CC BY
87
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616.34-008.87-022:579.842.11]-078
Иванова Е.И.1, Рычкова Л.В.1, Немченко У.М.1, Бухарова Е.В.1, Савелькаева М.В.1,
Джиоев Ю.П.1'2
структура микробиоты кишечника и частота выявления генов пато-
ГЕННОСТИ (STx1, STx2, BFP) У ВЫСОКОАКТИВНЫх ИзОЛЯТОВ ESCHERICHIA COLI,
выделенных от детей первого года жизни
1ФГБНУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека», 664003, Иркутск, Россия; 2ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет», 664003, Иркутск, Россия
E. coli - комменсал кишечника позвоночных. Способность производить шига-токсины (STX) является важной особенностью вирулентности шига-токсин производящей кишечной палочки (STEC). Эти мощные цитотоксины способны блокировать синтез белка путем инактивации рибосомы, и их действие на клетки-мишени несет ответственность за наиболее тяжелые последствия, вызванные болезнью, например, геморрагический колит и угрожающий жизни гемолитико-уремический синдром. Энтеропатогенная кишечная палочка (ЕРЕС) также продолжает оставаться важной причиной диарей у детей в развивающихся странах. Ген, отвечающий за формирование связывания пилей, является необходимым фактором адгезии E. coli, повышающим патогенный потенциал энтеропатогенной кишечной палочки. Обмен генетическим материалом разных типов бактерий между собой и с другими представителями семейства Enterobacte-riaceae в кишечной экосистеме ведет к появлению вариантов нормальной кишечной палочки с фенотипическими признаками патогенности, что может служить теоретическим обоснованием для отнесения таких штаммов к патобионтам. С помощью ПЦР исследовали 68 штаммов E. coli (с нормальной ферментативной активностью), выделенных у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта, на наличие генов, кодирующих синтез шига-подобных токсинов (stx1 и stx2) и генов, кодирующих формирование связывания пилей (bfp). Наличие искомых ампликонов, специфичных генам stx1 и bfp, приводит к формированию штаммов кишечных палочек, обладающих более выраженной патогенностью.
Ключевые слова: микробиоценоз; желудочно-кишечный тракт; микросимбионт; Escherichia coli; шига-токсин; stx-фаги; гены патогенности; ген, отвечающий за формирование связывания пилей (bfp).
Для цитирования: Иванова Е.И., Рычкова Л.В., Немченко УМ., Бухарова Е.В., Савелькаева М.В., Джиоев Ю.П. Структура микробиоты кишечника и частота выявления генов патоген-ности (stx1, stx2, bfp) у высокоактивных изолятов Escherichia coli, выделенных от детей первого года жизни. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 2017; 35 (1): 36-40. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-1-36-40.
До рождения ребенка его желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) стерилен. Биоценоз пищеварительного тракта у новорожденных детей после рождения находится в процессе формирования, и с первых минут контакта с окружающей средой появившийся на свет ребенок сталкивается с различными представителями микробной биоты. Происходит быстрая колонизация кишечника бактериями, входящими в состав грудного молока или смеси, заменяющей его, и биоты матери [1]. С течением времени состав микробиоты подвергается изменениям, в результате чего может произойти нарушение микробиоценоза кишечника (дисбиоз). Однако в патогенезе развития дисбиоза кишечника важную роль играют не только количественные и качественные изменения микробиоты, но и «патогенный» потенциал микроорганизмов [2].
Кроме того, следует иметь в виду индивидуальный штаммо-вый состав биоценозов каждого человека. Зачастую эти различия проявляются на уровне вида и даже рода микроорганизмов, колонизирующих конкретные биотопы отдельных индивидуумов. Поэтому несмотря на то, что здоровые биоценозы людей
Для корреспонденции: Иванова Елена Иннокентьевна (Ivanova Elena), к.б.н., и.о. старш. науч. сотр. лаб. микробиома и микроэкологии* t-mail: ivanova.iem@gmail.com
характеризуются спектром определенных общих закономерностей, абсолютно идентичных микробных систем не существует. Каждый индивидуум характеризуется своим микробным фенотипом. В состав биоценоза определенный вклад вносит наследственный фактор, основанный на передаче ребенку от матери физиологических штаммов, адаптированных во время внутриутробного развития к формирующейся иммунной системе плода. Кроме того, ребенок по наследству получает структуру и химический состав рецепторов, комплементарных адгезинам материнских штаммов. Также состав микробиоты характеризуется семейной индивидуальностью, зависит от традиций питания, бытовых условий, региона проживания, экзоэкологических воздействий и др. [3-5].
Семейство Enterobacteriaceae привлекает внимание ученых и специалистов, так как их выделение составляет значительную часть регулярных исследований бактериологов. Помимо «хрестоматийных» возбудителей (шигелл, сальмонелл) внимание к энтеробактериям привлекает существенно возрастающее значение условнопатогенных видов, а также представителей, традиционно считавшихся непатогенными [6]. Так, Escherichia coli, являясь постоянным обитателем кишечника человека, входит в состав его микробиоценоза в различных физиологических и фенотипических состояниях. Эти микроорганизмы, как убикви-тарные представители биоты, обладают высокой степенью биологической пластичности, позволяющей длительно циркулировать и колонизировать широкий круг биологических хозяев, адаптируясь к специфическим условиям среды обитания. Этом Е. coli по комплексу фенотипических характеристик [7]. А.А. Воробьев и соавт. полагают, что эволюционно сформировавшиеся отношения между человеком и Е. coli носят в большинстве случаев исключительно взаимовыгодный характер. В норме кишечная палочка выполняет ряд полезных для хозяина функций: синтезирует витамины и аминокислоты, поддерживает колонизационную резистентность кишечника, обеспечивает антигенную стимуляцию местного иммунитета [8]. Между тем при нарушениях микроэкологического характера E. coli способна резко наращивать не только свое количественное присутствие, но и проявлять патогенные свойства, что играет важную роль в патогенезе развития дисбиоза кишечника. Постоянный антигенный дрейф, наличие или приобретение различных факторов патогенности (токсины, гемолизины, некротизирующий и гемолитический факторы, сидерофоры) затрудняют проведение эффективной специфической профилактики эшерихиоза, что побуждает не только постоянно осуществлять мониторинг данной инфекции, но изучать и контролировать биологические свойства возбудителя (прежде всего его антибиотикорезистентность и наличие различных маркеров патогенности) [2]. Для эшерихий патогенность не является видовым признаком и не связана с конкретной серогруппой. Они способны реализовать свой патогенный потенциал и вызывать нарушения в организме человека, ограниченные только теми генетическими детерминантами па-тогенности, которыми обладает конкретный штамм E. coli [9].
Среди возбудителей, способных вызывать вспышки кишечных инфекций, наряду с вирусами важную роль играет энтеро-геморрагическая кишечная палочка - Escherichia coli 0157. Вызванная ею инфекция может привести к развитию гемолитико-уремического синдрома (ГУС, HUS) с формированием почечной недостаточности. Наибольшую угрозу она представляет для детей младшего возраста. Развитие HUs связывают со способностью микроорганизмов выделять веротоксины (Stx-токсины), обладающие способностью повреждать эндотелиальные клетки
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
[10]. Гены, кодирующие Shiga-токсины, находятся в составе ДНК бактериофагов [11], поэтому возможно, что E. coli любого серотипа может приобрести гены данных токсинов [12].
В связи с изложенным целью работы являлся анализ структуры бактериальных популяций кишечной микробиоты и частоты встречаемости гена, кодирующего синтез шига-подобного токсина (stxs), и гена, кодирующего формирование связывания пилей (bfp) у высокоактивных изолятов E. coli, выделенных у детей на протяжении первого года жизни.
Использованные праймеры и соответствующие им температуры отжига
Ген
Нуклеотидная последовательность праймера (5'-3')
Размер ампликона (п.н.)
Температура отжига
(oC)
stxl
stx2
bfp
Материалы и методы
Объектом исследования стали 85 детей первого года жизни с функциональными нарушениями пищеварения (ФН ЖКТ) (колики, функциональная диарея, функциональные запоры, дисфункция билиарного тракта в течение не менее 12 нед за последние 12 мес). Группой сравнения являлись 100 здоровых детей. Факторами исключения из исследования были хронические заболевания, в том числе ЖКТ, прием антибактериальных и пробиотических препаратов в предшествующие обследованию 3 мес. Выполненная работа не ущемляла права и не подвергала опасности благополучие субъектов исследования, осуществлена с информированного согласия пациентов согласно Приказу Министерства здравоохранения РФ № 266 от 19.06.2003 г., соответствует этическим нормам Хельсинской декларации 2000 г.
При микробиологическом анализе копрологических проб использовали общепринятый метод, оценку результатов проводили в соответствии с нормативами, приведенными в Отраслевом стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» 91500.11.0004-2003. Для исследования были идентифицированы и выделены изоляты E. coli с нормальной ферментативной активностью (высокоактивные, типичные) в количестве 68 аутоштаммов, выделенных от детей с ФН ЖКТ, и 20 аутош-таммов от здоровых детей. По культурально-ферментативным свойствам и антигенным характеристикам исследуемые штаммы E. coli являлись типичными представителями индигенной микрофлоры рода Escherichia.
Выделение бактериальной ДНК, амплификацию, электро-форетическое разделение ПЦР-продуктов проводили по ранее описанным методикам [13-15]. Маркеры вирулентности выявляли методом ПЦР с наборами специфических праймеров к 3 генам патогенности, кодирующим способность к шига-токсинообразованию - stx1 и stx2, и формирование связывания пилей - bfp. Использованные праймеры, а также соответствующие им температуры отжига указаны в таблице.
Термическую программу цикла амплификации проводили на амплификаторе (Applied Biosystems 2720 Thermal Cycles) и определяли методом подбора оптимальных программ после отработки условий, при которых результат был наиболее четким. Обобщенный протокол амплификации для генов stx состоял из следующих этапов: 1) первоначальная денатурация при 94 oC 2 мин; 2) 35 циклов: 94 oC 1 мин, 55 oC 1 мин, 72 oC 1 мин; 3) финальная элонгация - 72 oC 3 мин; 4) охлаждение до 4 oC. Для гена bfp: 1) первоначальная денатурация при 94 oC 2 мин; 2) 29 циклов: 94 oC 30 с, 56 oC 1 мин, 72 oC 2 мин; 3) финальная элонгация - 72 oC 3 мин; 4) охлаждение до 4 oC.
Статистическая обработка данных произведена при помощи прикладных программ «MS Excel for Windows» методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента при критическом значении уровня значимостиp < 0,05.
Результаты и обсуждение
При обследовании детей, страдающих ФН ЖКТ, с разной частотой отмечались изменения анаэробной составляющей кишечного микробиоценоза. У большинства (60±5,3%) детей в посевах копропроб выявлено снижение концентрации бифидобактерий, реже лактобацилл (1,2±1,1%). В 18,8±4,2% случаев также был выявлен дефицит кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью. Кишечные палочки с измененными свойствами (со слабой ферментативной активностью) были выявлены в 40±5,3% случаев, а гемолитические формы - в 10,6±3,3% случаев. В группе здоровых детей микробный спектр копропроб
F CGCTGAATGTCATTCGCTCTGC 302
R CGTGGTATAGCTACTGTCACC
F CTTCGGTATCCTATTCCCGG 516
R CTGCTGTGACAGTGACAAAACGC
F AATGGTGCTTGCGCTTGCTGC 326
R GCCGCTTTATCCAACCTGGTA
55
55
56
характеризовался доминирующим положением анаэробных микроорганизмов (бифидобактерий и лактобацилл), из аэробных -высокоактивная кишечная палочка выделялась в 100% случаев. Также обращает на себя внимание достоверно более высокая (p < 0,01) распространенность энтерококков (70,6%) среди детей с ФН ЖКТ по сравнению со здоровыми (13%).
Изменения численности условнопатогенной микробиоты также были выявлены практически у всех обследованных детей с ФН ЖКТ, причем как на фоне снижения численности индиген-ной флоры, так и без него. При этом чаще всего наблюдалось увеличение числа условнопатогенных энтеробактерий, которые были выделены у 60 (70,6%) детей, при этом ассоциации энтеро-бактерий как между собой, так и с другими условнопатогенными микроорганизмами (УПМ) были выделены у 44 (51,8%) детей. Общее число выделенных культур энтеробактерий составило 65. Среди них: Klebsiella spp. - 51 (78,5% от общего числа найденных условнопатогенных энтеробактерий), Enterobacter spp. - 9 (13,8%) штаммов, Citrobacter spp. - 3 (4,6%), Proteus spp. -2 (3,1%). Наличие коагулазоположительных стафилококков (Staphylococcus aureus) отмечалось в 39 (45,9%) случаях, а присутствие коагулазоотрицательных (S. epidermidis) - в 3 (3,5%). Дрожжеподобные грибы рода Candida обнаруживались в количествах, превышающих норму, у 6 (7,1%) детей, клостридии - у 19 (22,4%), неферментирующие грамотрицательные бактерии -у 2 (2,4%).
У большей части (91,8%) детей с ФН ЖКТ в кишечном биотопе выявлялись УПМ. В монокультуре представители УПМ встречались у 40%. При этом наиболее выявляемыми в монокультуре являлись Klebsiella spp. (18,8%), реже - S. aureus (9,4%), Clostridium spp. (5,9%), Enterobacter spp. (3,5%), Candida spp. (1,2%) и S. epidermidis (1,2%). В большинстве же (51,8%) случаев данные микроорганизмы формировали ассоциации, состоящие из нескольких компонентов (от 2 до 4 ассоциантов в биотопе). Необходимость изучения микроорганизмов как ассоциантов в сообществе, а не как суммы монокультур, обосновывается тем, что в ассоциациях микробные продукты действуют синергически, способствуя росту и размножению бактерий, экспрессии факторов патогенности [16].
У 38,8% обследованных детей в кишечном биотопе были обнаружены двухкомпонентные сочетания УПМ. Ассоциации, состоящие из 3 и 4 ассоциантов, выявлялись реже (11,8 и 1,2% соответственно). Из двухкомпонентных ассоциаций доминировали Klebsiella spp. + S. aureus (16,5%), реже встречались Enterobacter spp. + S. aureus (4,7%), Klebsiella spp. + Clostridium spp. (4,7%), Klebsiella spp. + Candida spp. (3,5%), S. aureus + Clostridium spp. (2,4%). Другие двухкомпонентные сочетания УПМ встречались крайне редко (по 1,2% случаев - Klebsiella spp. + Citrobacter spp, S. aureus + Pseudomonas spp, Klebsiella spp. + Proteus spp, Klebsiella spp. + Pseudomonas spp, Klebsiella spp. + S. epidermidis, S. epidermidis + Clostridium spp). Частое выявление Klebsiella spp. в ассоциациях с S. aureus скорее всего обусловлено дисбиотическими нарушениями, связанными с предшествующей колонизацией биотопа данными микроорганизмами (клебсиеллами), создающими условия для последующего заселения стафилококками, что свидетельствует о необходимости изучения этих межмикробных взаимодействий в ассоциативных симбиозах.
Молекулярно-генетическими методами нам удалось обнаружить в аутоштаммах высокоактивных изолятов E. coli гены ве-ротоксинов (2 типов). Так, веротоксин 1-го типа (stx1) был обна-
ружен в геноме высокоактивных изолятов E. coli, выделенных у детей с ФН ЖКТ, в 17,7% случаев. Как правило, изучаемые гены патогенности чаще определялись на фоне высокой популяцион-ной плотности эшерихий (107-108 КОЕ/г), на 2-3 порядка превышающих зарегистрированную нами их низкую концентрацию. Частота выявления веротоксина 2-го типа (stx2) регистрировалась реже 1-го типа в 6 раз и составляла 2,9% (p < 0,05).
В геноме аутоштаммов E. coli с нормальной ферментативной активностью (у детей с ФН ЖКТ) частота встречаемости гена bfp, кодирующего формирование связывания пилей и обеспечивающего адгезию микроорганизма к слизи и эпителию кишечного тракта, а также связывание бактерий между собой, регистрировалась в 91,2% случаев. При этом частота встречаемости данного гена также, как правило, определялась на фоне высокой популяцион-ной плотности эшерихий (107-108 КОЕ/г). В группе сравнения ген bfp присутствовал во всех выделенных аутоштаммах типичных E. coli (100%), гены stxl и stx2 определялись в 15 и 5% случаев соответственно.
Наличие генов патогенности мы анализировали в зависимости от возраста детей. Так, выявляемость гена stx1 у высокоактивных изолятов E. coli, выделенных у детей от рождения до 3 мес, составляла 11,8%. При этом частота регистрации данного гена с увеличением возраста (5-6 мес) снижалась и составляла 5,9%. Ген bfp наиболее чаще обнаруживали в изолятах E. coli у детей от рождения до 1 мес (32,3%), с увеличением возраста детей его частота несколько снижалась и составляла у детей в возрасте 3 мес - 21%, в 4 и 5 мес - 13 и 17,7% соответственно, в 6 мес и в 1 год жизни - 9,6 и 6,4% соответственно.
Наличие генов stx1 и bfp анализировали в зависимости от микроэкологического статуса кишечного биотопа. Нами было отмечено, что при дефицитном содержании в биотопе бифидо-бактерий и при совместной вегетации в кишечнике энтерококков оба гена выявлялись в геноме E. coli примерно с близкой частотой (stxl - 50% и bfp - 69,4%). В условиях более глубоких дисбиотических нарушений их «поведение» различалось. Так, при вегетации Klebsiella spp. доля аутоштаммов E. coli с stxl резко возрастала до 83,3%, а доля аутоштаммов с bfp оставалась по-прежнему высокой и составляла 64,5% случаев. При совместной вегетации с S. aureus в биотопе частота встречаемости stxl и bfp составляла 33,3 и 46,8% соответственно, с Clostridium spp. -33,3 и 22,6% также соответственно, а с Enterobacter spp. - 16,7 и 14,5%, с E. coli со слабой ферментативной активностью - 16,7 и 32,3% соответственно. Таким образом, «поведение» двух генов различалось в зависимости от преобладания того или иного микроорганизма, иначе говоря, при разных статусах микроэкологического дисбаланса в кишечном биотопе преобладают ау-тоштаммы E. coli преимущественно с двумя исследованными генами патогенности.
Генетические комбинации (stxl + bfp) в геноме микросимбионтов E. coli регистрировались в 14,7% случаев. В выборке здоровых детей в геноме E.coli с нормальной ферментативной активностью выявлялись следующие сочетания генов: bfp+stxl (10%), bfp+stx1+stx2 (10%).
Проведенные исследования показали, что практически у всех обследованных детей выявлялись отклонения в составе микроорганизмов кишечной микробиоты относительно общефизиологических нормативов. Процессы колонизации УПМ происходят на фоне резкого угнетения нормальных симбионтов, обеспечивающих колонизационную резистентность. Это обусловлено тем, что бифидофлора не только осуществляет поддержание микроэкологического гомеостаза за счет эволюционно сложившихся симбиотических взаимодействий с организмом хозяина, но и контролирует включение в микробиоценоз условнопатоген-ных бактерий-ассоциантов за счет препятствия их адгезии, антагонистического действия и подавления персистентных свойств аллохтонной микробиоты.
Обращает на себя внимание высокая распространенность энтерококков среди детей с ФН ЖКТ по сравнению со здоровыми. Это обстоятельство предполагает, что энтерококки в выборке детей с ФН ЖКТ приобрели статус доминирующего вида, тогда как у здоровых они регистрируются как факультативные обитатели кишечного биоценоза [14]. Учитывая неоднозначную роль энтерококков в микроэкологии человека (обеспечение колонизационной резистентности слизистых в норме и в то же
время усиление в последние десятилетия их роли в возникновении нозокомиальных инфекций), можно полагать, что увеличение частоты регистрации их у детей с ослабленной иммуно-резистентностью свидетельствует о высоком риске появления штаммов с наличием ряда факторов патогенности, вызывающих инфекционные процессы [17, 18].
Глубина дисбиотических нарушений во многом определяется УПМ и их ассоциациями. Выявляемые ассоциации микроорганизмов (51,8%) у данной выборки детей, как показывают экспериментальные исследования, оказывают по сравнению с их монокультурами более токсическое, некротическое и разрушающее действие на клетки, ткани и органы. Для ассоциированной инфекции характерными являются атипичное течение, недостаточная эффективность антибиотикотерапии и нередко переход в хроническую форму или носительство [19].
Любое инфекционное заболевание, вызываемое патогенными бактериями, и его специфическая клиническая симптоматика определяются действием одного или нескольких токсинов, продуцируемых конкретными штаммами. Токсин-опосредованная обусловленность патогенеза находит все больше подтверждений в экспериментальных и клинических исследованиях [20].
Актуальность изучения шига-токсинов также связана с вспышкой STEC-инфекции, произошедшей в 2011 г. в Германии, где было зарегистрировано более 4000 случаев инфекции, в том числе 900 случаев гемолитико-уремического синдрома и 50 случаев со смертельным исходом [21]. Штамм, вызвавший вспышку, обладал геном адгезии, характерным для энтероаггрегатив-ных форм E. coli. Предполагается, что из неизвестного источника эпидемические штаммы приобрели лямбдовидный профаг, транспортирующий гены, кодирующие шига-токсин 2-го типа, подтипа А (stx2a) [21, 22].
Данные, полученные в ходе работы по изучению факторов па-тогенности у аутоштаммов E. coli, свидетельствуют о циркуляции детерминант патогенности, кодирующих шига-подобные токсины у E. coli, не относящихся к патогенным серогруппам. Возможно, это связано с тем, что рутинная лабораторная диагностика, основанная на определении принадлежности к определенной серологической группе, не позволяет достоверно оценить этиологическую значимость изолятов E. coli [23].
Предполагается, что STX-фаги могут инфицировать более широкий диапазон бактерий-хозяев, чем ожидалось. Дальнейшие свидетельства, поддерживающие эту гипотезу, были представлены Н. Schmidt и соавт., которые смогли инфицировать и лизогенизировать различные патогруппы E. coli, в том числе ЕРЕС, STEC, EAggEC и EIEC, с помощью хлорамфеникол-устойчивых производных 5/х2-кодирующих бактериофагов [24]. Зарубежные исследования показывают, что STX-фаги имеют большую принимающую или проникающую специфичность по отношению к различным патогруппам E. coli, но при этом их стабильное приобретение может быть редким событием [25]. Возможно, этим и объясняется выявляемость генов па-тогенности в данной работе, наличие которых характерно для диареегенных эшерихий, что позволяет предполагать их потенциальную опасность для развития воспалительных процессов в кишечнике. Таким образом, за счет горизонтального переноса и встраивания в геном бактерий генов шига-токсинов может происходить превращение комменсальных членов семейства Enterobacteriaceae в кишечнике в производителей огромного разнообразия токсинов.
Однако несмотря на поразительный эффект, оказываемый STX на восприимчивые клетки, производство только токсинов является недостаточным для STEC, чтобы вызывать тяжелые заболевания у людей. В самом деле, STEC, связанный с гемолитико-уремическим синдромом, обычно колонизирует желудочно-кишечный тракт хозяина, вызывая типичное поражение энтероцитов, известное как «attaching and effacing» (A/E) [26]. Стоит отметить, что способность индуцировать A/E поражения имеют не только энтеропатогенные E. coli (ЕРЕС), но и кишечные палочки других патогрупп, которые вызывали вспышки инфекции с высоким уровнем смертности в Европе и США до конца Второй мировой войны, а в настоящее время являются основной причиной диарей и детской смертности в развивающихся странах [25]. До недавнего времени такую комбинацию вирулентных свойств и бактерий, не производящих STX, но вы-
OPИГИHAЛЬHЫE СТАТЬИ
зывающих A/E поражения, считали определяющей для энтеро-геморрагических E. coli (EHEC) [27].
Кроме того, результаты нашего исследования продемонстрировали высокую частоту присутствия гена bfp в популяциях E. coli с нормальной ферментативной активностью, что свидетельствует об эффективных процессах адгезии E. coli к эпителию кишечника. Это, с одной стороны, дает ей огромные преимущества в конкурентной борьбе с условнопатогенной микробиотой за сайты адгезии и занятии экологической ниши. С другой стороны, дает возможность типичной E. coli сохранять в кишечнике физиологически высокую популяционную плотность и осуществлять выполнение полезных для хозяина функций (синтез витаминов и аминокислот, поддержание колонизационной резистентности кишечника, обеспечение антигенной стимуляции местного иммунитета и др.) [28].
Регистрация веротоксинов должна определяться совокупно с другими генами патогенности. Сочетание генов bfp и stxl в геноме типичных кишечных палочек свидетельствует об усилении вирулентности бактерий, обеспечивающих как прикрепление к клеткам кишечного эпителия, так и последующее эффективное воздействие выделяемого ими токсина.
По нашим данным, исследованные штаммы имели селективное преимущество в условиях дефицита бифидобактерий, что соответственно создает благоприятные условия для колонизации кишечника УПМ (такими как Klebsiella spp, S. aureus, Clostridium spp.). По нашим данным, в геноме E. coli возрастает частота встречаемости исследованных генов при совместном вегетировании с УПМ. Вероятно, это связано с особенностями изучаемого биотопа детей с ФН ЖКТ. Кроме того, группа детей в возрасте до 1 года считается возрастной группой риска. Дети первого года жизни наиболее уязвимы в связи с незрелостью иммунной системы и процессами формирования относительно стабильного микробиоценоза, в результате чего происходит последовательная смена на определенном участке среды обитания одних сообществ организмов другими (сукцессия). При этом в определенный период жизни кишечник ребенка могут колонизировать представители УПМ, которые могут стать причиной развития дисбактериозов и различных осложнений, связанных с ним [29].
Таким образом, изучение особенностей межмикробных взаимоотношений и взаимодействий в ассоциациях бактерий определенного биотопа, включающее не только оценку модификации роста/размножения симбионтов, но и оценку патогенного потенциала бактерий, путем выявления детерминант, может позволить получить новые знания по механизму формирования микросимбиоценозов при разных формах инфекционного процесса, предложить критерии диагностики нормо- и патоценоза, открывает перспективы биорегуляции персистентного потенциала микроорганизмов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 4, 11, 12, 21, 22, 24-27 см. REFERENCES)
1. Хавкин А.Л., Жихарева Н.С. Коррекция дисбиотических изменений кишечника у детей на современном этапе. Русский медицинский журнал. Детская гастроэнтерология и нутрициология. 2004; 12 (16): 3-6.
2. Мамбетова Э.Ф. Сравнительная характеристика некоторых биологических свойств монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий рода Serratia и Staphylococcus aureus: Дисс. ... канд. мед. наук. Челябинск; 2007.
3. Акоев Ю.С., Сенцова Т.Б., Яцын Г.В. Новый взгляд на дисбиозы у новорожденных детей. Рос. педиатр. журн. 2000; (5): 13-4.
5. Мамонтова Л.М., Савилов Е.Д., Протодьяконов А.П., Маркова Ю.А. Инфекционная «агрессивность» окружающей среды: концепция микробиологического мониторинга. Новосибирск; 2000.
6. Поздеев О.К. Молекулярно-генетические основы патогенности энтеробактерий. Практическая медицина. 2010; 2 (41): 84-8.
7. Лиманская И.В. Биолого-экологический аспект персистенции эшерихий: Дисс. ... канд. мед. наук. Волгоград; 2006.
8. Караев Я.М. Протективные и иммуногенные свойстваэшерихи-озного анатоксина: Дисс. ... канд. вет. наук. Краснодар; 2008.
9. Лайман Е.Ф., Шаркова В.А., Мазур М.Е., Просянникова М.Н. Молекулярно-генетическая характеристика факторов патогенности E. coli, выделенных из операционных ран различных
классов. Международный журнал экспериментального образования. 2012; (5): 84-5.
10. Кафтырева Л.А., Долгих Т.И., Лазарева Л.И., Подколзин А.Т., Войтович М.А., Галилейская С.Б. Веротоксин как основной лабораторный критерий кишечной инфекции, вызванной Escherichia coli О157, осложненной гемолитико-уремическим синдромом, у детей раннего возраста в омской области. Клин. лаб. диагн. 2010; (8): 52-3.
13. Иванова Е.И., Попкова С.М., Джиоев Ю.П., Ракова Е.Б., Нем-ченко УМ., Рычкова Л.В. Выявление шигатоксинпродуцирую-щих штаммов Escherichia coli в популяциях нормальной кишечной микробиоты у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта. Клин. лаб. диагн. 2014; 59 (11): 56-60.
14. Иванова Е.И. Формирование патогенного потенциала у аутош-таммов Escherichia coli в ассоциативном симбиозе толстой кишки у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта: Дисс. ... канд. биол. наук. Иркутск; 2014.
15. Иванова Е.И., Попкова С.М., Джиоев Ю.П., Ракова Е.Б. Выявление генов патогенности, кодирующих способность к токсиноо-бразованию, у штаммов Escherichia coli, выделенных из кишечного биотопа детей. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2013; [2 (90), ч. 2]: 111-4.
16. Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В. Роль ассоциативных микросимбионтов в функционировании ассоциативного симбиоза. Журн. микробиол. 2012; (6): 89-95.
17. Габриелян И.Н., Горская Е.М., Спирина Т.С., Преображенская Т.Б. Энтерококки как возбудители инфекционных послеоперационных осложнений. Журн. микробиол. 2007; (4): 50-3.
18. Попкова С.М., Волокитина А.С., Джиоев Ю.П., Медведева П.А., Козлова Л.С., Немченко УМ. и др. Ассоциации видов и генов патогенности бактерий рода Enterococcus, выделенных из разных биотопов у жителей г. Иркутска. Известия Иркутского государственного университета. Серия «Биология. Экология». 2011; 4 [1 (9)]: 14-25.
19. Микробные ассоциации, их роль в инфекционном процессе. Available at: http://medon-line.ru/microbiology/id/59.
20. Онищенко Г.Г. Эпидемиологическая обстановка в Российской Федерации и основные направления деятельности по ее стабилизации. В кн.: Материалы докладов VIIIВсероссийского съезда эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М.; 2002: .
23. Егорова С.А., Макарова М.А., Кафтырева Л.А. Этиологическая значимость условно-патогенных энтеробактерий при острых кишечных заболеваниях и дисбиотических состояниях кишечника. Инфекция и иммунитет. 2011; 2 (1): 181-4.
28. Иванова Е.И., Попкова С.М., Джиоев Ю.П., Ракова Е.Б., Долгих В.В, Савелькаева М.В. и др. Определение частоты встречаемости генов, кодирующих способность к формированию связывания пилей у аутоштаммов Escherichia coli. Клин. лаб. диагн. 2015; 60 (1): 52-5.
29. Аветисян Л.Р. Эпидемиологические и микробиологические аспекты колонизации кишечника детей первого года жизни условно-патогенными микроорганизмами: Дисс. . канд. мед. наук. М.; 2008.
REFERENCES
1. Khavkin A.L., Zhikhareva N.S. Correction dysbiotic changes in the intestines of children at the present stage. Russkiy meditsinskiy zhurnal. Detskaya gastroenterologiya i nutritsiologiya. 2004; 12 (16): 3-6. (in Russian)
2. Mambetova E.F. Comparative Characteristics of .some Biological Properties of Monocultures and Cocultures Variations in Bacteria of the Genus Serratia and Staphylococcus Aureus: Diss. Chelyabinsk; 2007. (in Russian)
3. Akoev Yu.S., Sentsova T.B., Yatsyn G.V. A new look at the dysbiosis in infants. Ros. pediatr. zhurn. 2000; (5): 13-4. (in Russian)
4. Ouwehand A., Salminen S. The role of intestinal microflora for the development of the immune system in early childhood. Eur. J. Nutr. 2002; 1: 32-7.
5. Mamontova L.M., Savilov E.D., Protod'yakonov A.P., Markova Yu.A. Infectious "Aggressive" Environment: the Concept of Microbiological Monitoring. Novosibirsk; 2000. (in Russian)
6. Pozdeev O.K. Molecular genetic basis of pathogenicity of enterobacteria. Prakticheskaya meditsina. 2010; 2 (41): 84-8. (in Russian)
7. Limanskaya I.V. Biology and Environmental Aspects of the Persistence of E. Coli: Diss. Volgograd; 2006. (in Russian)
8. Karaev Ya.M. Protective and Immunogenic Properties of the Toxoid Escherichia: Diss. Krasnodar; 2008. (in Russian)
9. Layman E.F., Sharkova V.A., Mazur M.E., Prosyannikova M.N. Molecular genetic characterization of pathogenicity factors E. coli, isolated from surgical wounds of various classes. Mezhdunarodnyy
MOflEKYraPHAfl rEHETHKA, MHKPOBHO^OrH^ H BHPyCO^OEH^ №1, 2017
zhurnal eksperimental'nogo obrazovaniya. 2012; (5): 84-5. (in Russian)
10. Kaftyreva L.A., Dolgikh T.I., Lazareva L.I., Podkolzin A.T., Voy-tovich M.A., Galileyskaya S.B. VTEC as the main laboratory criteria intestinal infection caused by Escherichia coli 0157 complicated by hemolytic uremic syndrome in infants in the Omsk region. Klin. lab. diagn. 2010; (8): 52-3. (in Russian)
11. Scotland S.M., Smith H.R., Willshaw G.A., Rowe B. Verocytotoxin production in strains of Escherichia coli is determined by genes carried on bacteriophage. Lancetii; 1983. 216 p.
12. Law D. Virulence factors of Escherichia coli 0157 and other Shiga toxin-producing E. coli. J. Appl. Microbiol. 2000; 88: 729-45.
13. Ivanova E.I., Popkova S.M., Dzhioev Yu.P., Rakova E.B., Nemchen-ko U.M., Rychkova L.V. Identification shigatoksinprodutsiruyuschih Escherichia coli strains in populations of normal intestinal microbi-ota in infants with functional disorders of gastrointestinal tract. Klin. lab. diagn. 2014; 59 (11): 56-60. (in Russian)
14. Ivanova E.I. Formation Pathogenic Potential at Autostrains Escherichia Coli in an Associative Symbiotic Colon in Children with Functional Disorders of the Gastrointestinal Tract: Diss. Irkutsk; 2014. (in Russian)
15. Ivanova E.I., Popkova S.M., Dzhioev Yu.P., Rakova E.B. Identification of pathogenicity genes encoding ability to toxigenesis in Escherichia coli isolated from the children intestinal biotope. Byulleten' VSNTs SO RAMN. 2013; [2 (90), ch. 2]: 111-4. (in Russian)
16. Bukharin O.V., Kremleva E.A., Sgibnev A.V. The role of associative microsymbionts in the functioning of associative symbiosis. Zhurn. mikrobiol. 2012; (6): 89-95. (in Russian)
17. Gabrielyan I.N., Gorskaya E.M., Spirina T.S., Preobrazhenskaya T.B. Enterococcus pathogens of infectious post-operative complications. Zhurn. mikrobiol. 2007; (4): 50-3. (in Russian)
18. Popkova S.M., Volokitina A.S., Dzhioev Yu.P., Medvedeva P.A., Ko-zlova L.S., Nemchenko U.M. et al. Association of species and genes pathogenic bacteria of the genus Enterococcus, selected from different habitats of the residents of Irkutsk. Izvestiya Irkutskogo gosu-darstvennogo universiteta. Seriya "Biologiya. Ekologiya". 2011; 4 [1 (9)]: 14-25. (in Russian)
19. Microbial associations and their role in the infectious process. Available at: http://medon-line.ru/microbiology/id/59. (in Russian)
20. Onishchenko G.G. The epidemiological situation in the Russian Federation and the key actions for its stabilization. In: [Materialy dokladov VIII Vserossiyskogo s"ezda epidemiologov, mikrobiologov iparazitologov]. Moscow; 2002: . (in Russian)
21. Bielaszewska M., Mellmann A., Zhang W., Kock R., Fruth, A. Bau-wens A. et al. Characterisation of the Escherichia coli strain associated with an outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, 2011: a microbiological study. Lancet Infect. Dis. 2011; 11: 671-6.
22. Scheutz F., Nielsen E. M., Frimodt-Moller J., Boisen N., Morabito S., Tozzoli R. et al. Characteristics of the enteroaggregative Shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli 0104: H4 strain causing the outbreak of haemolytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011. Euro Surveill.; 2011; 16. Available at: http://www.euro-surveillance.org/viewarticle.aspx?articleid=19889.
23. Egorova S.A., Makarova M.A., Kaftyreva L.A. The etiological significance of opportunistic Enterobacteriaceae in acute intestinal diseases and intestinal conditions dysbiotic. Infektsiya i immunitet. 2011; 2 (1): 181-4. (in Russian)
24. Schmidt H., Bielaszewska M., Karch H. Transduction of enteric Es-cherichia coli isolates with a derivative of Shiga toxin 2-encoding bacteriophage phi3538 isolated from Escherichia coli 0157: H7. Appl. Environ. Microbiol. 1999; 65: 3855-61.
25. Tozzoli R., Grande L., Michelacci V., Ranieri P., Maugliani A., Ca-prioli A. et al. Shiga toxin-converting phages and the emergence of new pathogenic Escherichia coli: a world in motion. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014; 4 (80). doi: 10.3389/fcimb.2014.00080.
26. Mcdaniel T.K., Kaper J.B. A cloned pathogenicity island from en-teropathogenic Escherichia coli confers the attaching and effacing phenotype on E. coli K-12. Mol. Microbiol. 1997; 23: 399-407. doi: 10.1046/j.1365-2958.1997.2311591.x
27. Levine M.M. Escherichia coli that cause diarrhea: enterotoxi-genic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohemorrhagic, and
enteroadherent. J. Infect. Dis. 1987; 155: 377-89. doi: 10.1093/ infdis/155.3.377
28. Ivanova E.I., Popkova S.M., Dzhioev Yu.P., Rakova E.B., Dolgikh V.V, Savel'kaeva M.V. et al. Determination of the nucleotide sequences of the genes encoding bundle-forming pilus gene in autostrains Escherichia coli. Klin. lab. diagn. 2015; 60 (1): 52-5. (in Russian)
29. Avetisyan L.R. Epidemiological and Microbiological Aspects ofIn-testinal Colonization in Infants Opportunistic Pathogens: Diss. Moscow; 2008. (in Russian)
nocTynuna 08.07.15
Ivanova E.I.', Rychkova L.V.1, Nemchenko U.M.1, Bukharova E.V.1, Savelkaeva M.V.1, Dzhioev Yu.P.12
THE STRUCTURE OF THE INTESTINAL MICROBIOTA AND THE FREQUENCY OF DETECTION OF PATHOGENICITY GENES (STX1, STX2, BFP) IN ESCHERICHIA COLI WITH NORMAL ENZYMATIC ACTIVITY ISOLATED FROM CHILDREN DURING THE FIRST YEAR OF LIFE
1 Scientific Center of the Family Health and Human Reproduction Problems, 664003, Irkutsk, Russian Federation 2 Irkutsk State Medical University, 664003, Irkutsk, Russian Federation
E. coli is an intestinal commensal of vertebrates. The ability to produce Shiga toxins (Stx) is the major virulence feature of Shiga toxin-producing E. coli (STEC). These potent cytotoxins block the protein synthesis by inactivating ribosomes. Their action on the target cells is responsible for the most severe forms of STEC-induced disease, such as hemorrhagic colitis and the life-threatening hemolytic uremic syndrome (HUS). Enteropathogenic E. coli (EPEC) also continues to be an important cause of infantile diarrhea in developing countries. Bundle-forming pili (bfp) are essential for the full virulence of enteropathogenic E. coli (EPEC). Exchange of genetic material between different types of bacteria, as well as with other members of the family Enterobacteriaceae in the intestinal ecosystem, leads to the appearance of normal variants of E. coli with phenetic features of pathogenicity that can serve as a theoretical basis for attributing these strains to pathobionts. PCR was used to examine 68 strains of E. coli (E. coli with normal enzymatic activity) for the presence of genes encoding the synthesis of Shiga toxins (stx1 and stx2) and genes encoding the bundle-forming pilus (bfp). They were isolated from children with functional disorders of the gastrointestinal tract. The presence of the desired amplicon specific for stx1 and bfp genes has resulted in formation of E. coli strains with more intense pathogenicity. Keywords: microbiocenosis, gastrointestinal tract, microsymbi-ont, Escherichia coli, Shiga toxin, stx-phages, pathogenicity genes, bundle-forming pilus gene (bfp)
For citation: Ivanova E.I., Rychkova L.V., Nemchenko U.M., Bukharova E.V., Savelkaeva M.V., Dzhioev Yu.P. The Structure of the Intestinal Microbiota and the Frequency of Detection of Pathogenicity Genes (stx1, stx2, bfp) in Escherichia Coli with Normal Enzymatic Activity Isolated from Children during the First Year of Life. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2017; 35(1):4-11. (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-1-36-40.
For correspondence: Elena Innokentievna Ivanova, PhD, acting senior researcher of the Laboratory of microbiome and microecol-ogy, Scientific Center of the Family Health and Human Reproduction Problems, 664003, Irkutsk, Russian Federation; E-mail: ivanova. iem@gmail.com
Acknowledgments. The study had no sponsor support. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
