CC BY
13
DOI: 10.24412/2074-5036-2023-4-43-52 УДК: 619:616.98:578.835.2:616-078.33(049.32)
Ключевые слова: вирус ящура серотипа SAT 2, иммуноферментный анализ, гуморальный иммунитет
Keywords: foot-and-mouth disease virus serotype SAT 2, enzyme immunoassay, humoral immunity
хЛуговская Н. Н., Силантьева Е. А., хМихалишин Д. В., хМороз Н. В., 2Малыгин М. П., Харитонова А. А., хДоронин М. И., Чочмурадов Ы. М., Юковытая Т. В., Борисов А. В.
ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К СТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ ВИРУСА ЯЩУРА ГЕНОТИПА SAT2/VII В ЖИДКОФАЗНОМ БЛОКИРУЮЩЕМ ВАРИАНТЕ ИФА
DIAGNOSTIC TEST-SYSTEM FOR DETECTION OF ANTIBODIES TO STRUCTURAL PROTEINS OF FMD VIRUS GENOTYPE SAT2/VIIIN THE LIQUID-PHASE BLOCKING ELISA
'ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
Federal Centre for Animal Health, Federal Center for Animal Health Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets 2Областное бюджетное учреждение здравоохранения «Ивановский областной наркологический диспансер» Адрес: 153008, Россия, г. Иваново, ул. Постышева, д. 54/1
Regional budgetary healthcare institution "Ivanovo Regional Narcological Dispensary". Address: 153008, Russia, Ivanovo, Postysheva str., 54/1
Луговская Н. Н., кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории профилактики ящура,
e-mail: [email protected]
Lugovskaya N. N., PhD of Biological Sciences, Leading Researcher at the Laboratory of Foot and Mouth Disease
Prevention, e-mail: [email protected] Силантьева E. A., аспирант, ветеринарный врач лаборатории профилактики ящура, e-mail: [email protected] Silantyeva E. A., Post-graduate Student, Veterinarian at the Laboratory of Foot and Mouth Disease Prevention,
e-mail: [email protected] Михалишин Д. В., доктор ветеринарных наук, заведующий лабораторией профилактики ящура,
e-mail: [email protected] Mikhalishin D. V., Doctor of Veterinary Sciences, Head of the Laboratory of Foot and Mouth Disease Prevention,
e-mail: [email protected] Мороз Н. В., кандидат ветеринарных наук, заместитель директора по производству Moroz N. V, PhD of Veterinary Sciences, Deputy Director for Production Малыгин М. П., заведующий отделением, е-mail: [email protected] Malygin M. P., head of the department, e-mail: [email protected] Харитонова А. А., ветеринарный врач лаборатории профилактики ящура, e-mail: [email protected] Kharitonova A. A., Veterinarian at the Laboratory of Foot and Mouth Disease Prevention,
e-mail: [email protected] Гочмурадов Ы. М., аспирант, ветеринарный врач лаборатории профилактики ящура,
e-mail: [email protected] Gochmuradov Y. М., Post-graduate Student, Veterinarian at the Laboratory of Foot and Mouth Disease Prevention,
e-mail: [email protected] Доронин М. И., доктор биологических наук, руководитель сектора биотехнологии лаборатории профилактики
ящура, e-mail: [email protected] Doronin M. I., Doctor of Biological Sciences, Head of the Biotechnology Sector of the Laboratory of Foot and Mouth
Disease Prevention, e-mail: [email protected] Оковытая Т. В., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории профилактики ящура,
e-mail: [email protected] Okovytaya T. V., PhD of Biological Sciences, Senior Researcher at the Laboratory of Foot and Mouth Disease
Prevention, e-mail: [email protected] Борисов А. В., кандидат ветеринарных наук, заместитель заведующего лаборатории профилактики ящура,
e-mail: [email protected] Borisov A. V., PhD of Veterinary Sciences, Deputy Head of the Laboratory for the Prevention of Foot and Mouth
Disease, e-mail: [email protected]
Аннотация. Разработана диагностическая тест-система для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT2/VII на основе жидкофазного блокирующего варианта ИФА. Разработка включала изготовление и оценку качества следующих компонентов реакции: антигена вируса ящура, сенсибилизирующих (улавливающих) и детекторных антител, контрольных образцов сыворотки крови; определение рабочих разведений специфических компонентов с их последующей лиофилизацией. Были проведены испытания и анализ пригодности набора для определения антител к структурным белкам вируса ящура серотипа SAT 2. Данная тест-система позволяла обнаруживать специфические антитела к вирусу ящура серотипа SAT 2 в сыворотке крови вакцинированных или переболевших свиней и крупного рогатого скота. В тестовую панель входили 276 образцов сыворотки крови от иммунизированного моно- или поливалентной противоящурной вакциной (типы А, О, Asia 1 и/или SAT 1, SAT 2, SAT 3) и не вакцинированного против ящура крупного рогатого скота разных возрастных групп; экспериментальные сыворотки крови, отобранные от вакцинированных или зараженных ящуром серотипа SAT 2 свиней и крупного рогатого скота до и после проведения опыта. На основе статистического анализа результатов ИФА определили диагностические характеристики нового набора по данной выборке образцов: чувствительность -96,84 %, специфичность - 97,79 %, точность - 97,46 %. Полученное значение k-критерия 0,944 свидетельствовало о высокой степени согласованности результатов с диагностическим статусом животных.
Summary. A diagnostic test system for the detection of antibodies to structural proteins of the FMDV genotype SAT2/ VII based on a liquid-phase blocking ELISA variant has been developed. The development included the manufacture and quality assessment of the following reaction components: FMDV antigen, sensitizing (catching) and detection antibodies, control samples of blood serum; determination of working dilutions of specific components with their subsequent lyophilization. Tests and analysis of the suitability of the kit for the detection of antibodies to structural proteins offoot-and-mouth disease virus serotype SAT 2 were carried out. This test system made it possible to detect specific antibodies to foot-and-mouth disease virus serotype SAT 2 in the blood serum ofvaccinated or recovered pigs and cattle. The test panel included 276 blood serum samples from immunized with mono- or polyvalent FMD vaccine (types A, O, Asia 1 and/or SAT 1, SAT 2, SAT 3) and not vaccinated against FMD cattle of different age groups; experimental blood sera taken from pigs and cattle vaccinated or infected with FMD serotype SAT 2 before and after the experiment. Based on the statistical analysis of the ELISA results, the diagnostic characteristics of the new set for this set of samples were determined: sensitivity - 96.84 %, specificity - 97.79 %, accuracy - 97.46 %. The obtained k-criterion value of0.944 indicated a high degree of agreement between the results and the diagnostic status of the animals.
Введение
Ящур - острая высококонтагиозная везикулярная болезнь домашних и диких парнокопытных жвачных животных, которая вызывается РНК-содержащим афтовирусом семейства Picornaviridae. Классифицировано 7 следующих серотипов ящура: A, O, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3 и Asia 1. Ящур влечет за собой значительные экономические потери, связанные с негативным влиянием на производство животноводческой продукции, и является препятствием для региональной и международной торговли животными и продуктами животного происхождения. По оценкам WOAH (Всемирная организация здравоохранения животных, основана как OIE), болезнь циркулирует у 77 % мирового поголовья домашнего скота в Африке, на Ближнем Востоке и в Азии, а также на ограниченной территории Южной Америки [6]. В связи с чем существует риск заноса инфекции в страны, свободные от ящура без вакцинации. Борьба с ящуром заключается в проведении своевременных профилактических мероприятий, таких как эффективный эпидемиологический контроль за болезнью; вакцинирование против ящура домашних и сельскохозяйственных животных; надзор за передвижением диких парнокопытных животных в приграничных районах, подверженных
риску проникновения возбудителя из стран, неблагополучных по ящуру; мониторинговые исследования по оценке иммунного статуса сельскохозяйственного и домашнего скота, включая ретроспективную диагностику ящура.
На территории Африканского континента периодически регистрируются вспышки ящура серотипа SAT 2. Для выявления генетических связей между различными изолятами и штаммами обычно применяют нуклеотидное секве-нирование по Сенгеру. Представители вируса ящура серотипа SAT 2 характеризуются высокой генетической изменчивостью и разделяются на 14 топотипов (I - XIV). Такое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных про-тивоящурных вакцин, а также затрудняет штам-моспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении ящура серотипа SAT 2.
В настоящее время эпизоотическая ситуация на Африканском континенте преимущественно связана с представителями возбудителя данного заболевания генотипа SAT2/VII, который распространен в странах Северной Африки, в частности, в Египте, где вспышки отмечали в период с
2012 по 2022 гг., и Ливии (2012 г.). На территории Западной Африки, в частности, в Камеруне (2014 г.), Нигерии (2019-2021 гг.), также преимущественно циркулирует вирус ящура данного генотипа. В указанных странах проводились мероприятия по ликвидации и борьбе с ящуром. При этом появлялись новые представители данного генотипа, которые имели геномные и аминокислотные замены, что приводило к появлению новых свойств. Прогнозы экспертов неутешительны в отношении распространения данного варианта вируса ящура за пределы эндемичных территорий. Вспышки ящура серотипа SAT 2 зарегистрированы в 2023 году в некоторых странах Евразийского континента, в том числе, в Ираке, Иордании, Турции, ранее в Саудовской Аравии (2000 г.) и Палестине (2012 г.) [5].
Учитывая усиление торгово-экономических связей Российской Федерации со странами Африканского континента в последние годы, а также тесное сотрудничество со странами СНГ и Ираном, где не проводится профилактическая вакцинация поголовья скота против ящура серотипа SAT 2, возникает серьезный риск заноса вируса ящура данного серотипа на территорию Российской Федерации. В связи с чем большую актуальность приобретают производство вакцин против ящура серотипа SAT 2, разработка и внедрение диагностических тест-систем для оценки эффективности вакцинации и напряженности иммунитета против ящура серотипа SAT 2 у сельскохозяйственных и домашних парнокопытных животных, а также для обнаружения постинфекционных противоящурных антител в сыворотке крови невакцинированных животных.
Целью данной работы было создание диагностического набора на основе жидкофазного блокирующего варианта иммуноферментного анализа для определения антител к структурным белкам вируса ящура серотипа SAT 2 топотипа VII, оценка его пригодности и возможности применения для выполнения вышеуказанных задач.
Материалы и методы
Для проведения идентификации и филогенетического анализа штаммов вируса ящура серотипа SAT 2 осуществляли секвенирование по Сенгеру. Для исследования делали элюи-рование вирусной РНК, обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) с последующим гель-электрофорезом в 1,0 %-ном агарозном геле. Для анализа необработанных последовательностей использовали редактор выравнивания последовательностей
BioEdit последней версии. Выравнивания, содержащие нуклеотидные последовательности кДНК вируса ящура, были построены с использованием программы Clustal W. Эволюционная история была выведена с использованием критерия максимального правдоподобия, основанного на 3 параметрах классической модели Tamura. Дерево было нарисовано в масштабе, с длиной ветвей, измеренной в количестве замен на сайт. Эволюционный анализ был проведен в MEGA7. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с использованием Clustal X.
Антиген вируса ящура серотипа SAT 2, штамм SAT2/LIB/39/2012, для реакции жидко-фазного блокирующего варианта ИФА (жбИФА) и иммунизации животных получали из инак-тивированной вируссодержащей суспензии клеток ВНК-21. Концентрирование антигена производили путем преципитации вирусного белка 8 %-ным полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ 6000) с добавлением 0,85 % NaCl в течение 18-24 часов при 4 °С. Преципитированный белок осаждали при 6000 об/мин и температуре 4 °С за 30 минут. Осадки ресуспендировали в нужном объеме фосфатно-буферного раствора (ФБР). Затем антигенсодержащий материал подвергали первичной очистке хлороформом и фракционировали за 15 минут при 2000 об/мин. Для последующего выделения 146S-антигена ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (10-50 % сахарозы в ФБР) отбирали верхнюю водную фракцию (преципитат Аг). Фракционированный антиген анализировали спектрофотометрически при длине волны 260 нм и электрофоретически в 12 %-ном полиакриламидном геле при постоянном напряжении 200V, как описано ранее [13, 14]. Белковые образцы денатурировали при 100 °С за 5 минут в присутствии 0,5М трисНО (рН 6,8), 4 % додецил сульфата натрия, 0,2 % бромфенолового синего, 20 % глицерина, 4 % В-меркаптоэтанола. Молекулярный вес белков определяли в соответствии со стандартными маркерными белками 10-250 кДА, (Preciosion Plus Protein Standards, Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда с использованием реагента на основе кумасси G250 и ортофосфорной кислоты, белковых стандартов, содержащих разное количество бычьего сывороточного альбумина, при длине волны 595 нм, как описано ранее [8].
Приготовленный таким образом 146S-антиген использовали для получения гипериммунной сыворотки крови кроликов, морских свинок и сви-
ней, а также в «жидкой фазе» при постановке реакции жбИФА. Антиген вируса ящура серотипа SAT 2 для иммунизации крупного рогатого скота (КРС) концентрировали методом ультрафильтрации. Антиген вводили внутримышечно кроликам, свиньям и КРС в объеме 2 мл, морским свинкам - 1 мл. Иммунизацию животных производили двукратно на 0 и 21-22 сутки, обескровливали - на 28-35 сутки.
Для подбора рабочих разведений компонентов реакции жбИФА, в том числе, улавливающих и детекторных антител, антигена, иммуно-пероксидазного конъюгата вторичных антител кролика к IgG морской свинки, использовали стандартную панель образцов штаммоспецифи-ческой сыворотки крови свиней и КРС, включавшую как гомологичные образцы, так и гете-рологичные, полученные на другие типы вируса ящура, а также нормальную сыворотку крови, отобранную от не вакцинированных против ящура животных.
Постановку реакции жбИФА проводили, как описано ранее [17], с некоторыми модификациями. Вкратце, 96-луночные планшеты для ИФА (F96 Maxisorb NUNC-immuno plate, Thermo scientific, Дания) сенсибилизировали SAT2-специфической сывороткой крови кролика, разведенной в карбонатно-бикарбонат-ном буфере, рН 9,6, в объеме 0,1 мл раствора на лунку, в течение 18 ч при температуре 4 0С либо
1 ч при температуре 37 0С. Перед постановкой основной реакции жбИФА готовили «жидкую фазу»: в лунках круглодонного планшета исследуемые и контрольные образцы сыворотки крови, разведенные 1:16 в трис-буферном растворе (ТБРТ), рН 7,4-7,6, включающем 0,01М трисНС1, 0,8M NaCl, 0,1 % TWEEN20, смешивали с равным объемом рабочего раствора 146S-антигена вируса ящура серотипа SAT
2 в ТБРТ. Конечное разведение сыворотки -1:32. Для образования иммунного комплекса «антиген-антитело» смесь выдерживали 18 ч при температуре 4 0С либо 1 ч при температуре 37 0С. Затем смесь по 50 мкл переносили в лунки предварительно промытого буферным раствором ТБРТ планшета с иммобилизованными улавливающими антителами и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 0С при постоянном перемешивании в термошей-кере. По завершении этапа инкубации и промывки в лунки планшета вносили детекторные антитела (сыворотка крови морской свинки к 146S-антигену вируса ящура типа SAT2), разведенные в ТБРТ, дополненном 1 %-ной блокирующей сывороткой (фетальная сыворотка КРС),
в том же объеме. Далее следовали этапы выявления специфических антител морской свинки с помощью антивидового иммунопероксидаз-ного конъюгата (Dako, Дания) с последующей визуализацией результатов реакции внесением в лунки планшета хромогенного субстрата АБТС (2,2'-азино-ди3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота). Все отдельные этапы реакции жбИФА перед процедурой окрашивания заканчивались трехкратной промывкой лунок планшета раствором ТБРТ. Останавливали процесс окрашивания добавлением в лунки с АБТС 1 %-ного раствора додецил сульфата натрия (SDS). Результаты анализа учитывали инструментальным способом. Оптическую плотность (ОП) продуктов реакции в каждой лунке измеряли при длине волны 415 нм, используя спектрофотометр (ридер) для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ОП контрольных и исследуемых образцов переводили в значение процента ингибиции (PI) по формуле:
где ОПпробы - среднее значение оптической плотности смеси исследуемого или контрольного образца с антигеном вируса ящура; ОПКА -среднее значение оптической плотности контроля антигена; ОПКК - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.
Образцы сыворотки крови, демонстрировавшие значение PI>50 %, считали положительными, а животных, от которых получены данные образцы, иммунными к ящуру. Значение PI<50 % являлось отрицательным, что свидетельствовало об отсутствии специфических антител к вирусу ящура в сыворотке крови обследуемых животных.
Также в работе использовали тест-системы на основе жбИФА для обнаружения антител к структурным белкам вируса ящура серотипов А, О, Asia 1 разных штаммов, разработанных в ФГБУ «ВНИИЗЖ», в соответствии с инструкцией по применению набора для определения антител к структурным белкам вируса ящура в ИФА (табл. 1); наборы для обнаружения антител к вирусу ящура типов А, О или Asia 1 ведущих европейских производителей в соответствии с рекомендациями к набору: PrioCHECK® FMDV, Prionics (Нидерланды/Швейцария); SPCE for antibodies specific to FMDV, IZSLER (Италия) & the Pirbright Institute (Великобритания); ID Screen® FMD Competition, Innovative Diagnostics (Франция).
Таблица 1
Производственные штаммы вируса ящура, использованные в работе
Тип вируса ящура Название штамма вируса ящура Обозначение штамма в статье TonoTHn Генетическая линия
SAT 1 SAT1 96/Ахалкалакский/62 SAT1/Akhal/62 -
SAT 2 SAT2/LIB/39/2012 SAT2/LIB/12 VII Lib-12
SAT2/ERI/98 SAT2/ERI/98 VII -
SAT2/EGY/4/2012 SAT2/EGY/12 VII Ghb-12
SAT2/SAU/7/2000 SAT2/SAU/00 VII -
SAT 3 SAT3 Bech 1/65 SAT3/Bech/65 II -
A А 2155/Забайкальский/13 A/Zab/13 ASIA Sea-97
A 2029/Турция/06 A/TUR/06 ASIA Iran-05
А 2269/ВНИИЗЖ/15 A/ARRIAH/15 ASIA G-VII
O O 2047/Саудовская Аравия/08 O/SAU/08 ME-SA PanAsia2
О 1734/Приморский/2000 O/Prim/00 ME-SA -
О 2212/Приморский/2014 O/Prim/14 SEA Mya-98
О 2356/Пакистан/18 O/PAK/18 ME-SA PanAsia2
О 2311/Забайкальский/2016 O/Zab/16 ME-SA Ind 2001
O 2344/Монголия/2017 O/MOG/17 ME-SA Ind 2001
Asia 1 Азия-1 1946^ати-/Израиль/3/89 Asia1/Shamir/89 ASIA Shamir
Примечание: * - нет данных.
Исследуемым материалом в ИФА служили образцы сыворотки крови свиней и КРС, поступавших в референтную лабораторию диагностики ящура ФГБУ «ВНИИЗЖ» в рамках мониторинговой программы по ящуру; экспериментальные сыворотки крови. В тестовую панель входили 276 образцов сыворотки крови от иммунизированного моно- или поливалентной противо-ящурной вакциной (серотипы А, О, Asia 1) и не вакцинированного против ящура скота разных возрастных групп; экспериментальные сыворотки крови, отобранные от вакцинированных против ящура серотипа SAT 2 или зараженных вирусом ящура серотипа SAT 2 свиней и крупного рогатого скота (КРС) до и после проведения опыта; моноспецифические сыворотки крови свиней и КРС, полученные против антигена вируса ящура разных типов.
Статистический анализ производили с помощью интернет-ресурсов, в том числе MedCalc's Diagnostic test evaluation calculator [16], Kappa Calculator [12].
Результаты и обсуждение
Несмотря на то что ящур серотипа SAT 2 является эндемичной болезнью парнокопытных жвачных животных в африканских странах [7], особенно в дикой природе, существует угроза его более широкого распространения на другие страны. Россия не является исключением, поскольку
имеет тесные торгово-экономические связи с Ираном, Арменией, Азербайджаном, Грузией, Казахстаном, Киргизией, Узбекистаном, Туркменией и Таджикистаном, где поголовье парнокопытных животных не вакцинируется против ящура серотипа SAT 2, а некоторые из перечисленных стран граничат с Турцией и Ираком, где, наряду с Иорданией, в течение 2023 года регистрировались вспышки ящура SAT 2 [5, 7].
В связи с возникшей ситуацией необходимо принимать предупредительные меры, в частности, производство и применение профилактических вакцин против ящура SAT 2 и диагностических средств для оценки гуморального иммунитета. Иммуноферментный анализ (ИФА) в лабораторной диагностике является одним из наиболее удобных инструментов. Мы остановились на жидкофазном блокирующем варианте ИФА (жбИФА), объединяющем в себе достоинства ИФА и реакции вирусной нейтрализации [9], эффективность которого при изучении поствакцинального и постинфекционного противо-ящурного иммунитета была многократно подтверждена [2, 3, 4, 10, 15, 19, 20].
Выбор штамма вируса ящура перед началом работ по созданию диагностической тест-системы для определения антител к структурным белкам вируса ящура серотипа SAT2/VII в ИФА делали по результатам филогенетического анализа (рис. 1).
еП-
iC
100| SAT-2/L1B 39/2012 I SAT-2/EGY/4/2012
-SAT-2/NIG/2/2007
-SAT-2/LIB/7/2003
— SAT-2/SAU/6/2000 ^=]SAT-2/Eritrea/1998
VII
-SAT-2/ETH/2/2007 ]Х1П
-SAT-2/ETH/2/91 ]XIV
-SAT2/KEN/2/84 ] IX
-SAT-2/UGA/19/98 ]Х
-SAT-2/UGA/51/75 ]ХН
-SAT-2/RWO/l/OO □ VIII
-SAT-2/GAM/8/79 ]VI
-SAT2/ANG/4/74 ]Х1
- SAT-2/GHA/2/90 ]V
- SAT-2/2IM/5/81 ]II
-SAT-2/BOT/P3/98 ]III
- SAT-2/ZIM/14/2002 ]I -SAT-2/ETH/1/90
- SAT-2/KEN/19/2017
Рис. 1. Филогения штаммов вируса ящура SAT 2
Рис. 2. Седиментационный профиль антигена вируса ящура штамма SAГ2/LЮ/39/2012 в градиенте плотности сахарозы (разведение 1:10). А260 нм - оптическая плотность при длине волны 260 нм
Рис. 3. Электрофорез в 12%-м ПААГе. Этапы получения антигена вируса ящура штамма SAT2/LIB/39/2012: А, Б - фракционирование антигена при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы; В: 1 - преципитат антигена; 2 - преципитат антигена после переосаждения ультрацентрифугированием за 3 часа, 25000 об/мин, 4 °С; 3 - 146S-антиген; М - маркер Precision Plus Protein (BioRad): 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15, 10 kDa
Рис. 4. Серотипоспецифичность SAГ2-жбИФА, определенная определенная по результатам исследования активности сывороток крови свиней и КРС, отобранных на 21-35 день после заражения ящуром или прививки моно-и поливалентной противоящурной вакциной. Линией обозначен позитивно-негативный порог, Р1 - 50 %; pv - после вакцинации; pi - после заражения
Рис. 5. Специфичность SAT2-жбИФА на примере мониторинговых исследований полевых образцов сыворотки крови КРС, вакцинированного против ящура типов А, О, Asia 1, с использованием наборов разных производителей
Учитывая, что большинство зарегистрированных событий рекомбинации в геноме вируса ящура происходят в генном участке Ш-области, для проведения филогенетического анализа использовали именно этот генный участок (3264.. .3926 п. н.). Полученная дендрограмма основана на сравнении нуклеотидных последовательностей генных областей Ш-гена кДНК размером 663 п. н., который кодирует белок VP1 (221 а. о.). При сравнении четырех штаммов вируса ящура серотипа SAT 2 топотипа VII (SAT2/VII): SAT2/SAU/7/2000, SAT2/LIB/39/2012, SAT2/ EGY/4/2012 и SAT2/ERI/98, было выявлено, что штамм SAT2/ERI/98 отличается от трех других представителей данного генотипа мутациями в нуклеотидной последовательности Ш-гена. Тем не менее в целом, все четыре штамма демонстрировали высокую степень гомологии, что позволило предполагать и их серологическое родство. В результате для разработки иммунофермент-ной тест-системы был выбран штамм SAT2/ LIB/39/2012.
Антиген вируса ящура является основным компонентом реакции. Именно от качества антигена, используемого как для иммунизации лабораторных животных, так и для постановки жбИФА, зависит чувствительность и специфичность тест-системы. Антиген вируса ящура штамма SAT2/LIB/39/2012, получали из инакти-вированной вируссодержащей суспензии культуры клеток ВНК-21. Каждый этап концентрирования и выделения антигена контролировали в ходе электрофоретического разделения белковых молекул в полиакриамидном геле (рис. 3). Выделение 146S-антигена осуществляли из преципитата
антигена ультрацентрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % сахарозы в ФБР) за 3 часа при 25000 об/мин.
Основная масса антигенного белка, представлявшая собой 146S-субъединицы, концентрировалась на разделе 30 %-ного и 40 %-ного слоев сахарозы в виде опалесцирующего кольца. Антиген фракционировали с помощью перистальтического насоса. Каждую фракцию сахарозы анализировали фотометрически, измеряя оптическую плотность в разведении 1:10 при длине волны 260 нм. На основании полученных данных строили седиментационный профиль антигена SAT2/LIB/39/2012 в градиенте плотности сахарозы (рис. 2).
В каждой фракции градиента оценивали накопление 146S-антигена и наличие балластных белков при проведении электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 3А, 3Б). Для 146S-антигена отбирали фракции с наибольшей концентрацией структурных белков УР1, УР2, УР3 (23-28 кДа) и наименьшим количеством примесей (фракции 5-11). Концентрация белка в пуле фракций 5-11 составила примерно 0,4 мг/мл. Как видно из рис. 3В, 146S-антиген имел высокую степень очистки.
При подборе рабочих разведений специфических компонентов реакции SAT2-жбИФА использовали проверочную панель, включающую гомологичные образцы сыворотки крови свиней и КРС, вакцинированных против ящура штамма SAT2/LIB/39/2012, а также нормальную сыворотку крови КРС и гетерологичные образцы сыворотки крови КРС, отобранные после иммуни-
Таблица 2
Определение рабочего разведения антигена вируса ящура SAT 2 для реакции SAT2-жбИФА с помощью проверочной панели образцов сыворотки крови
Проверочная панель Ркред. в SAT2-жбИФА при концентрации специфического антигена в рабочем растворе
0,4 мкг/мл 0,2 мкг/мл 0,1 мкг/мл
S^, 0 dpv* SAT2/LIB/39/2012 14,3 32,2 35,3
S^, 14 dpv SAT2/LIB/39/2012 80,4 85,4 89,8
S^, 22 dpv SAT2/LIB/39/2012 93,0 93,7 95,4
S^, 35 dpv SAT2/LIB/39/2012 95,2 94,8 95,8
S свин, 16 dpv SAT2/LIB/39/2012 70,6 74,5 74,7
S свин, 21 dpv SAT2/LIB/39/2012 81,6 83,9 80,3
S^, 30 dpv A/Zab/13 0,3 34,3 48,0
S^, 30 dpv 0/Prim/00 36,9 61,9 72,0
S^, 30 dpv Asia1/Shamir/89 29,2 56,4 63,5
Sкрс нормальная 11,4 24,9 42,8
Примечание: dpv* - дни после вакцинации.
Таблица 3
Расчет позитивно-негативного порога тест-системы SAT2-жбИФА
Процент ингибиции Позитивно-негативный порог, PI
PIсред. (n=132) 17,78%
о 14,32%
PIсред.+о 32,1%
PIсред.+2о 46,42%
PIсред.+3о 60,74%
зации антигеном вируса ящура других серотипов (табл. 2).
Гипериммунную сыворотку крови кроликов и морских свинок, использованную в реакции в качестве улавливающих и детекторных антител, разводили в буферном растворе в 1000 и 3000 раз, соответственно. Как видно из анализа табл. 2, при уменьшении концентрации антигена в растворе от 0,4 до 0,1 мкг/мл значения PI, подсчитанные для гомологичных образцов, практически не изменялись. В то время как для отрицательных, не содержащих специфических антител к вирусу ящура серотипа SAT 2, образцов нормальной и гетерологичной сыворотки наблюдали увеличение значений PI с разведением антигена. В итоге была выбрана оптимальная концентрация антигена вируса ящура серотипа SAT 2 0,4 мкг/мл, которая обеспечивала высокую чувствительность и типо-
специфичность диагностической тест-системы SAT2-жбИФА.
Для более точной качественной интерпретации результатов необходимо было подтвердить пороговое значение PI, ранее определенное для жбИФА в 50 % при конечном разведении исследуемых образцов сыворотки 1:32 [17]. Для этой цели в реакции SATZ-жбИФА тестировали в двух повторностях 132 образца нормальной сыворотки крови свиней и КРС, находили среднее значение PI и стандартное отклонение, определившие пороговый диапазон (табл. 3).
Как видно из табл. 3, сумма PIсред. и удвоенного стандартного отклонения (о), соответствовавшая значению cut-off, была близка к порогу в 50 %, что обеспечивалось точностью выбранной концентрации специфических компонентов реакции. Условно, с учетом стандартного отклонения, обозначили сомнительную зону, нижний
Таблица 4
Результаты исследования в реакции жидкофазного блокирующего варианта ИФА сыворотки крови КРС и свиней, инфицированных вирусом ящура штамма SAT2/ERI/98 или вакцинированных против ящура штамма SAT2/LIB/39/2012
Образцы сыворотки SAT2-жбИФА
PI,% Tитр АТ
SКРС 1, 21 dpi* SAT2/ERI/98 97,1 1:362
SКРС 2, 21 dpi SAT2/ERI/98 97,6 1:362
SКРС 3, 28 dpi SAT2/ERI/98 95,9 1:181
SКРС 4, 28 dpi SAT2/ERI/98 96,4 1:362
SКРС пул, 31 dpi SAT2/ERI/98 96,5 1:362
Sсвин, пул, 24 dpi SAT2/ERI/98 76,2 1:45
S№Q 0 dpv SAT2/LIB/39/2012 23,3 н/и***
S№Q 14 dpv** SAT2/LIB/39/2012 76,5 н/и
S№Q 22 dpv SAT2/LIB/39/2012 92,2 н/и
SКРС 35 dpv SAT2/LIB/39/2012 93,3 н/и
Sсвин, 0 dpv SAT2/LIB/39/2012 (n=5) 5,15±1,39 н/и
Sсвин, 16 dpv SAT2/LIB/39/2012 (n=5) 68,01±15,76 н/и
Sсвин, 21 dpv SAT2/LIB/39/2012 (n=5) 78,67±6,54 н/и
Sсвин, 28 dpv SAT2/LIB/39/2012 (n=5) 88,95±1,39 н/и
Примечание: dpi* - дни после заражения; dpv** - дни после вакцинации; н/и*** - не исследовали; жирным шрифтом выделены положительные значения PI или титра антител (AT).
Таблица 5
Матрица для подсчета диагностических характеристик тест-системы SAT2-жбИФА
Статус животных SAT2-жбИФА Всего
положительные отрицательные
Вакцинированные против ящура серотипа SAT 2 или переболевшие 92 3 95
Не вакцинированные или вакцинированные против других типов ящура 4 177 181
Всего 96 180 276
Таблица 6
Диагностические характеристики тест-системы SAT2-жбИФА
Статистические показатели Значение 95 % доверительный интервал
Чувствительность 96,84 % 91,05 % - 99,34 %
Специфичность 97,79 % 97,44 % - 99,39 %
Точность 97,46 % 94,84 % - 98,97 %
k-критерий 0,944 н/о*
Примечание: н/о* - не определяется.
предел которой был равен 40 %, а верхний - 60 % (50 %±10 %).
Разработанную тест-систему испытывали при изучении поствакцинального и постинфекционного иммунитета у свиней и КРС. Результаты исследований представлены в табл. 4 и на рис. 4, 5.
В табл. 4 отражен отражен уровень постинфекционного иммунитета на 21-31 день после заражения КРС и свиней вирусом ящура штамма SAT2/ERI/98 и показана динамика формирования поствакцинального иммунитета к ящуру штамма SAT2/LIB/39/2012 у КРС и свиней. Крупный рогатый скот демонстрировал более сильную иммунную реакцию на инфицирование вирусом, чем свиньи, что вероятно объясняется большей восприимчивостью КРС к данному штамму вируса ящура. Двукратное введение эмульсионной моновалентной вакцины против ящура штамма SAT2/LIB/39/2012 создавало высокий уровень защиты как у КРС, так и у свиней.
Разработанная диагностическая тест-система для выявления антител к структурным белкам вируса ящура серотипа SAT 2 обладала выраженной серотипоспецифичностью. При исследовании сывороток крови свиней и КРС, отобранных на 21-35 день после заражения ящуром или прививки моно- и поливалентной противоящурной вакциной для разных типов ящура только образцы, содержащие специфические антитела к разным штаммам вируса ящура серотипа SAT 2 генотипа SAT2/VII имели положительные значения PI (рис. 4). Тест-система демонстрировала специфичность при монито-
ринговых исследованиях иммунизированного трехвалентной вакциной против ящура типов А, О, Asia 1 поголовья, напряженность иммунитета подтверждалась результатами параллельного исследования данных образцов сыворотки крови с использованием диагностических наборов на ящур серотипов А, О, Asia 1 других производителей (рис. 5).
Пригодность диагностической тест-системы для определения в жбИФА антител к структурным белкам вируса ящура серотипа SAT 2 анализировали, рассчитывая в соответствии с матрицей табл. 5, следующие основные диагностические показатели: чувствительность, или долю истинно положительных результатов при исследовании в жбИФА образцов сыворотки крови, полученных от животных с известным положительным статусом; специфичность, или долю истинно отрицательных результатов при исследовании в жбИФА образцов сыворотки крови, полученных от животных с известным отрицательным статусом; точность, или долю подтвержденных результатов среди общего количества проб с известным статусом; k-критерий - согласованность результатов теста с диагностическим статусом [1, 4, 11, 18, 21].
При анализе результатов, полученных при исследовании образцов сыворотки крови животных в реакции SAT2-жбИФА, был установлен уровень k-критерия - 0,944, что свидетельствовало о высокой степени согласованности результатов исследований с диагностическим статусом
образцов и подтверждало достоверность результатов анализа (табл. 6).
Заключение
Таким образом, в ходе испытаний была изучена пригодность и эффективность диагностической тест-системы для определения антител к структурным белкам вируса ящура генотипа SAT2/VII в ИФА. При анализе данных, полученных по результатам исследований, определены диагностические характеристики тест-системы: чувствительность -96,84 %; специфичность - 97,79 %; точность -97,46 %; k-критерий - 97,46%. Соответствующий набор на основе жидкофазного блокирующего варианта ИФА может стать ценным инструментом в рутинной лабораторной практике при контроле иммуногенности вакцины против ящура генотипа SAT2/VII, при оценке напряженности поствакцинального иммунитета у сельскохозяйственных животных и установлении их иммунного статуса в отношении ящура, при обследовании невак-цинированного поголовья, а также при выявлении вирусоносительства у крупного рогатого скота в комплексе с исследованиями на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.
Список литературы
1. Караулов А. К. Использование принципов аналитической эпизоотологии в ветеринарной практике / А. К. Караулов, С. А. Дудников, К. П. Николаева, В. М. Гу-ленкин //Труды федерального центра охраны здоровья животных, т. VI. Владимир, 2008. C. 73-84.
2. Кременчугская С. Р. Изучение гуморального иммунитета у животных, иммунизированных эмульсионными противоящурными вакцинами / С. Р. Кременчугская, Н. Н. Луговская, Т. К. Майорова, А. С. Шарыпов // Ветеринария сегодня, 2017. Т. 1. С. 55-57.
3. Кременчугская С. Р. Оценка эффективности про-тивоящурной вакцинации животных в буферной зоне Российской Федерации в 2014 г. / С. Р. Кременчугская, Н. Н. Луговская, С. Н. Фомина // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. М., 2015. Т. 13. С. 20-28.
4. Луговская Н. Н. Валидация методики определения уровня противоящурных антител в реакции жид-кофазного блокирующего «сэндвич»-варианта иммуно-ферментного анализа / Н. Н. Луговская, Е.Н. Калинина, К.С. Малкова [и др.] // Ветеринария сегодня, 2015. Т. 3. С. 22-29.
5. Россельхознадзор обеспокоен распространением экзотического для Евразийского континента сероти-па ящура на Ближнем Востоке и в Западной Азии. 16 марта 2023. Россельхознадзор. Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. // https:// fsvps.gov.ru/ru/fsvps/news/217101.html (Дата обращения: 12.05.2023).
6. Стандарты МЭБ. Руководство по наземным животным. Руководство по диагностическим тестам и
вакцинам для наземных животных. Часть третья. Болезни, входящие в список МЭБ, и другие болезни, имеющие важность для международной торговли. // https:// rr-europe.woah.org/ (Дата обращения: 11.05.2023).
7. Abdel-Aziz A. I. Seroprevalence and molecular characterization of foot-and-mouth disease virus in Chad / A. I. Abdel-Aziz, A. Romey, A. Relmy, K. Gorna et al. // Vet Med Sci. 2020. Vol. 6. P. 114-121.
8. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Analyt. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.
9. Hamblin C. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA / C. Hamblin, I. T. Barnett, R. S. Hedger // J Immunol Methods. 1986. Vol. 93, N. 1. P. 115-121.
10. Hamblin C. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. III. Evaluation of antibodies after infection and vaccination / C. Hamblin, R. P. Kitching,
A. I. Donaldson, J. R. Crowther, I. T. Barnett // Epidemiol Infect.1987. Vol. 99, N. 3. P. 733-744.
11. Jacobson R. H. Validation of serological assays for diagnosis of infectious diseases / R. H. Jacobson //Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz. 1998. Vol. 17, N. 2/ P. 469-486.
12. Kappa Calculator. // https://www.easycalculation. com/statistics/cohens-kappa-index.php (Дата обращения: 14.05.2023).
13. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. 1970.Vol. 227. P. 680-685.
14. Lugovskaya N. N. Detection of antibodies to avian infectious virus by a recombinant nucleocapsid protein-based enzyme-linked immunosorbent assay / N. N. Lugovskaya, A. V. Scherbakov, A. S. Yakovleva et al. // J. Virol. Methods. 2006. Vol. 135, N. 2. P. 292-296.
15. Maradei E. Updating of the correlation between lpELISA titers and protection from virus challenge for the assessment of the potency of polyvalent aphtovirus vaccines in Argentina / E. Maradei, J. La Torre, B. Robiolo, J. Esteves et al. // Vaccine. 2008. Vol. 26. P. 6577-6586.
16. MedCalc's Diagnostic test evaluation calculator. // https://www.medcalc.org/calc/diagnostic_test.php (Дата обращения: 13.06.2023).
17. OIE Terrestrial Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Chapter 3.1.8. // Foot and mouth disease. 2022. P. 1-34.
18. OIE. Terrestrial Manual. Chapter 1.1.5. // Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases. 2022.
19. Periolo O. Largescale use of liquid-phase blocking sandwich ELISA for the evaluation of protective immunity against aphtovirus in cattle vaccinated with oil adjuvanted vaccines in Argentina / O. Periolo, C. Seki, P. Grigera,
B. Robiolo et al. // Vaccine. 1993. Vol. 11. P. 754-776.
20. Robiolo B. Confidence in indirect assessment of foot-and-mouth disease vaccine potency and vaccine matching carried out by liquid phase ELISA and virus neutralization tests / B. Robiolo, J. La Torre, E. Maradei,
C. Perez Beascoechea et al. // Vaccine. 2010. Vol. 28. P. 6235-6241.
21. Vallat V. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories Infectious Diseases / V. Vallat. 2nd ed. 2008. 67 p.
