CC BY
23
clinical molecular studies
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© коллектив авторов, 2019
Светоч Э. А.1, Боложанцев Н. в.1, верёвкин в. в.1, Мякинина в. П.1, Алёшкин А. в.2, Киселёва И. А.2, Баннов в. А.1, Красильникова в. М.1, Борзенков в. Н.1, Карцев Н. Н.1,Дятлов И. А.1
ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ БАКТЕРИОФАГ V32 КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ БЫСТРОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ESCHERICHIA COLI СЕРОГРУППЫ О157
1ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, 142279, п.Оболенск, Московская область, Россия;
2ФБУН Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, 125212, Москва, Россия
Для быстрого поиска и идентификации Escherichia coli серогруппы О 7 включая шига-токсин продуцирующие E. coli 0157:Н7 (STEC 0157:Н7), среди культур энтеробактерий из первичного посева исследуемого материала предложен эшери-хиозный бактериофаг V32 - представитель вирусов бактерий семейства Myoviridae, подсемейства Ounavirinae. Геном фага представлен линейной двунитевой ДНК размером 87875 пар оснований Содержание G/C-пар - 38,9%) и включает 132 открытые рамки считывания (ORF). В геноме отсутствуют детерминанты устойчивости к антибиотикам, гены вирулентности STEC и других известных патогрупп E. coli. Фаг V32 обладает литической активностью в отношении всех исследуемых культур серогруппы E. coli 0157 (n=183), выделенных от людей и сельскохозяйственных животных в различных регионах Российской Федерации, Японии, Италии. Фаг лизирует лишь 6 из 182 штаммов (3,3%) E. coli, не относящихся к серогруппе 0157, не активен в отношении штаммов других видов энтеробактерий, что свидетельствует о его высокой специфичности.
Использование бактериофага V32 в качестве диагностического инструмента является высокоэффективным, быстрым, дешёвым и простым в исполнении методом, позволяющим идентифировать E. coli серогруппы 0157, включая серовар E. coli 0157Н7 в любой бактериологической лаборатории без специального оборудования и специальной подготовки исполнителей.
Ключевые слова: шига-токсин продуцирующие Escherichia coli 0157:Н7 бактериофаг; литическая активность
фага; гены вирулентности; идентификация E. coli 017 Для цитирования: Светоч Э. А., Воложанцев Н. В., Верёвкин В. В., Мякинина В. П., Алёшкин А. В., Киселева И. А., Баннов В. А., Красильникова В. М., Борзенков В. Н., Карцев Н. Н., Дятлов И. А. Диагностический бактериофаг V32 как инструмент для быстрой идентификации Escherichia coli серогруппы О157. Клиническая лабораторная диагностика. 2019; 64 (1): 57-64. DOI: http://dx.doi.org/10.1882im69-2084-2019-64-1-57-64
Svetoch E. A.1, VolozhantsevN. V.1, Verevkin V. V.1, Myakinina V. P.1, Aleshkin A. V.2, KiselevaI. A.2, Bannov V. A.1, Krasilnikova V. M.1, Borzenkov V. N.1, Kartsev N. N.1, Dyatlov I. A.1
DIAGNOSTIC BACTERIOPHAGE V32 AS A TOOL FOR THE RAPID IDENTIFICATION OF ESCHERICHIA COLI SEROGROUP O157
1State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Obolensk, 142279, Russia;
2G.N. Gabrichevsky Moscow Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Moscow, 125212, Russia
Bacteriophage V32, a representative of bacterial viruses of the Myoviridae family Ounavirinae .subfamily, is proposedfor .search and identification of E. coli O157 serogroup, including Shiga-toxin producing E. coli O15?:H? (STEC O157:H7), among cultures of entero-bacteria from the primary seeding of the material studied. Phage genome containes a linear double-stranded DNA of 87875 base pairs with G/C-content of 38.9% and includes 132 open reading frames (ORF). In the genome, there are no determinants of antibiotic resistance, virulence genes of STEC and other well-known pathogroups ofE. coli. It has been established that phage V32 has lytic activity against all studied cultures of E. coli O157 serogroup (n=183) isolatedfrom people and farm animals in various regions of the Russian Federation, as well as in Japan and Italy. At the same time, the phage lyses only 6 of 182 strains (3.3%) of E. coli not belonging to the O157 serogroup and is not active against strains of other enterobacteria. That is, the phage has a high specificity. The use of bacteriophage V32 as a diagnostic tool is a highly efficient, fast, cheap and simple method for identifying E. coli serogroup O17, including the serotype E. coli O17: H7 in any bacteriological laboratory without special equipment and special training of performers.
Key words: Shiga-toxin producing Escherichia coli O157: H7; bacteriophage; phage lytic activity; virulence genes; E. coli O157 identification.
For citation: SvetochE.A., VolozhantsevN.V., Verevkin V.V., Myakinina V.P., AleshkinA.V., KiselevaI.A., Bannov V.A., Krasilnikova V.M. , Borzenkov V.N., Kartsev N.N., Dyatlov I.A. Diagnostic bacteriophage V32 as a tool for the rapid identification of Escherichia coli serogroup O17. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2019; 64 (1): 57-64. (inRuss.) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-1-57-64
Для корреспонденции: Светоч Эдуард Арсеньевич, д-р вет. наук, гл. науч. сотр. отдела мол. микробиологии; e-mail: svetoch@obolensk.org
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОвАНИЯ
For correspondence: SvetochE.A., Chief Researcher, Department of Molecular Microbiology; e.mail: svetoch@obolensk.org Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interest.
Acknowledgment. The work was .supported by the Sectoral Scientific Program of the Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing.
Received 23.11.2018 Accepted 30.11.2018
Введение. Escherichia coli серогруппы О157 играют важную роль в патологии человека и сельскохозяйственных животных. Представитель этой группы, шига-токсин продуцирующий се-ровар E. coli О157:Н7 (STEC О157:Н7), является основным возбудителем тяжёлой пищевой инфекции - геморрагического колита (ГК), нередко ассоциированного с гемолитико-уремическим синдромом (ГУС), потенциально опасным для жизни больного. При ГК и ГУС у больных развиваются микроангиопатия, гемолитическая анемия, тромбоцитопения, которые проявляются поражением толстого кишечника, острой почечной недостаточностью, нарушением функций центральной нервной системы [1; 2]. У пациентов развивается диарея, иногда с кровью. Особенно опасны ГК и ГУС для детей первых лет жизни и пожилых людей, смертность при ГУС может достигать 5% и более [3]. Геморрагический колит, вызываемый E. coli О157:Н7, регистрируется во многих странах, включая Российскую Федерацию [4-6]. Протекает инфекция в виде спорадических случаев и эпидемических вспышек, поражая десятки, сотни, тысячи человек [4]. До настоящего времени эффективных средств лечения ГК не разработано, поскольку использование этиотропных препаратов при этой инфекции ограничено, их применение лишь усугубляет тяжесть течения болезни и увеличивает число случаев ГУС у больных ГК [5]. Трудности лечения ГК и ГУС, вызываемые STEC, ярко проявились при вспышке пищевой инфекции в Германии в 2011 г, когда заболело около 4000 человек, из которых 54 умерло [7]. С учётом высоких рисков заражения и потенциальной опасности для общественного здравоохранения STEC, особенно STEC О157:Н7 и О104:Н4, эта группа патогенов в 2011 г. в РФ отнесена к микроорганизмам I-II групп патогенности (опасности).
Основным естественным резервуаром и источником STEC О157 являются сельскохозяйственные животные [8], с фекальными массами которых возбудитель попадает во внешнюю среду, контаминируя почву, воду, сельскохозяйственные растения, пищевое сырье и продукты питания. Заболевают люди ГК, как правило, после употребления контаминированных STEC О157:Н7 продуктов питания или воды [4; 8].
При подозрении на ГК чрезвычайно важным для подтверждения диагноза и выбора тактики лечения является раннее выявление возбудителя у больного, установление источника патогена с тем, чтобы предотвратить распространение инфекции. В том и в другом случаях необходимо выделить чистую культуру возбудителя и её идентифицировать. Для быстрой детекции E. coli О157 среди колоний E. coli, полученных после первичного посева исследуемого материала, используют реакцию латексной агглютинации (РАЛ), реже реакцию агглютинации (РА) со специфическими диагности-кумами. РАЛ и РА позволяют проанализировать большое количество выделенных культур E. coli О . На конечной стадии идентификации STEC О157:Н7 используют ПЦР, ПЦР-РВ, ИХ-тест, позволяющие идентифицировать гены патогенности (rfb015J, eae, stxl, stx2, ehx, fliC) или способность культуры продуцировать шига-токсины.
Цель работы - выделить, охарактеризовать и предложить в качестве диагностического теста для быстрого поиска и первичной идентификации культур E. coli серогруппы О157, в том числе STEC О157:Н7 - основного возбудителя ГК у человека, специфический литический бактериофаг.
Материал и методы. Для оценки спектра литической активности эшерихиозного бактериофага V32 использовали референс-штаммы E. coli О157:Н7, изоляты E. coli О157:Н7, E. coli других серогрупп и серологически нетипированные эше-рихии, выделенные авторами в период с 1998 по 2018 г от людей, больных ГК, ГУС, острыми кишечными инфекциями (ОКИ), и от сельскохозяйственных животных в различных регионах Российской Федерации. Также использованы штаммы E. coli О157:Н7, любезно предоставленные профессором Харуо Ватанабе, директором Департамента бактериологии Национального института здоровья (Токио, Япония). Часть исследований по изучению литической активности бактериофага V32 выполнена на STEC О157:Н7 и STEC штаммах других серогрупп в референс-лаборатории Европейского Союза (ЕС) по изучению веротоксин-продуцирующих E. coli, VTEC (Рим, Италия). Штаммы микроорганизмов других видов получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».
Индикаторные культуры выращивали на ГРМ-агаре, сор-битол E. coli О157:Н7-агаре, агаре Эндо (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) при температуре 37о С. Для подтверждения принадлежности E. coli к серогруппе О , для детекции генов патогенности STEC (rfb ^ eae, stxl, stx2, ehx, fliC) применяли РАЛ и ПЦР тест-систему (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск) согласно МУК 4.2.2963-11.4.2. от 19.08.2011.
Бактериофаги, специфически лизирующие E. coli О157:Н7, выделяли из образцов городских сточных вод, сточных вод животноводческих ферм, речной воды, фекалий больных диареей детей. Жидкие образцы фильтровали через марлевые салфетки и осветляли центрифугированием при 10 тыс. g в течение 10 мин, твёрдые - предварительно суспендировали в фаговом SM-буфере (50 мМ NaCl, 10 мМ Tns-HCl, 10 мМ MgSO4), затем центрифугировали при 10 тыс. g в течение 10 мин. Супернатанты стерилизовали добавлением 1% хлороформа с последующим интенсивным перемешиванием в течение 20 мин, либо фильтрованием через фильтр с порами 0,22 мкм (Millex, Ирландия). Наличие бактериофагов в приготовленных образцах определяли в спот-тесте: капли образца наносили на свежеприготовленный газон бактериальной культуры E. coli О157:Н7 с последующим выращиванием её в течение 18 час при температуре 37о С. При появлении на газоне индикаторного штамма стерильного пятна на месте нанесения капли исследуемого образца, материал из него отбирали с помощью бактериологической петли, суспендировали в 1 мл SM-буфера, добавляли в полученную суспензию 20 мкл хлороформа, смесь перемешивали в течение 20 мин и анализировали на присутствие бактериофага методом агаровых слоев (метод Грациа). Наличие бляшек (негативных колоний) в верхнем слое агара указывало на фаговую природу лизиса. Препараты бактериофагов нарабатывали после двух последовательных перекалываний отдельных бляшек на культуре чувствительного штамма E. coli О157:Н7.
Для приготовления фаголизата бактериальную культуру штамма E. coli О157:Н7 3705 выращивали на питательном бульоне Лурия-Бертани (LB) в течение 18 час при температуре 37о С без аэрации до концентрации ~109 КОЕ/мл. Выросшую культуру разводили в 5 раз средой LBM (LB, содержащей 10 мМ MgSO4), заражали бактериофагом с множественно-
CLINICAL MOLECULAR STUDIES Таблица 1
Чувствительность штаммов Escherichia coli серогруппы О157, выделенных от людей, к бактериофагу V32
№ Регион и год выделения культур E. coli Источник Количество Генотип штаммов Чувствительность к бактериофагу V32 (спот-тест)
штаммов rfbO157 eae stxl stx2 fl'CH7
1 Тульская обл., г. Тула, 1997-2000 гг. Дети, ГК 18 + + + + + +
2 Дети, ГК 3 + + - + + +
3 Дети, ГК 3 + + + + - +
4 Дети, ГК 3 + + + + - +
5 Контакт 2 + + + + + +
6 Контакт 4 + + - + + +
7 Контакт 3 + + + + - +
8 г. Санкт-Петербург, 2013 г. Дети, ГК 3 + + - + + +
9 Московская обл., г. Протвино, 2002 г. Дети, ОКИ 6* + - - - - +
10 г. Вологда, 2018 г. Ребенок, ОКИ 1 + + + + + +
11 г. Ярославль, 2017 г. Ребенок, ОКИ 1 + + + + +
12 Япония, 1998 г. Дети, ГК 14 + + + + + +
13 Пищевые продукты 1 + + - + + +
14 Референс лаборатория ЕС, Рим, Италия Больные ГК, пищевые продукты 10 + + + + + +
15 Больные ГК, пищевые продукты 10 + + - + + +
16 «ГКПМ-Оболенск» EDL933 1 + + + + +
17 904 1 + + + + +
18 АТСС35150 1 + + + + +
19 АТСС51659 1 + + + + +
20 АТСС51568 1 + + + + +
21 АТСС51567 1 + + + + +
22 ^ ИТОГО 1 89 + + + + +
Примечание. ГК - геморрагический колит; ОКИ - острая кишечная инфекция; rfbolsJ_ген синтеза антигена О157; еае - ген синтеза адгезина интимина; stxl и stx2 _ гены синтеза шига-токсинов типов 1 и 2; fliCHJ _ гены синтеза жгутикового антигена Н7.«+» - ген или признак присутствует; «-» - ген или признак отсутствует; * - штаммы продуцировали термолабильный (Lt) и термостабильный (Est) энтеротоксины.
стью инфицирования (МИ) 0,01-0,1 БОЕ/КОЕ. Смесь инкубировали при температуре 37о С на качалке (скорость вращения 170 об/мин) до просветления культуральной жидкости. Фаголизат стерилизовали добавлением 1% хлороформа с последующим интенсивным перемешиванием в течение 20 мин., после чего из фаголизата удаляли клеточный дебрис путём центрифугирования при 10 тыс. g в течение 10 мин и определяли в нём количество фаговых частиц методом Грациа.
Литическую активность бактериофага V32 в отношении индикаторных культур изучали методом спот-теста и методом фаговой дорожки [9].
Полногеномное секвенирование бактериофага V32 осуществляли в системе Ion Torrent PGM (Life Technologies, США) согласно инструкции фирмы-производителя (http:// ioncommunity.lifetechnologies.com). Для секвенирования использовали наборы реагентов Ion PGM Reagents 200 Kit и Ion 318 Chip Kit (Life Technologies, США). Индивидуальные прочтения собирали в контиги с помощью программы New-bler 2.9 (Roche, Швейцария) и редактировали с использованием программного обеспечения SeqMan NGen (DNAStar, Madison, WI, США) и Vector NTI Advance 10.0.1 (Invitrogen, США). Кодирующие последовательности ДНК выявляли и анализировали, используя программные ресурсы RAST [10] и BLAST [11].
Результаты. При исследовании 17 образцов материала, отобранного из различных источников, выделено 29 штаммов бактериофагов, проявлявших литическую активность в отношении E. coli О157:Н7. После предварительной оценки спектра и специфичности литической активности выделен-
ных бактериофагов для дальнейшего изучения отобран бактериофаг V32, как наиболее перспективный. Бактериофаг V32 депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером Ph25.
Бактериофаг V32 выделен в 2008 г. из сточных вод одной из ферм крупного рогатого скота в Московской области. На штаммах E. coli О157:Н7 фаг V32 формирует мелкие негативные прозрачные колонии с чёткими краями (рис. 1, см. обложку). Вторичный рост клеток бактерий в области негативных зон отсутствует. При выращивании на среде LB смеси фага V32 и чувствительного к нему штамма E. coli О157:Н7 3705 стабильно удается нарабатывать фаголизаты с концентрацией более 109 БОЕ/мл.
На основании данных секвенирования ДНК и сравнительного геномного анализа бактериофаг V32 отнесён к вирусам семейства Myoviridae, подсемейства Ounavirinae. Геном фага V32 представлен линейной двунитевой ДНК размером 87875 пар оснований (содержание G/C-пар - 38,9%), включает 132 открытые рамки считывания (ORF), кодирующие 20% белков с предсказанными функциями и 80% гипотетических пептидов с неустановленными функциями. В дополнение к основным генам структурных белков капсида и хвостового аппарата, в геноме фага выявлены гены, кодирующие набор ферментов, связанных с репликацией, рекомбинацией, модификацией, метаболизмом ДНК, гены, определяющие лизис бактериальной клетки-хозяина. В геноме фага выявлено 20 генов транспортной РНК (рис. 2, см. обложку). В геноме фага не выявлены гены резистентности к антибиотикам, детерми-
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОвАНИЯ
Таблица 2
Чувствительность штаммов Escherichia coli серогруппы О157, выделенных от сельскохозяйственных животных, к бактериофагу V32
№ Регион и год выделения Источник Количество Генотип штаммов Чувствительность к бакте-
культур E. coli штаммов Фои eae stxl stx2 flCHJ риофагу V32 (спот-тест)
1 Рязанская обл., 2000 г. Телята 10-дневные 6 + + - + + +
2 Воронежская обл., 1999 г. Телята 2-х месячные 2 + + + + + +
3 Коровы 3 + + + + + +
4 Тульская обл., 1999-2000 гг. Корова 1 + + + + + +
5 Коровы 7 + + - + + +
6 Молоко сырое 3 + + + + + +
7 Орловская обл., 2000 г. Телята 5- месячные 3 + + + + + +
8 Орловская обл., 2000 г. Поросята 5- месячные 15 + + - + + +
9 Поросята 1-2-месячные 7 + - - - - +
10 Рязанская обл., 2000 г. Поросята 1-месячные 5* + + - - - +
11 Белгородская обл., 2001 г. Поросята 2-месячные 8* + - - - + +
12 Московская обл., 2001 г. Куры бройлерные, 38-дневные ИТОГО 14* 74 + +
Примечание. г(Ь0157 _ ген синтеза антигена О ; еае - ген синтеза адгезина интимина; stxl и stx2 - гены синтеза шига-токсинов типов 1 и 2; АС - гены синтеза жгутикового антигена Н7. «+» - ген или признак присутствует; «-» - ген или признак отсутствует; * - штаммы
E. coli О157 не несли генов шига-токсинов типов 1 и 2.
нанты вирулентности, характерные для STEC E. coli О157:Н7 (rfb0J, eae, stxl, stx2, ehx, fliCHJ), гены термолабильного (lt) и термостабильного (est) энтеротоксинов.
Спектр литической активности бактериофага V32 в отношении штаммов серогруппы E. coli О157 представлен в табл. 1 и 2.
Все шига-токсин продуцирующие штаммы серотипа E. coli О157:Н7, выделенные в разные годы в городах Туле, Санкт-Петербурге, Ярославле, Вологде от больных ГК, ГУС или ОКИ, чувствительны к бактериофагу V32, т. е. все они лизировались фагом V32 при испытании в спот-тесте. Высокая литическая активность фага V32 установлена и в отношении 15 шига-токсин продуцирующих штаммов E. coli О157:Н7, вызвавших в 1996 г. в г Сакаи (Япония) самую крупную (из известных на сегодняшний день) вспышку пищевой инфекции среди школьников. Тогда инфекция поразила более 10 тыс. человек [12]. Чувствительность к фагу V32 проявляли 20 штаммов STEC О157:Н7 из коллекции референс-лаборатории ЕС по изучению STEC, семь шига-токсин продуцирующих референс-штаммов E. coli О157:Н7 из «ГКПМ-Оболенск». Чувствительными к бактериофагу V32 оказались шесть эн-теротоксигенных (ЕТЕС) штаммов серогруппы E. coli О , изолированных от детей при ОКИ в г. Протвино Московской обл.
К фагу V32 чувствительны 74 штамма E. coli серогруппы О , выделенные в 1999-2001 гг. в семи регионах РФ от сельскохозяйственных животных и промышленной птицы (табл. 2). Из 74 изученных штаммов 52 принадлежали к серотипу STEC О157:Н7, возбудителю ГК и ГУС у человека. Остальные 22 штамма, выделенные от поросят и птицы, не несли генов патогенности STEC и были не патогенными для человека.
Все 163 штамма серогруппы О включая 130 штаммов STEC О157:Н7, выделенные от людей и сельскохозяйственных животных (табл. 1 и 2), при испытании в спот-тесте чувствительны к бактериофагу V32. Штаммы E. coli О157 лизирова-лись фагом независимо от источника, региона, страны, года их выделения, их генотипа (наличия детерминант патоген-ности), принадлежности к патотипу эшерихий (энтерогемор-рагическому или энтеротоксигенному). Полученные данные свидетельствуют о широком спектре литического действия бактериофага V32 в отношении эшерихий серогруппы О , в
том числе E. coli О157:Н7 - ведущего возбудителя ГК и ГУС.
Для оценки возможности использования фага V32 в качестве диагностического с целью детекции культур E. coli се-рогруппы О157 недостаточно, чтобы фаг проявлял лишь 100% литическую активность в отношении целевого микроорганизма, необходимо, чтобы он обладал ещё и высокой специфичностью, т. е. не лизировал другие (не принадлежащие к серогруппе E. coli О ) микроорганизмы. Для определения специфичности литического действия фага V32 использовали E. coli других серогрупп, в том числе шига-токсин продуцирующие, выделенные от людей (табл. 3), серологически нетипированные, изолированные от людей и сельскохозяйственных животных культуры E. coli (табл. 4). С этой же целью использованы другие виды микроорганизмов (табл. 4). Из 20 штаммов E. coli серогрупп О26, О , О , О , выделенных от детей с диагнозом ОКИ в г. Ярославле, только один изолят серогруппы E. coli О26, принадлежащий к патотипу энтеропатогенных эшерихий (ЕРЕС), чувствителен к фагу V32, т. е. фаг V32 в данном случае вызвал лизис клеток изолята, что можно расценивать, как ложноположительный результат (табл. 3). Среди 31 серологически типированного шига-токсин продуцирующего штамма E. coli из референс-лаборатории ЕС по изучению STEC только один штамм серогруппы О55 оказался чувствительным к фагу V32, остальные 30 были резистентными. Устойчивыми к фагу V32 оказались все 15 штаммов 14 серогрупп E. coli из коллекции «ГКПМ-Оболенск». Следовательно, из 66 штаммов E. coli , принадлежащих к 26 О-серологическим группам (О1, О2, О4, О , О20,
О* ^ О* ^ О* О* Цс^ О12Г
О128, О125, О144, О154, О156) ТОльк° ^ штамма (~3%) из
серогрупп E. coli О26 и E. coli О55 чувствительны к фагу V32, остальные 64 (97%) резистентны к литическому действию этого фага.
О высокой специфичности литической активности фага V32 свидетельствуют данные, полученные при испытании его на серологически нетипированной группе эшерихий, выделенных в 17 регионах РФ от людей и сельскохозяйственных животных: из 116 культур четыре (3,4%) (две от людей и две от птицы) оказались чувствительны к фагу V32 (табл. 4). Ни одна из 87 культур 15 гетерологичных E. coli видов не чувствительна к фагу V32, т. е. в этом случае специфичность
CLINICAL MOLECULAR STUDIES Таблица 3
Чувствительность штаммов Escherichia coli других (не О157) серогрупп, выделенных от людей, к бактериофагу V32
Регион и год выделения культур Серогруппа E. coli, источник выделения Количество Генотип штаммов Чувствитель-ность к фагу
E. coli штаммов V32 (спот-тест)
Ярославская обл., E. coli О,„ клинические изоляты, ОКИ 26' 12 eae; eae, ehxA; eae, -
г. Ярославль, 2015, 2016, 2017 гг. stxl, ehxA
E. coli О,„ клинический изолят, ОКИ 26 1 eae +
E. coli О , клинические изоляты, ОКИ 4 eae; eae, ehxA; lt/est -
E. coli О127, клинические изоляты, ОКИ 2 eae, stx1; eae -
E. coli О , клинический изолят, ОКИ 1 eae -
Референс-лаборатория ЕС E. coli О126 1 stx1 -
(Рим, Италия) 2014 г. E. coli О121 3 eae, stx2 -
E. coli О103 3 eae, stx1 -
E. coli О55 2 eae, stx2 -
E. coli О55 1 eae, stx2 +
E. coli О145 3 eae, stx2 -
E. coli О 3 eae, stxl, stx2 -
E. coli О,„ 156 1 eae, stx1 -
E. coli О128 3 stx2 -
E. coli О 1 stx2 -
E. coli О, 146 1 stxl, stx2 -
E. coli О28 3 eae, stx2 -
E. coli О114 1 eae, stx2 -
E. coli О125 1 eae, stx2 -
E. coli О127 1 aggR stx2 -
E. coli °1M:H4 3 aggR stx2 -
«ГКПМ- Оболенск» E. coli сер°групп: ОР О? O^ О154 ^ О* О» О79 О12Г О14Р О, О1101О1302 О10(:Н12, О104:Н4 (по одному штамму) Итого: 15 66 н/о
Примечание. ОКИ - острая кишечная инфекция; еае - ген синтеза адгезина интимина; stxl и stx2 - гены синтеза шига-токсинов типов 1 и 2; lt - ген синтеза термолабильного энтеротоксина; est - ген синтеза термостабильного энтеротоксина; ehxA - ген синтеза энотерогемоли-зина, aggR - ген синтеза адгезина энтероагрегативных эшерихий (EAggEC).
литического действия фага абсолютна (табл. 4). Специфичность литической активности фага оценена на 269 индикаторных культурах (табл. 3 и 4), из которых 263 (97,8%) резистентны и только 6 (2,2%) чувствительны к фагу V32.
Обсуждение. Контроль за STEC О157:Н7 инфекцией весьма сложная задача и предполагает проведение комплекса мероприятий: мониторинг и профилактику носительства E. coli О157:Н7 у крупного рогатого скота и других жвачных, соблюдение санитарно-гигиенических правил по предотвращению распространения патогена с фекалиями животных на продукты питания, воду и почву, деконтаминацию E. coli О157:Н7 в потенциально опасных для человека продуктах питания, а также совершенствование диагностики и лечения ГК и ГУС. При реализации перечисленных мероприятий по контролю за STEC О157:Н7 инфекцией важное место отводится использованию вирулентных бактериофагов, специфически лизирующих E. coli О157:Н7. Так, широкое признание у исследователей получило фаготипирование штаммов E. coli О157:Н7 с целью эпидемиологического анализа STEC-инфекции. Благодаря фаготипированию удалось показать, что за вспы-шечные и спорадические случаи ГК и ГУС у человека отвечает ограниченное число определенных фаготипов STEC О157:Н7. Фаготипирование позволило выявить эпидемически значимые доминирующие фаготипы STEC О157:Н7, циркулирующие на отдельных географических территориях, а также установить связь между носительством этого патогена у животных и заболеваемостью человека ГК. Фаготип штамма E. coli О157:Н7 оказался хорошей фенотипической меткой, ис-
пользуемой при эпидемиологическом анализе вспышечных случаев ГК для установления источника инфекции [13-15].
Специфические бактериофаги, лизирующие STEC О157:Н7, рассматриваются как одно из перспективных и эффективных антимикробных средств для борьбы с носительством этого патогена у сельскохозяйственных животных - основного природного резервуара и источника возбудителя ГК человека [16; 17]. Проводятся исследования и дискутируется вопрос о применении специфических бактериофагов для профилактики ГК у человека [18-20]. Нами на основе коктейля бактериофагов, в том числе лизирующих E. coli О157:Н7, разработана и зарегистрирована в РФ пищевая добавка, способная снижать риски заболевания ГК [21].
Мощным инструментом для контроля за STEC О157:Н7 инфекцией, как свидетельствуют результаты многочисленных исследований, является использование литических бактериофагов для деконтаминации культур E. coli О157:Н7 из животноводческих (мясо, молоко) и зеленных растительных продуктов (салаты, укроп, сельдерей и др.), овощей, фруктов, соков и др. [22-24].
Мы предлагаем использовать специфический вирулентный бактериофаг в диагностических целях: для быстрой идентификации культур E. coli серогруппы О157, включая STEC О157:Н7, как эффективный, дешёвый, легко выполнимый в любой бактериологической лаборатории диагностический тест. Основные требования к бактериофагам, используемым в практике - литическая активность (широкая или узкая), специфичность действия, безопасность для человека [17, 22,
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОвАНИЯ
Таблица 4
Чувствительность серологически нетипированных штаммов Escherichia coli и других видов микроорганизмов к бактериофагу V32
Регион и год выделения микроорганизмов
Вид микроорганизмов, источник выделения
Кол-во штаммов
Генотип
Чувствительно сть к фагу
Вологодская обл., г. Череповец, 2011 г. Приморский край, г. Владивосток, 2012 г. Московская обл., г. Протвино, 2012 г. Челябинская обл., г. Челябинск, 2009 г.
г. Москва, МНИИЭМ им. Габричевского, 2012 г. г. Москва, ЦКБ № 1, 2016 г. Тюменская обл., г. Тюмень, 2014 г. г. Санкт-Петербург, 2013 г. Тульская обл., г. Тула, 1997 г. Ярославская обл., г. Ярославль, 2015 Белгородская, Калужская, Московская, Псковская, Орловская обл., 1999-2002 г.г. Волгоградская обл., 2002 г.
г.г. Архангельск, Якутск, Тюмень Краснодарский край, Хакасия, Ленинградская и Московская обл., 2005-2017 г.г. «ГКПМ-Оболенск»
E. coli , клинические изоляты, вспышка ОКИ
E. coli , клинические изоляты, вспышка ОКИ
E. coli , клинические изоляты, хирургические больные E. coli , клинический изолят, ОКИ
E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli
клинические изоляты, ОКИ клинические изоляты, ОКИ клинические изоляты, ОКИ клинические изоляты, ОКИ клинические изоляты, ОКИ клинические изоляты, ОКИ свиньи, крупный рогатый скот
E. coli , птица E. coli , птица
Shigella flexneri, клинические изоляты Salmonella Enteritidis, птица
Salmonella Choleraesuis Salmonella Typhimurium Salmonella Gallinarum-Pullorum Shigella dysenteriae Morganella morganii Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Listeria monocytogenes Shigella sonnei Yersinia enterocolitica Yersinia pseudotuberculosis Итого:
11 1 4
1 1 3 15 24 3 2 3
34
9 2 17 8
15 2
9 1 2
10 2 1 10 2 1
3
4
203
stx2, hly hly hly
stxl, stx2, eae; ehxA
Примечание. еае - ген синтеза адгезина интимина; stxl и stx2 - гены синтеза шига-токсинов типов 1 и 2; Ыу - ген синтеза гемолизина; ehxA - ген синтеза энтерогемолизина.
25]. Последнее предполагает отсутствие в геноме фага детерминант патогенности и антибиотикорезистентности, потенциально опасных для человека, генов, ответственных за ли-зогенное состояние бактериофага. Анализ работ, посвящён-ных поиску бактериофагов, активных против STEC О157:Н7, показывает, что выделение фагов со 100% литической активностью в отношении культур E. coli серогруппы О157 - вполне разрешимая задача, хотя и требует значительных усилий [26; 27]. Выделяемые анти- E. coli О157:Н7 фаги далеко не всегда обладают высокой специфичностью: нередко они лизируют культуры E. coli, не относящиеся к серогруппе О , и культуры гетерологичных видов энтеробактерий [17, 28].
При анализе 29 штаммов бактериофагов, лизирующих E. coli серогруппы О , удалось отобрать один бактериофаг, V32, отвечающий всем требованиям, предъявляемым к диагностическим фагам. Фаг V32 в 100% случаев лизировал все испытанные культуры E. coli серогруппы О , в том числе 130 шига-токсин продуцирующих штаммов серотипа E. coli О :Н выделенных из различных источников: от больных
ГК и ГУС людей, из продуктов, от сельскохозяйственных животных - крупного рогатого скота, свиней, птицы. Среди индикаторных штаммов E. coli О157 были культуры другого (не энтерогеморрагического) патотипа - энтеротоксигенные (ЕТЕС) штаммы, носители отдельных генов STEC. Иинди-каторные культуры E. coli О157 эпидемически и эпизоотически не связаны между собой, поскольку выделены в девяти разных регионах РФ, Японии и Италии. Полученные данные свидетельствуют об уникально широком спектре литическо-го действия фага V32 в отношении E. coli серогруппы О . Литическая активность обеспечивается взаимодействием фагов с рецепторами, расположенными на поверхности наружной мембраны клетки хозяина. Предполагают, что широкий спектр литической активности у фага связан с наличием у него двух и более специфических протеинов (локализованных на хвосте вируса), которые обеспечивают взаимодействие фага с липополисахаридом, главным рецептором для фагов у грамотрицательных бактерий, и белками наружной мембраны клетки хозяина [28].
+
3
+
+
Второе важное свойство диагностического фага V32 -его специфичность, т. е. способность фага in vitro лизировать только эшерихии серогруппы О157 и не лизировать другие, не относящиеся к этой серогруппе, а также микроорганизмы других видов и родов. Специфичность литической активности фага выражают в процентах устойчивых к фагу нецелевых (не E. coli О) микроорганизмов, взятых в эксперимент. Как показали исследования, проведенные на 182 штаммах E. coli, не относящихся к серогруппе О , специфичность фага V32 была высокой и составляла 96,7 %, т. е. только 6 штаммов E. coli из 182 неспецифически лизировались фагом. К фагу V32 устойчивы штаммы видов Shigellaflexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Salmonella Enteritidis, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Gallinarum-Pullorum, Morganella morganii, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Acinetobacter bau-mannii, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes. Другие свойства фага V32, подтверждающие его уникальность и диагностическую ценность, получены в результате полногеномного секвенирования вируса. Биоинформационный анализ структуры генома фага V32 показал отсутствие в нём генов вирулентности, характерных для всех известных па-тогрупп E. coli, и отсутствие детерминант антибиотикорези-стентности. Следует отметить ещё одно важное для диагностики ГК свойство фага V32: лизис культур серогруппы E. coli О157 под действием фага наступает очень быстро и может быть учтён в спот-тесте через 2-3 часа после нанесения фага на свежезасеянную культуру E. coli .
100% чувствительность эшерихий серогруппы О157 к ли-тическому действию фага V32, его высокая специфичность, безопасность для человека и возможность получения быстрого результата свидетельствуют об уникальности фага и пригодности для использования в лабораторной практике для идентификации E. coli серогруппы О157, включая шига-токсин продуцирующие серотипы E. coli О157:Н7 и E. coli 0157:NM. Если идентифицированные фагом V32 E. coli серогруппы О157 выделены от больного с клиникой диареи (простой водянистой или с кровью), то с большой долей вероятности можно ставить предварительный диагноз «геморрагический колит, вызванный E. coli О157» и принимать соответствующие этому диагнозу лечебные мероприятия. Для постановки окончательного диагноза необходимо подтвердить способность штаммов E. coli О157 продуцировать шига-токсины.
Уникальные свойства фага V32 открывают большие перспективы для использования его не только в диагностических целях, но и для профилактики ГК в период крупных вспышек пищевой инфекции, вызванной E. coli О157:Н7, для борьбы с носительством эшерихий серогруппы О157 у сельскохозяйственных животных. Фаг V32 может использоваться в пищевой промышленности для деконтаминации пищевого сырья, в первую очередь, говядины, от E. coli О157:Н7. Уникальность фага V32 в качестве диагностического теста подтверждена получением на него патента [9].
Заключение. Получен диагностический бактериофаг, который может быть использован в медицинских и ветеринарных диагностических лабораториях для идентификации эшерихий серогруппы О , в том числе шига-токсин продуцирующих серотипов E. coli О157:Н7 и E. coli 0157:NM, основных возбудителей ГК и ГУС человека. Фаг V32 обладает 100% литической активностью в отношении E. coli серогруппы О157 и высокой специфичностью (не менее 97%); в его геноме отсутствуют детерминанты устойчивости к антибиотикам, гены вирулентности STEC и других известных патогрупп E. coli , т. е. фаг V32 безопасен для человека. Использование бактериофага V32 в качестве диагностического инструмента является высокоэффективным, быстрым, дешевым, простым в исполнении методом, позволяющим идентифицировать E.
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
coli серогруппы О , включая серовар E. coli О157:Н7 в любой бактериологической лаборатории без специального оборудования и специальной подготовки исполнителей.
Финансирование. Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-4, 7, 8, 10-28 см. REFERENCES)
5. Подколзин А.Т., Коновалова Т.А., Веселова О.А.. Оценка эффективности схем диагностики энтерогеморрагического эшерихио-за. Этиологическая верификация гемолитико-уремического синдрома в Российской Федерации. Терапевтический архив. 2014; 11: 66-9.
6. Онищенко Г.Г., Дятлов И.А., Светоч Э.А., Воложанцев Н.Н., Баннов В.А., Карцев, Н.Н.. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсин продуцирующих Escherichia coli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в Санкт-Петербурге в 2013 году. Вестник Российской академии медицинских наук. 2015; 1: 70-81.
9. Веревкин В.В., Воложанцев В.В., Степаншин Ю.Г., Светоч Э.А., Мякинина В.П. Штамм бактериофага Escherichia coli V32 для идентификации бактерий Escherichia coli серогруппы О157. Патент РФ № 2425877; 2011.
REFERENCES
1. Griffin P.M., Ostoff S.M., Tauxe R,V., Greene K.D., Wells J.G., Lewis J.H. et all. Illnesses associated with Escherichia coli O157:H7 infection. A broad clinical spectrum. Ann. Intern. Med. 1988; 109: 705-12.
2. Tarr P.I., Gordon C.A., Chandler W.L. Shiga A toxin-producing Escherichia coli and hemolytic uraemic syndrome. Lancet. 2005; 365 (9464): 1073-86.
3. Karch H., Tarr P.I., Bielazewsca. M. Enterohaemorragic Escherichia coli in human medicine. Int. J. Med. Microbiol. 2005; 295(6-7): 405-18.
4. Yang S.C., Lin C.H., Aljuffali J.A., Fang J.Y. Current pathogenic Escherichia coli footborne outbreak cases and therapy development. Arch. Microbiol. 2017; 199(6): 811-25.
5. Podkolzin A.T., Konovalova T.A., Veselova O.A. Evaluation of the efficiency of diagnostic regiments for enterohemorrhagic escheri-chiosis. Etiological verification of hemolytic uremic syndrome in the Russian Federation. Terapevticheskiy arkhiv. 2014; 11: 66 - 9. (in Russian)
6. Onishenko G.G., Dyatlov I.A., Svetoch E.A., Volozhantsev N.V., Bannov V.A., Kartsev, N.N. et al. Molecular-genetic characterization of shiga-toxin producing Escherichia coli isolated during a food-borne outbreak in St. Petersburg in 2013. Vestnik Rossiyskoy aka-demii meditsinskikh nauk. 2015; 70(10): 70-81. (in Russian)
7. Soon J.M., Seaman P., Baines R.N. Escherichia coli O104:H4 outbreak from sprouted seeds. Int. J. Hyg. Environ. Health. 2013; 216(3): 346-54.
8. Ferens W.A., Hovde C.J. Escherichia coli O157:H7: animal reservoir and sours of human infection. Foodborne pathog. Dis. 2011; 8(4): 465-80.
9. Verevkin V.V., Volozhantsev V.V., Stepanshin Yu.G., Svetoch E.A., Myakinina V.P. The strain of bacteriophage Escherichia coli V32 for the identification of bacteria Escherichia coli serogroup O157. Patent RF № 2425877; 2011. (in Russian)
10. Aziz R.K. Bartels D., Best A.A., De Jongh M., Disz T., Edwards R.A. et al. The RAST server: rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics. 2008; 9: 75.
11. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990; 215: 403-10.
12. Michino H., Araki K., Minami S., Tayaka S., Sakai N., Miyazaki M. et al. Massive outbreak of Escherichia coli O157:H7 infection in school children in Sakai City, Japan, associated with consumption of white radish sprouts. Am.. J Epidemiol. 1999; 150(8): 787-96.
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
13. Khakhria R., Duck D., Lior H. Extended phage-typing scheme for Escherichia coli O157:H7. Epidemiol. Infect. 1990; 105(3): 511-20.
14. Mora A., Blanco M., Blanco J.E., Alonso M.P., Dhabi G., ThomsonCarter F. et al. Phage types and genotypes of shiga toxin - producing Escherichia coli O157:H7 isolates from humans and animals in spain: identification and characterization of two predominating phage types (PT2 and PT8). J.Clin. Microbiol. 2004; 42(9): 4007-15.
15. Tozzoli R., Grande L., Michelacci V., Fioravanti R., Gally D., Xu X. et al. Identification and characterization of a peculiar vtx2-converting phage frequently present in verocytotoxin-producing Escherichia coli O157:H7 isolated from human infections. Infect. Immun. 2014; 82(7): 33023-32.
16. Sheng H., Knecht H.J., Kudva I.T., Hovde C.J. Application of bacteriophages to control intestinal Escherichia coli O157:H7 levels in ruminants. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72(8): 5359-66.
17. Dini C., De Urraza P.J. Isolation and selection of coliphages as potential biocontrol agents of enterohemorragic and shiga toxin-producing E. coli (EHEC and STEC) in cattle. J. Appl. Microbiol. 2010; 109(3): 873-87.
18. Xu Y., Liu Y., Pei J., Yao S., Cheng, C. bacteriophage therapy against enterobacteriaceae. Virol. Sin. 2015; 30(1): 11-8.
19. Brüssow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience. Microbiology. 2005; 151(7): 2133-40.
20. Yang S.C., Aljuffali I.A., Fang J.Y. Current pathogenic Escherichia coli foodborne outbreak cases and therapy development. Arch. Mi-crobiol. 2017; 199(6): 811-25.
21. Aleshkin A.V., Volozhantsev N.V., Svetoch E.A., Verevkin V.V.,
Krasilnikova V.M., Bannov V.A. et al. Bacteriophage cocktail in prophylaxis against food-borne infections. Worldwide Research Efforts in the Fighting against Microbial Pathogens: From Basic Research to Technological Developments. Edited AMendez-Vilas. Brown-Walker Press. 2013; 100-4.
22. Tomat D., Migliore L., Aquili V., Quiberoni A., Balague C.. Phage biocontrol of enteropathogenic and shiga toxin-producing Escherichia coli in meat products. Front Cell Infect Microbiol. 2013; 3: 20.
23. Goodridge L.D., Bisha B. Phage-based biocontrol strategies to reduce foodborne pathogens in foods. Bacteriophage. 2011;1(3): 130-7.
24. Zaczek M., Weber-D^browska B., Gorski A.. Phages in the global fruit and vegetable industry. J. Appl. Microbiol. 2015; 118(3): 537-56.
25. Greer G.G. Bacteriophage control of foodborne bacteria. J. Food Prot. 2005; 68(5): 1102-11.
26. Nui Y.D., Stanford K., Kropinski A.M., Ackermann H.-W., Johnson R.P., She Y.-M. et al. Genomic, proteomic and physiological characterization of a T5-like bacteriophage for control of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 2012; 7(4): e34585.
27. Nui Y.D., Stanford K., Ackermann H.-W., McAllister T.A. Characterization of 4 T1-like lytic bacteriophages that lyse Shiga-toxin Escherichia coli O157:H7. Can. J. Microbiol. 2012; 58(7): 923-7.
28. Niu Y.D., Johnston R.P., Xu Y., McAllister T.A., Sharma R., Louie M., et al. Host range and lytic capability of four bacteriophages against bovine and clinical human isolates of Shiga toxin-producing Escherichia coli O157:H7. J. Appl. Microbiol. 2009; 107(2): 646-56.
Поступила 23.11.18 Принята к печати 30.11.18
