, трансферрина, кальпротектина и лактоферрина. Набор для экспресс-анализа состоит из тест-полосок. Каждая тест-полоска содержит мембрану, пропитанную мышиными моноклональ-ными антителами, содержащую две тест-зоны к соответствующим маркерам. Для сбора анализа специальной подготовки не требовалось. Образцы кала помещались в чистые контейнеры и могли храниться в таком виде 7 дней при температуре 2-8 С.
Полученные данные обработаны с применением статистической on-line программы https://medcalc.net/stats/.
Результаты исследования. В первой группе детей, прооперированных на базе РНПЦ детской хирургии по поводу НЭК в течение 2015-16 гг., удалось получить материал для диагностических тестов до операции у 22 пациентов. Так же обследован 21 ребенок из второй группы пациентов - группы сравнения, у которых была клиника нарушения транзита по ЖКТ, вздутие живота, застойное отделяемое по желудочному зонду, прожилки крови в стуле. Эти пациенты, находились на лечении в отделениях реанимации РНПЦ «Мать и дитя» и РНПЦ детской хирургии по поводу различной патологии, и детям проводилась дифференциальная диагностика с НЭК. В каждой из групп проводились количественно-качественные анализы кала на выявление трансферрина, кальпротек-тина и лактоферрина с применением набора для эксперс-анализа «Мульти Тест». Для интерпретации и оценки результатов, полученные данные были переведены в бинарную шкалу, где положительный результат принимали за один балл (1), а отрицательный результат - 0 баллов, вне зависимости от количественной составляющей интерферентных значений различного окрашивания тест полосок.
Основные характеристики групп. Группа контроля (условно здоровые доношенные новорожденные) 16 пациентов, с преобладающим средним весом 3,2 кг, средним возрастом 4 дня на момент взятия анализа, лабораторные данные показателей фекальных маркеров приведены в таблице 1.
Таблица 1. Показатели кальпротектина, трансферрина и лактоферина в кале здоровых
доношенных детей (n=16)
Показатель среднее 95% ДИ Шапиро - Уилк тест
Трансферрин 0,1875 0,02730 - 0,4023 W=0,4843 reject Normality (P<0,0001)
Кальпротектин 0,8125 0,5977 - 1,0273 W=0,4843 reject Normality (P<0,0001)
Лактоферрин 0,6875 0,4324 - 0,9426 W=0,5909 reject Normality (P<0,0001)
Как видно из таблицы с учетом полученной однородности системы определения различных показателей (трансферрин, кальпроте-ктин, лактоферрин) возможно проведение сравнения этих показателей с установлением наличия или отсутствия разницы в частоте выявления положительного результата. Получены следующие достоверные данные о наличии разницы между частотой определения:
- трансферрина: кальпротектина (MannWhitney U 48,00 Test statistic Z(corrected for ties) 3,382, Two-tailed probability P = 0,0007), и трансферином: лактоферином (MannWhitney U 64,00 Tests tatistic Z (corrected for ties) 2,725 Two-tailed probability P = 0,0064).
Достоверной разницы между частотой выявления положительной реакции на каль-протектин: лактоферин не обнаружено. Таким образом, наиболее вероятный профиль положительных реакции в группе условно
здоровых детей выглядит следующим (с учетом средних значений):
Трансферин - отрицательно Кальпротектин - положительно Лактоферин - положительно / отрицательно Полученный при исследовании качественных проб профиль 0:1:1/0 должен соответствовать группе здоровых детей, при этом профиль 0:0:0 полностью будет соответствовать здоровому ребенку по умолчанию.
Группа сравнения (пациенты с нарушениями пассажа по ЖКТ) общей численностью 21 пациент, с преобладанием, средний возраст на момент взятия анализа 14-21 день, гестационный возраст на момент рождения -36-39 недель, лабораторные данные неинвазивных тестов определения фекальных маркеров воспаления представлены в таблице 2.
Таблица 2. Показатели кальпротектина, трансферрина и лактоферрина в кале пациентов
группы сравнения (n=21)
Показатель Среднее 95% ДИ Шапиро - Уилк тест
Трансферрин 0,6364 0,4181 - 0,8547 W=0,6127 reject Normality (P<0,0001)
Кальпротектин 0,9091 0,7786 - 1,0396 W=0,3322 reject Normality (P<0,0001)
Лактоферрин 0,5000 0,2731 - 0,7269 W=0,6402 reject Normality (P<0,0001)
Как видно из приведенных в таблице данных, при положительном определении трансферрина и лактоферрина в группе детей с клиникой нарушения транзита по ЖКТ у каждого второго пациента, была выявлена достоверная разница в определении транс-феррин: кальпротектин (Mann-Whitney U 176,00 test statistic Z (corrected for ties) 2,052 Two-tailed probability P = 0,0401) и лактоферрин / кальпротектин (Mann-Whitney U 143,00
Test statistic Z (corrected for ties) 2,854 Two-tailed probability P = 0,0043)
Группа 3 основная (дети, оперированные по поводу НЭК) 23 пациента, с преобладанием недоношенных, средний возраст на момент взятия анализа 21 день, гестационный возраст на момент рождения 250 дней. Лабораторные показатели неинвазивных тестов представлены в таблице 3.
Таблица 3. Показатели кальпротектина, трансферрина и лактоферрина в кале пациентов
основной группы сравнения (п=23)
Показатель Среднее 95% ДИ Шапиро - Уилк тест
Трансферрин 0,7917 0,6165 - 0,9668 W=0,5026 (P<0,0001) reject Normality
Кальпротектин 0,9167 0,7974 - 1,0359 W=0,3155 (P<0,0001) reject Normality
Лактоферрин 0,4583 0,2434 - 0,6733 W=0,6370 (P<0,0001) reject Normality
Выполнен анализ приведенных в таблице данных на наличие достоверной разницы в частоте положительных результатов. Выявлено, что в отношении трансферрин: кальпро-тектин достоверной разницы не получено; трансферрин: лактоферрин Mann-Whitney U 192,00 тest statistic Z (corrected for ties) 2,308 Two-tailed probability P = 0,0210; калпротек-тин: лактоферин Mann-Whitney U 156,00 тest statistic Z (corrected for ties) 3,303 Two-tailed probability P = 0,0010.
Таким образом, в группе 3 преобладала
реализация сценария с соответствующим профилем: 1 - 1 - 1/0 (положительные пробы трансферрин - кальпротектин - лакто-феррин).
В исследованной группе детей с некро-тизирующим энтероколитом Отношение шансов быть прооперированном с реалииза-цией такого сценария по сравнению с группой здоровых детей и реализацией сценария 0 - 1/0 - 1/0 составляет 11,3 (Odds ratio) z statistic 3,030 при р = 0,0024. Результаты подтверждаются x2 тестом.
Таблица 4. Статистическая оценка достоверности показателей кальпротектина, трансферрина и лактоферрина в кале пациентов основной группы сравнения (п=23)
Критерий Показатель Интервал
Чувствительность 73,91% 51,59% - 89,77%
Специфичность 80,00% 51,91% - 95,67%
АУК (АиС) 0,77 0,60 -0,89
Положительное отношение правдоподобия 3,70 1,31 - 10,46
Отрицательное отношение правдоподобия 0,33 0,16 - 0,68
Распространенность болезни 60,53% 43,39% - 75,96%
Прогностическая ценность положительного результата 85,00% 62,11% - 96,79%
Отрицательная прогностическая ценность 66,67% 40,99% -86,66%
В данном расчете не учитывались дети, у которых реализовался неблагоприятный сценарий из группы с клинической картиной нарушения пассажа по желудочно кишечному тракту. В этой группе реалии-зуется сценарий 0/1 - 1 - 0/1. Частота выявления положительной реакции на лактоферрин во всех группах практически одинакова, и составляет в среднем около 50% случаев, что подтверждается проведением теста Манн - Уитни во всех группах
по частоте выявления лактоферрина, и не показывает достоверной межгрупповой разницы. С учетом полученных особенностей результаты позволяют предположить отсутствие влияния на прогноз течения заболевания результатов определения лактоферрина.
Проведено межгрупповое сравнение уровня показателя одного биомаркера, так например, для трансферрина определены следующие статистические данные:
- трансферрин (у здоровых детей): трансферрин (группа сравнения) MannWhitney U 97,00 тest statistic Z (corrected for ties) 2,645 Two-tailed probability P = 0,0082;
- трансферрин (группа сравнения): трансферрин (оперированные с НЭК) достоверной разницы в частоте определения не выявлено
- трансферрин (здоровые): трансферрин (оперированные) Mann-Whitney U 76,00 тest statistic Z (corrected for ties) 3,628 Two-tailed probability P = 0,0003.
Для показателей кальпротектина:
- кальпротектин (здоровые): кальпро-тектин (группа сравнения) - достоверной разницы в частоте определения не выявлено;
- кальпротектин (группа сравнения): кальпротектин (оперированные) достоверной разницы в частоте определения не выявлено
- кальпротектин (здоровые): кальпро-тектин (оперированные) - достоверной разницы в частоте определения не выявлено.
Статистическое сравнение показателей лактоферрина:
- лактоферрин (здоровые): лактоферрин (группа сравнения) - достоверной разницы в частоте определения не выявлено;
- лактоферрин (группа сравнения): лактоферрин (оперированные) - достоверной разницы в частоте определения не выявлено;
- лактоферрин (здоровые): лактоферрин (оперированные) - достоверной разницы в частоте определения не выявлено.
Исходя из полученных данных, можно сделать следующие выводы:
Неинвазивное определение фекальных биомаркеров кишечного воспаления доступный, легко выполнимый высоко чувствии-тельный и специфичный метод, не требующий специальной подготовки пациента;
Изменение уровней кальпротектина и трансферрина у пациентов с НЭК имеет статистически достоверные отличия от показателей этих маркеров у здоровых пациентов, и у недоношенных детей с различной другой патологией осложненной септическим течением и нарушением пассажа по ЖКТ, что дает основание рекомендовать определение этих показателей в диагностике некротизирующего энтероколита.
References:
1. Arapova, A.V. YAzvenno-nekroticheskij ehnterokolit u novorozhdennyh / A.V. Arapova., E.B. Ol'hova., V.E. SHCHitinin // Detskaya hirurgiya. - 2003. - № 1. - 11-15.
2. Borovik, T.EH. Novyj podhod k optimizacii vskarmlivaniya nedonoshennyh detej / T.EH. Borovik, O.L. Lukoyanova., V.A. Skvorcova // Pediatriya. - 2002. - № 6. - 77-80.
3. Ionushene, S. V. Nekroticheskij ehnterokolit, diagnostika i lechenie / SV. Ionushene., T.V. Krasovskaya // Voprosy sovremennoj pediatrii. - 2003. - T. 2, № 1. -41-45.
4. Iskusstvennye kishechnye svishchi v lechenii novorozhdennyh s oslozhnennoj formoj nekroticheskogo ehnterokolita / V.V. Ivanov i dr. // Detskaya hirurgiya. - 2006. - № 5. - 27-29.
5. Karavaeva, A. Diagnostika i osobennosti klinicheskogo techeniya nekroticheskogo ehnterokolita u detej / A. Karavaeva // Vestnik hirurgii. — 2002. - T. 161, № 4. - 41-44.
6. Krasovskaya, T.V. Hirurgiya novorozhdennyh: diagnostika i intensivnaya terapiya: Metodicheskie rekomendacii. - 2-e izd., pererab. i dop. / T.V. Krasovskaya, T.N. Kobzeva. - M.: Moskva, 2003. - 80 s.
7. Kriterii tyazhesti i prognoza nekrotiziruyushchego ehnterokolita u novorozhdennyh / L.A. Sitko i dr. // Detskaya hirurgiya. - 2003. - № 6.
8. Hvorostov I.N., Damirov O.N., Smirnov I.E., Kucherenko A.G., Petrasheva E.S., SHramko V.N., Sinicyn A.G. Kal'protektin i matriksnye metalloproteinazy pri yazvennonekroticheskom ehnterokolite u novorozhdennyh detej // Rossijskij pediatricheskij zhurnal. 2013. №6.
9. Aydemir G., Cekmez F., Tanju I.A., Canpolat F.E., Genc F.A., Yildirim S., Tunc T., Sarici S.U. Increased fecal calprotectin in preterm infants with necrotizing enterocolitis. Clin. Lab. 2012; 58 (7-8): 841-4
10. Aydemir, C., et al., Serum intestinal fatty acid binding protein level for early diagnosis and prediction of severity of necrotizing enterocolitis. Early Hum Dev, 2011. 87(10): p. 659-61.
11. Bisquera, J.A., T.R. Cooper, and C.L. Berseth, Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics, 2002. 109(3): p. 423-8.
12. Blood flow parameters of the superior mesenteric artery as an early predictor of intestinal dysmotility in preterm infants / E. Robel-Tillig et al. // Pediatr. Ra diol. - 2004. -Vol. 34, N 12. - P. 958-962.
13. Caccaro R., D'Inca R., Pathak S., Sturniolo G.C. Clinical utility of calprotectin and lactoferrin in patients with inflammatory bowel disease: is there something new from the literature? Expert. Rev. Clin. Immunol. 2012; 8 (6): 579-85.
14. Kostakis I.D., Cholidou K.G., Vaiopoulos A.G., Vlachos I.S., Perrea D., Vaos G. Fecal calprotectin in pediatric inflammatory bowel disease: a systematic review. Dig. Dis. Sci. 2013; 58 (2): 309-19.
15. Roseth A.G. et al. Assessment of the neutrophil dominating protein calprotectin in faeces // Scand J Gastroenterol. - 1992. - V.27. - R.793-798.
16. Thuijls G, Derikx JP, van Wijck K, Zimmermann LJ, Degraeuwe PL, Mulder TL,
et al. Non-invasive markers for early diagnosis and determination of the severity of necrotizing enterocolitis. Ann Surg. 2010;251:1174-1180.
Silina EV Sevkovsky IA, AA Svirsky, Makhlin
AM, ValekLV, Marakhovskii K. Y. THE DIAGNOSTIC APPLICATION OF QUALITY- QUANTITATIVE INDICATORS OF INTESTINAL INFLAMMATION BIOMARKERS IN NEWBORNS WITH SURGICAL STAGE OF NECROTIZING ENTEROCOLITIS State Institution "Republican Scientific and Practical Center of Pediatric Surgery" Summary
The etiology of necrotizing enterocolitis multifactorial, however, proven predictive and preventive strategies for this disease are absent. Because of their often latent beginning, NEC is not always possible to diagnose the clinical manifestation. The noninvasive determination of fecal intestinal inflammation biomarkers affordable, easily workable highly sensitive and specific method that does not require special preparation of the patient.
