CC BY
31Ветеринарный врач. 2022 . № 4 . С. 60 - 65 !be veterinarian. 2022; (4): 60 - 65
Научная статья УДК 619:616-097
DOI 10.33632/1998-698Х.2021_7_15
Диагностические методы оценки передачи пассивного иммунитета у новорожденных телят
Юрий Николаевич Федоров, Олеся Анатольевна Богомолова, Ольга Владимировна Анисина, Михаил Николаевич Романенко, Кристина Николаевна Царькова.
Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической
промышленности, лаборатория иммунологии, Россия, пос. Биокомбината,
Автор, ответственный за переписку: Олеся Анатольевна Богомолова, ch7_ lime@mail.ru
Аннотация: В статье представлен краткий литературный обзор лабораторных и производственных методов диагностики эффективности передачи пассивного иммунитета у новорожденных телят, обсуждаются принципы и основные положительные и негативные аспекты каждого метода.
Ключевые слова: пассивный иммунитет, методы анализа, иммуноглобулины, передача пассивного иммунитета, телята
Diagnostic Methods for Assessing Transfer of Passive Immunity in newborn calves
Yuri N. Fedorov, Olesya A. Bogomolova, Mikhail N. Romanenko, Olga V.Anisina, Krystina N. Tsar'kova, All-Russian Research and Technological Institute of the Biological Industry Russia, pos. Biokombinata, vnitibp@mail.ru
Corresponding author: Olesya Anatolevna Bogomolova , ch_ lime@mail.ru
Abstract. The objective of this study is to review the methods of evaluation available for the laboratory and field diagnosis of transfer of passive immunity in neonatal calves and discuss the main positive and negative aspects of each technique.
Keywords: passive immunity, immunoglobulins, analysis methods, transfer of passive immunity,
calf
Введение. Передача иммуноглобулинов от матери новорожденным, квалифицируемая как пассивная передача иммунитета, является важнейшим фактором защиты новорожденных от инфекционных болезней в ранний постнатальный период. Нарушение пассивной передачи не рассматривается как болезнь, а определяется как состояние, предрасполагающее к развитию заболеваний. Общепринятым считается, что нарушение пассивной передачи иммунитета регистрируется у 20-35% телят. Это обстоятельство делает нарушение пассивной передачи иммунитета важной экономической проблемой в промышленном животноводстве. Синепите-лиохориальная структура плаценты коров (ранее квалифицировалась как синдесмохо-риальная) разделяет кровь матери и плода и препятствует передаче иммуноглобулинов от матери в антенатальный период, поэтому
телята рождаются агаммаглобулинемичными, без собственных иммуноглобулинов, которые они получают при потреблении молозива с формированием пассивного иммунитета. Передача пассивного иммунитета у телят осуществляется через молозиво в течение первых 24 часов после рождения за счет абсорбции иммуноглобулинов эпителиальными клетками тонкого отдела кишечника. Получение молозива, содержащее высокий уровень иммуноглобулинов, является основным фактором реализации генетического потенциала роста и развития, защиты телят против патогенов, присутствующих в окружающей среде в ранний постнатальный период. Универсальным носителем пассивного иммунитета является IgG, который переходит из сыворотки крови матери в молозиво за несколько недель до отела, процесс транспорта достигает максимума за 1-3 дня до отела коров. Состояние
иммунологической незащищенности телят изменяется после получения молозива, которое является единственным источником защитных антител для новорожденного. Процесс, посредством которого коровы передают иммуноглобулины новорожденным телятам через молозиво, называется пассивной передачей иммунитета (колостральный иммунитет) [3,9,11,15,19,21,26].
Оценка иммунного статуса и диагностика нарушений пассивной передачи иммунитета у телят основана на определении концентрации IgG, содержание которого является референсным информативным показателем иммунного статуса новорожденных телят, индикатором эффективности передачи иммуноглобулинов через молозиво. Иммунодефи-цитное состояние, связанное с нарушением пассивной передачи, регистрируется, когда телята в суточном возрасте имеют уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови менее 10.0 мг/мл, что обусловливает повышение их заболеваемости и смертности в сравнении с телятами, получившими адекватную передачу пассивного иммунитета с молозивом. Много -численные исследования позволили экспертам достичь международного консенсуса и предложить современные критерии в оценке пассивного иммунитета у телят по содержанию в сыворотке крови IgG в 4-х категориях: превосходный (>25.0 мг/мл), хороший (18.0-24.9 мг/мл), удовлетворительный (10.0-17.9 мг/мл) и неудовлетворительный, или недостаточный (<10.0 мг/мл). Основным фактором, способствующим передаче и формированию пассивного иммунитета у новорожденных телят, является получение после рождения адекватного объема молозива с высокой концентрацией иммуноглобулинов (>50 мг/мл IgG) и с минимизированной бактериальной контаминацией (<1000 КОЕ/мл). Иммуноглобулины молозива играют ключевую роль против возбудителей инфекций у телят, имеющих место в ранний постнатальный период [8, 11, 17].
Для оценки эффективности пассивной передачи иммунитета используется широкий спектр различных качественных и количественных, прямых и непрямых иммунологических и биохимических методов определения концентрации IgG в сыворотке крови телят в течение 24-48 часов после рождения. Своевременная диагностика иммунодефицитных состояний у новорожденных телят, обусловленных несвоевременным и неадекватным получением молозива после рождения, является решающим фактором снижения риска заболеваемости и смертности телят. Наиболее инфор-
мативными и специфическими методами количественной оценки содержания IgG в сыворотке крови и иммунного статуса новорожденных телят являются радиальная имму-нодиффузия (РИД), иммуноферментный анализ (ИФА, непрямой и «сэндвич»-варианты), реакция латекс-агглютинации (по IgG-изотипу), иммунохроматографический метод, которые относятся к прямым методам определения уровня иммуноглобулинов. Предпочтение в лабораторных исследованиях следует отдавать тест-системам на основе иммуно-ферментного анализа и реакции агглютинации латекса, которые являются экспресс-методами и их результаты коррелируют с референсным методом количественного определения уровня иммуноглобулинов - методом радиальной им-мунодиффузии 92-98% («золотой стандарт»). Для оценки иммунного статуса телят и диагностики нарушений пассивной передачи в производственных условиях, наряду с указанными иммунологическими методами, находят применение непрямые методы, такие как рефрактометрия, пробирочный тест с сульфитом натрия (наиболее простой и информативный), турбидиметрический тест с сульфатом цинка, глутаральдегидовый тест, которые выявляют общий уровень иммуноглобулинов [1,4,5,6,10, 12,13,20,23,24,27].
Прямые методы. Метод радиальной иммунодиффузии является классическим методом определения концентрации иммуноглобулинов у телят, рассматривается как золотой стандарт и используется как референсный тест в сравнении с другими при оценке нарушений передачи пассивного иммунитета. Метод радиальной иммунодиффузии (РИД) основан на том, что иммуноглобулины испытуемых проб (сыворотка крови, молозиво, молоко) радиально диффундируют в агар, содержащий моноспецифическую антисыворотку или моноклональные антитела к иммуноглобулинам отдельных изотипов, образуя кольцо преципитации, диаметр которого прямо пропорционален концентрации иммуноглобулинов. Диаметр колец преципитации рефе-ренсной сыворотки крови с известным содержанием иммуноглобулинов каждого изотипа измеряют и строят калибровочную кривую. Измерив диаметр колец преципитации испытуемых проб сыворотки крови, по калибровочной кривой определяют количественное содержание иммуноглобулинов соответствующего изотипа. Метод требует 18-24 часа для получения результатов и его использование не рекомендуется в качестве рутинного метода на фермах для мониторинга эффективности пере-
дачи пассивного иммунитета. В связи с этим этот метод рекомендуется как арбитражный тест для исследований и изучения нарушений передачи пассивного иммунитета с использованием других методов во время случаев смертности телят в ранний постнатальный период [6,18].
Иммуноферментный метод является полуколичественным тестом определения концентрации иммуноглобулинов. В основу определения положен принцип твердофазного сэн-двич-ИФА, при котором в качестве сенсибилизирующего реагента используют моноспецифическую антисыворотку или монокло-нальные антитела к IgG, связывающие иммуноглобулин G исследуемой пробы. Образовавшийся комплекс выявляется коньюгатом анти-IgG антител, меченными ферментом пероксидазы. При добавлении субстратной смеси в результате ферментативной реакции образуется продукт, интенсивность окрашивания которого зависит от содержания IgG в исследуемой пробе. Подобно методу радиальной иммунодиффузии, иммунофер-ментный метод является лабораторным методом и имеет некоторые практические ограничения. В лабораторных исследованиях он имеет преимущества за счет более высокой чувствительности, времени выполнения
(экспресс-метод) и одновременного исследования большего количества проб [7, 16].
Непрямые методы. Тест с сульфитом натрия. Метод предполагает использование различных концентраций растворов сульфита натрия, которые селективно преципитируют высокомолекулярные белки, включая иммуноглобулины и помогают оценить помутнение растворов. Метод основан на том, что иммуноглобулины, которые появляются в сыворотке крови новорожденных животных после приема молозива, преципитируются растворами сульфита натрия в концентрации от 14 до 18%. Турбидиметрический тест с сульфитом натрия представляется как трехступенчатый полуколичественный метод с использованием 14, 16 и 18% растворов сульфита натрия. В пробирки разливают по 1,9 мл каждого из трех растворов и добавляют по 0,1 мл испытуемой сыворотки крови телят. Содержимое пробирок тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на один час. При положительной реакции в пробирке при визуальной оценке появляется помутнение или выпадает осадок (таблица 1). Далее, представленная таблица 2 позволяет по характеру преципитации более детально оценивать количественные характеристики иммуноглобулинов в сыворотке крови телят.
Таблица 1 - Определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови по результатам преципитации с сульфитом натрия
Концентрация иммуноглобулинов, мг/мл Концентрация Na2SO3
14% 16% 18%
Оптимальный уровень (>15,0 мг/мл) + + +
Пониженный уровень (5-15 мг/мл) - + +
Низкий уровень (<5,0 мг/мл) - - +
Отсутствие иммуноглобулинов (0,0 мг/мл) - - -
Примечание: «+» - наличие иммуноглобулинов; «-» - отсутствие иммуноглобулинов.
Таблица 2 - Уточненная оценка концентрации сывороточных иммуноглобулинов по результатам преципитации сульфитом натрия
Концентрация Концентрация Na2SO3
иммуноглобулинов (мг/мл) 14% 16% 18%
0-1 - - -
<5 - - +
4-5 - ± +
6-15 - + +
12-18 ± + +
>15 + + +
Примечание: «+» - выраженный преципитат; «±» - помутнение; «-» - отсутствие преципитата; «<» -меньше или равное 5,0 мг/мл; «>» - больше или равное 15,0 мг/мл.
Пробы плазмы крови непригодны для использования в тесте с сульфитом натрия, так как фибриноген и другие факторы свертывания преципитируются сульфитом натрия.
Концентрация иммуноглобулинов в сыворотке крови телят более 15,0 мг/мл свидетельствует об адекватной передаче пассивного иммунитета с молозивом, содержание иммуноглобулинов от 5,0 до 15,0 мг/мл квалифицируется как частичное нарушение передачи иммунитета, а концентрация менее 5,0 мг/мл и 0,0 мг/мл оценивается как полное нарушение процесса передачи пассивного иммунитета. Метод рассматривается как простой непрямой экспресс-тест для оценки передачи пассивного иммунитета у телят, он является достаточно эффективным для применения в полевых условиях [6, 22].
Метод определения активности гам-ма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови телят также рассматривается как индикатор передачи пассивного иммунитета с молозивом. Молочная железа коров в период колост-рогенеза продуцирует гамма-глутамилтранс-феразу, содержание которой в молозиве снижается в течение 7 дней после начала лактации. При получении телятами молозива фермент абсорбируется и его активность может быть обнаружена в сыворотке крови. Активность фермента у телят, получивших молозиво, в 60-160 раз выше, чем у здорового взрослого крупного рогатого скота. Выявление фермента в сыворотке крови телят свидетельствует о получении молозива. Исследования показали, что высокая концентрация фермента в сыворотке крови телят свидетельствует только о том, что они получили молозиво без оценки его адекватности и корреляции с концентрацией IgG. Концентрация фермента в молозиве не имеет биологического отношения к концентрации IgG в молозиве. Метод определения активности гамма-глута-милтрансферазы в сыворотке крови телят имеет неоднозначные результаты. Нет корреляции результатов определения активности фермента с методами определения иммуноглобулинов в сыворотке крови телят. Поэтому метод не дает прямой информации об эффективности передачи пассивного иммунитета с молозивом. Следует иметь в виду, что пастеризация молозива снижает активность гамма-глутамилтрансферазы. Поэтому оценивается активность фермента в сыворотке крови телят только при получении не пастеризованного материнского молозива. Период времени после рождения, когда этот тест может быть использован, составляет 8-10 дней. Если активность гамма-глутамилтрансферазы сыворотки крови телят составляет <50 МЕ/Л, результат квалифицируется как нарушение передачи пассив-
ного иммунитета. Оптимальная активность гамма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови в суточном возрасте телят должна составлять >200 МЕ/Л [8,23,27].
Турбидиметрический тест с сульфатом цинка. Для выполнения данного теста используют раствор, содержащий 208 мг ZnSO47H2O/л дистиллированной воды, который кипятят для удаления СО2. Пробу сыворотки крови (100 мкл) смешивают с 6 мл раствора и инкубируют в течение часа. Оценивают абсорбцию на спектрофотометре при 600 нм и помутнение конвертируют в мг IgG/мл по стандартной калибровочной кривой, полученной из проб с известной концентрацией IgG. В исследованиях показана достаточно высокая чувствительность и специфичность метода в сравнении с определением концентрации IgG в реакции радиальной иммуно-диффузии (золотой стандарт) [6,14].
Глутаральдегидовый тест коагуляции является полуколичественным методом определения сывороточного фибриногена и концентрации иммуноглобулинов. Метод основан на использовании растворов глута-рового альдегида в различных концентрациях с определением времени образования геля, связанного с реакцией между фибриногеном крови, иммуноглобулинами и альдегидными группами реагента. Существует несколько модификаций метода. Наиболее простой метод для оценки иммунного статуса новорожденных телят предполагает использование 10% раствора глутарового альдегида: 50 мкл раствора добавляют к 0,5 мл сыворотки крови. Пробу оставляют на 1 час для образования сгустка. Если в течение часа не формируется сгусток, проба сыворотки крови оценивается как гипогаммаглобулинемичная. Возможно использование цельной крови для оценки содержания иммуноглобулинов в испытуемой пробе. Для этого 1,5 мл крови добавляют к раствору глутарового альдегида для образования сгустка. Формирование сгустка в течение <5 мин. свидетельствует об адекватной передаче пассивного иммунитета с молозивом. Другая модификация предполагает использование 25% раствора глутарового альдегида. Кровь в объеме 2 мл смешивают с 2 мл раствора глутарового альдегида, оценка коагуляции осуществляется в течение 15 мин. по 4 категориям: 1-я - 0 - <3 мин. - высокая концентрация иммуноглобулинов; 2-я - >3 - < 6 мин. - умеренное содержание иммуноглобулинов; 3-я - >6 - <15 мин. - низкая концентрация иммуноглобулинов; 4-я - >15 мин. - от-
сутствие иммуноглобулинов. Чувствительность метода коагуляции составляет 57-86% (73%) [2,25].
Заключение. Проблема сохранения новорожденных телят в ранний постнатальный период остается актуальной во всех странах мира с развитым промышленном животноводством. Основной экономический ущерб связан с высокой заболеваемостью и смертностью новорожденных животных с иммуно-дефицитным состоянием, обусловленным несвоевременным и неадекватным получением полноценного в иммунобиологическом отношении молозива. При рождении телята не имеют иммунной защиты, поскольку собственная иммунная система является незрелой, а материнские иммуноглобулины (антитела) не передаются через плаценту. Пассивная иммунная защита передается теленку посредством потребления молозива и абсорбции содержащихся в нем в высокой концентрации иммуноглобулинов, преимущественно IgG. Передача иммуноглобулинов от матери новорожденным через молозиво является наиболее важным фактором их защиты от инфекционных болезней в ранний постнатальный период. Для своевременного контроля иммунного статуса и выявления нарушений пассивной пере-
дачи колостральных иммуноглобулинов предложены различные диагностические тест-системы, основанные на определении содержания иммуноглобулинов у телят после рождения. Радиальная иммунодиффузия, иммунофер-ментный анализ, реакция латекс-агглютинации являются тестами, которые непосредственно позволяют определять концентрацию IgG (универсального носителя защитных функций). Все другие тесты, включая рефрактометрию, турбидиметрические тесты с сульфитом натрия, сульфатом цинка, коагуляции глу-тарового альдегида и определение активности гамма-глутамилтрансферазы в сыворотке крови основаны на определении общего количества иммуноглобулинов, которые предаются пассивно с молозивом и статистически ассоциируются с IgG. Наиболее эффективным средством сохранения молодняка в ранний постнатальный период, предотвращения инфекционных болезней у новорожденных животных остается пассивный колостральный иммунитет, который формируется после рождения с получением молозива, содержащего высокий уровень иммуноглобулинов, обладающих широким спектром иммунобиологической активности.
Список источников (References)
1. Alley, M.L. Short communication: Evaluation of serum immunoglobulin G concentrations using an automated turbidimetric immunoassay in dairy calves./M.L.Alley, M.D.Haines, G.M.Smith //J.Dairy Sci. 2012.-95.-8.- 4596-4599.
2. Bernarski, E.E. The glutaraldegyde test and its use in dairy cattle./E.E.Bernarski, K.G.da Silva, L.V.Nascimento [et al.].//Semina: Ciencias Agrarias,Loadrina.2019.-40.-5.-1891-1900.
3. Borghesi, J. Immunoglobulin Transport during Gestation in Domestic Animals and Humans -A Review. /J.Borghesi, L.C.Mario, M.N.Rodrigues, P.O.Favaron, M.A.Miglino//Open Journal of Animal Sciences. 2014.-4.-323-336.
4. Cuttance, E.L. Comparison of diagnostic test for determining the prevalence of failure of passive transfer in New Zealand dairy calves./E.L.Cuttance, W.A.Mason, K.S.Enholm, R.A.Laven//N.Z.Vet.J. 2017.-65.-1.-6-13.
5. Delhez, P. Assessment of a Rapid Semi-Quantitative Immunochromatographic Test for the Evaluation of Transfer of passive Immunity in Calves / P.Delhez,E.Meurette,E.Knapp [et al.].//Animals.2021.-11.-1641-1627.
6. de Souza, R.S. Current Diagnostic Methods for Assessing Transfer of Passive Immunity in calves and Possible Improvements: A Literature Review /R.S.de Souza, L.B.C. dos Santos, I.O. Melo [et al.]. //Animals.2021.-11.- 2963.
7. Dunn, A. Comparison of single radial immunodiffusion and ELISA for the quantification of immunoglobulin G in bovine colostrum, milk and calf sera. /A.Dunn, C.Duffy, A.Gordon [et al.] //J.Appl.Animal Res.2018.-46.1.-758-765.
8. Elitok, B. Indicators of passive immunity failure in neonatal calves./B.Elitok//Oncology Research and Reviews. 2018.-1(3).-1-2.
9. Furman-Fratczak, K. The influence of colostral immunoglobulin concentration in heifer calves serum on their health and growth /K.Furman-Fratczak, A.Rzasa, T.J.Stefaniak //Dairy Sci.- 2011.- v.94.- P. 55365543.
10. 10 .Gamsjager, L. Evaluation of 3 refractometers to determine transfer of passive immunity in neonatal beef calves./L.Gamsjager, I.Elsohaby, J.M.Pearson [et al.]//J.Vet.Intern.Med.2021.-35.-632-643.
11. Godden, S.M. Colostrum management for dairy calves. /S.M.Godden, J.E.Lombard, A.R.Woolums //Vet.Clin.North Am.Food.Animal Pract. 2019.-35.-535-556.
12.Heinrichs, A.J. Reducing failure of Passive Immunoglobulin Transfer in Dairy calves. /A.J. Heinrichs, J.A. Elizondo-Salazar //Revue Med.Vet.-2009.-8-9.- P.436-440.
13.Hogan, I. Comparison of rapid laboratory tests for failure of passive transfer in the bovine / I. Hogan, M. Doherty, J. Fagan [et al.] .//Irish Vet.J.-2015.-68.-18.-1-10.
14.Hogan, I. Optimisation of the zinc sulphate turbidity test for the determination of immune satus. /I.Hogan, M.Doherty, J.Fagan [et al.] //Vet.Rec. 2016.-178.-169.
15. Kaskous, S. Immunoglobulin in colostrum and health of newborn calves /S.Kaskous, A. Fadlelmoula // Sci.J.Rev.-2015.-4(12).- P.242-249.
16. Lee, S.H. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Single Radial Immunodiffusion, and Indirect Methods for the detection of Failure of Transfer of Passive Immunity in Dairy Calves /S.H.Lee, J.Jaekal,
C.S.Bae, B.H.Chung [et.al.] //J.Vet.Intern.Med. 2008.-22.-1.-12-218.
17. Lombard, J. Consensus recommendations on calf- and herd-level passive immunity in dairy calves in the United States /J.Lombard, N.Urie, F.Garry, S.Godden [et al.] //J.Dairy Sci. 2020.-103.-8.-7611-7624.
18. Mancini, G. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. /G.Mancini, O.Carbonara and J.E.Heremans //Immunochem. 1965.- 2.-235-254.
19. McGee M. Review: passive immunity in beef-suckler calves./M.McGee, B. Earley //Animal.-2018.-13(4).- P.1-6.
20. Pekcan, M. Estimation of passive immunity in newborn calves with routine clinical chemistry measurements./M.Pekcan, U.R.Fidanci, B.Yuceer, C.Ozbeyaz //Ankara Univ.Vet.Fak. Derg. 2013.-60.-85-88.
21. Peter, A.T. Bovine placenta: A review on morphology, components, and defects from terminology and clinical perspectives. /A.T.Peter //Theriogenology. 2013.-80.-693-705.
22. Pfeiffer, N.E. A sodium sulfite-precipitation test for assessment of colostral immunoglobulin transfer to calves./N.E.Pfeiffer, T.C.McGuire//J.Amer.Vet.Med.Ass.1977.-170(8).-809 - 811.
23. Topal, O. Comparison of IgG and semiquantitative tests for evaluation of passive transfer immunity in calves. O.Topal, H.Batmaz, Z.Mecitoglu, E.Uzabact/Turk. J.Vet.Anim. Sci.2018.-42.-302-309.
24. Tyler, J.W. Evaluation of 3 assays for failure of passive transfer calves. /J.W.Tyler, D.D.Hancock, S.M.Parish [et al.]. //J.Vet.Intern.Med. 1996.-10.-304-307.
25. Tyler, J.W. Evaluation of a whole blood glutaraldehyde coagulation test for the detection of failure of passive transfer in calves J.Vet.Intern.Med.1966.-10.-82-84.
26.Weaver, D.M. Passive transfer of colostral immunoglobulins in calves. /D.M.Weaver, J.W.Tyler,
D.C.VanMetre [et al.]. //J.Vet.Intern.Med. 2000.-14.-6.-569-577.
27. Zakian, A. Evaluation of 5 methods for diagnosis failure of passive transfer in 160 Holstein calves /A.Zakian, M.Nouri, A.Rasooli [et al.].//Vet.Clin.Pathol.2018.-47(2).-275-283.
Вклад авторов:
Федоров Ю.Н.- концепция, сбор и научный анализ литературы, написание и редактирование, заключение.
О.А.Богомолова, О.В.Анисина, М.Н.Романенко, К.Н.Царькова - сбор источников, перевод иностранной литературы, практический анализ и оценка описываемых методов, обсуждение основных положительных и негативных аспектов каждого метода.
Все авторы внесли эквивалентный вклад, читали и согласны с публикацией представленной версии рукописи.
Contribution of the authors:
Yuri N.Fedorov - Conceptualization, searching and analysis of literature, writing-review and editing, final conclusions.
Olesya A. Bogomolova, Mikhail N. Romanenko, Olga V.Anisina, Krystina N. Tsar'kova - searching and translation of literature, practical analysis and assessment methods, discuss the main positive and negative aspects of each technique.
The authors contributed equally to this article. The authors declare no conflicts
© Ю.Н.Федоров, Богомолова О.А., Анисина О.В., Романенко М.Н., Царькова К.Н., 2022
