CC BY
243. Saint J., Tsuchitani T., Zighubolm J., Bonavida В Ultra-low doses I. Ed. C. Doutrempuich Univ. Bordeaux, France, Tavior and France. London, Washington, D.C., 1991, p. 27—43.
44. Коновалова H.П., Франчи Ф., Дьячковская Р Ф., Волкова Л.Н. Изв. РАН. Сер. биол., 1998,
45. Blumenfeld L.A., Grosberg A.Ju., Tikhonov A.N. J. Chem. Phys , 1991, v. 95, № 10, p. 7541-7544.
46 Лелекова ТВ., Романовский П.Я., Александров П.H., Ашмарин И.П. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1989, т. 108, № 7, с. 8-10.
47. Zaiuev S. V., Sazanov L.A. J. Chem. and Biochem. Kin., 1991, v. I, № 3, p. 21-26.
48. Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А.. Худяков И.В Изв. РАН. Сер. биол., 1990, № 2. с. 184-193.
49. БлюменфельдЛ.А. Биофизика, 1993, № 1. с. 129—132.
50. Sergeeva M.G., Yonchar M.V., Chistyakov V. V., Merkli A T. Appl. Biochem. and Biotech., 1996, v. 61, p. 167—171.
51Пальмина Н.П., Мальцева Е.Л., Бурлакова ЕБ. Хим. физика, 1995, т. 14, № 11, с. 47-60.
52. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. Биол. мембраны, 1998, т. 15, № 2, с. 199-212.
53. Lo S.Y. Proceedings of the 1-st International Symposium. Ed. L.I. Brady, World Scientific Publishing Co., PTC Ltd., 1998, p. 3-47.
УДК 576.345 + 576.809.7
Действие некоторых цитотоксинов в сверхмалых концентрациях
на клеточное звено иммунитета
Т. И. Новожилова, С. И. Малекин, В. К. Курочкин, С. Бугхлала, М. В. Киселевский
ТАТЬЯНА ИВАНОВНА НОВОЖИЛОВА — кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биорегуляторов Государственного научно-исследовательского института органической химии и технологии (ГУП ГосНИИОХТ). Область научных интересов: токсины растительного, животного и микробного происхождения, механизмы их действия.
СЕРГЕЙ ИВАНОВИЧ МАЛЕКИН — доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией биорегуляторов ГУП ГосНИИОХТ. Область научных интересов: биоорганическая химия, соотношение структура-активность природных и синтетических биологически активных соединений.
111024 Москва, шоссе Энтузиастов, 23, ГУП ГосНИИОХТ, тел. (095) 273-87-03, факс (095) 273-27-70.
САМИРА БУГХЛАЛА — аспирант лаборатории клеточного иммунитета Онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина (ОНЦ) РАМН. Область научных интересов: иммуномодулирующее действие природных биологически активных веществ.
МИХАИЛ ВАЛЕНТИНОВИЧ КИСЕЛЕВСКИЙ — доктор медицинских наук, заведующий лабораторией клеточного иммунитета ОНЦ РАМН. Область научных интересов: биотерапия рака, механизм цитотокси-ческого действия эффекторов противоопухолевого иммунитета.
115478 Москва, Каширское шоссе, 24, ОНЦ РАМН, тел. (095) 324-27-94.
В работах последних лет по стратегии лечения рака выделяются две проблемы — регуляция иммунного статуса организма и химиотерапевтическое воздействие, приводящее к гибели опухолевых клеток. Развитие второго направления привело к созданию нового поколения препаратов, действие которых основано на принципе адресной доставки цитотоксических агентов к клетке-мишени. В настоящее время синтезировано значительное количество препаратов (иммунотокси-нов), в которых в качестве эффекторной части молекулы выступают рибосоминактивирующие белки или их субъединицы (рицин, абрин, дифтерийный токсин, шигатоксин и др.) [1—5]. Следует отметить, что при создании иммунотоксинов наиболее часто используется рицин или его субъединица А, что связано в основном с большей доступностью этого токсина для исследований. Сообщается о доклинических испыта-
ниях иммунотоксинов с А-цепью рицина при лечении лейкемии и лимфомы [6], множественной мие-ломы [7] и др.
Вместе с тем существенной проблемой в клиническом использовании иммунотоксинов была и остается избирательность транспорта цитотоксического агента к клетке-мишени. Поиск новых переносчиков цитотоксинов, высокоспецифично взаимодействующих с клеткой-мишенью, среди моноклональных антител, молекулярных, генетических или метаболических маркеров опухолевых клеток, вирусоподобных структур [8] и т.д. приводит во многих случаях к созданию чрезвычайно дорогостоящих лекарств.
Наряду с химиотерапией получает развитие новое направление противоопухолевой терапии — биотерапия. Это метод лечения рака путем активизации естественных защитных механизмов, в которых централь-
ную роль играют иммунокомпетентные клетки — лимфоциты, естественные киллеры, макрофаги. Имеются также сведения о способности тромбоцитов периферической крови осуществлять противоопухолевое ци-тотоксическое действие [9]. Иммунный ответ, приводящий к элиминации опухолевых клеток из организма, обусловлен образованием цитотоксических клеток. При стимуляции иммунокомпетентных клеток секре-тируется множество биологически активных факторов, в том числе цитокинов, имеющих значение для процессов пролиферации, дифференциации и запуска эф-фекторных механизмов.
Основную роль в развитии клеточного иммунного ответа играет белок интерлейкин-2 (ИЛ-2). Он активирует цитотоксические Т-клетки и обеспечивает пролиферацию любых Т-клеток при условии экспрессии на их поверхности рецептора к ИЛ-2. В связи с этим применение ИЛ-2 для иммунотерапии раковых больных получило широкое распространение [10]. Большинство клинических испытаний, нацеленных на запуск специфического Т-клеточного ответа, основано на системном введении иммуномодулирующих цитокинов, таких как ИЛ-2. Однако системное введение цитокинов игнорирует паракринную природу их действия. Экспериментальные исследования дают основание считать, что главной причиной недостаточно высокой эффективности ИЛ-2-терапии является высокий уровень у онкологических больных Т-супрес-соров, которые также подвержены активации под воздействием ИЛ-2, что приводит в конечном счете к выраженной иммунодепрессии.
Вышесказанное привело нас к заключению обратиться к поиску веществ, избирательно стимулирующих Т-клетки-киллеры, желательно без вовлечения рецепторов к ИЛ-2. Определенный подход к решению данной задачи был выявлен на основании проведенного нами анализа литературы последних лет, посвященной взаимодействию в системе опухоль—иммунитет и ответным реакциям клеточных систем на воздействие малых и сверхмалых доз биологически активных веществ [И]. Так, например, при исследовании противоопухолевой активности антибиотика рубомицина в различных дозах — от терапевтической 2 мг/кг до 2- 10~6 мг/кг — относительно прививаемости и роста карциномы Льюис было установлено, что в терапевтической дозе рубомицин вызывает обычный цитотоксический эффект, в то время как в дозах 2 • Ю-2—2 • 10~6 мг/кг препарат оказывал стимулирующее действие на прививаемые опухоли, т.е. снижался критический трансплантационный минимум. Результаты исследования рубомицина, а также ряда других веществ, активных по отношению к раковым клеткам (нитрозометилмочевина [12], адрибластин, цисплатина в концентрациях до Ю-15 М), побудило нас начать изучение дозозависимого действия некоторых рибосоминактивирующих цитотоксинов, в частности рицина, абрина, микотоксина Т-2, на процессы активации мононуклеарных клеток.
Цитотоксическое действие токсинов. Для определения концентраций цитотоксинов, вызывающих гибель клеток, в суспензию опухолевых клеток К562 вводили цитотоксины в разных концентрациях и измеряли количество оставшихся живых клеток по методу Мос-мана с использованием водорастворимого бромида 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-ди фенил тетразолия. Зависимость степени гибели опухолевых клеток от концентрации цитотоксинов приведена на рис. 1.
л н о о X гг к
о ^
о ь
е
я ЕГ
н о о X
Э"
X о Ы О н о е-
9 10 11 12 13 14 15 16 -^[рицин] (М)
60
50
40
30
20
10
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
-^[абрин] (М)
Г"---- в
48 чЧ
ч
24 ч
5 6 7 8 9 10 -1в [микотоксин] (М)
Рис.1. Концентрационная зависимость цитотоксичности рицина (а ), абрина (б ) и микотоксина Т-2 (в ) по отношению к клеткам К562.
На кривых указано время инкубации 3 • 104 клеток
контроль 9 10 11 12 13 14
-lg [токсин] (М)
контроль 10 11 12 13 14
-lg [токсин] {М)
Рис.2. Концентрационная зависимость щгготоксичности моно-нуклеарных клеток (МНК), активированных рицином, 10~~13— 10"17 М(а), абрином, Ю-9—Ю-14 M(fi) и микотоксином, Ю-10—Ю-14 М \в ), по отношению к клеткам К562
Рицин является наиболее токсичным белком. Его эффективная доза (концентрация) ЕО50(24ч) = 4,32 • Ю-8 (6,6 • Ю-8 + 2,9 • 10~8) М, что согласуется с литературными данными [13]. Для абрина и микотоксина Т-2 ЕО50<48ч> = 4,14 • Ю-7 М(5,9 • Ю-8 - 2,2 • КГ6) М, ЕЭ^724' = 4,1 • 10~4 М (9,4 • Ю-5 -г 4,1 • Ю-3) М. Увеличение времени инкубации цитотоксинов с опухолевыми клетками приводит к росту их токсичности, что обусловлено механизмом действия данных белков.
Таким образом, можно полагать, что исследованные токсины практически не вызывают цитотоксиче-ского действия в концентрации: 10~13 М для рицина и абрина, Ю-9 М для микотоксина Т-2.
Активация мононуклеаров цитотоксинами. Моно-нуклеарные клетки инкубировали с исследуемыми токсинами (рицин, абрин, микотоксин Т-2), которые добавляли в заведомо нецитотоксических дозах, затем активированные таким образом мононуклеары инкубировали с опухолевыми клетками К562 и по методу Мосмана измеряли количество живых клеток. В качестве контроля использовались неактивированные мо-нонуклеарные клетки.
Результаты исследований (рис. 2) показали, что цито-токсичносгь мононуклеаров повышается в большей степени при инкубации их с рицином, ЕОэд которого равна 9,3-10"16 (8,98-КГ16 -=-1,01 -10"15) М. Для микотоксина Т-2 эффективная доза составляет ЕО50 = 6,9 • 10~9 (4,58 • Ю-10 -н 7,9 • 10~9) М. Менее выраженный эффект наблюдался при стимулировании мононуклеарных клеток абрином. Их цитотоксичность повышалась не более чем на 20% по сравнению с контролем при инкубации с абрином в концентрации 10~9 М.
Для выявления возможных механизмов стимулирующего действия цитотоксинов на мононуклеарные клетки, приводящих к увеличению цитотоксичности последних, инкубированные клетки центрифугировали, а супернатанты исследовали методом электрофореза (в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия).
Рис.3. Влияние рицина в сверхмалых концентрациях на секрецию интерлейкина 1-альфа (ИЛ-1а), интерлейкина 1-бета (ИЛ-1в), интерлейкина-2 (ИЛ-2) и фактора некроза опухоли (TNF)
Таблица
Цитотоксичность мононуклеарных клеток (МНК), активированных рицином и другими факторами по отношению к опухолевым клеткам К562.
18-часовой тест, [МНК] : [мишень] = 25 : 1.
Контроль—нативные МНК, доля погибших клеток К562 30%
Активирующий фактор Исследуемая концентрация, М Цитотоксичность МНК, %
Рицин ю-13 65
10-14 63
10-'s 67
Са2+-ионофор А-23187 10-8 58
ФГА 10-8 62
Кон А Ю-8 57
Достоверность по сравнению с контролем соответствует Р< 0,005.
В качестве контроля использовали супернатанты после инкубации мононуклеаров с белками фитоге-магглютинином (ФГА), конканавалином А (КонА) и Са2+-ионофором (А-23187), традиционно применяемыми для активации лимфоцитов. И в этом случае более выраженный эффект был получен при инкубации с рицином (появление на электрофореграм-мах полос, соответствующих по молекулярной массе интерлейкину (12—30 кДа) и фактору некроза опухоли (TNF).
Для количественной оценки воздействия сверхмалых доз рицина на индукцию секреции цитокинов мононукле-арные клетки инкубировали с рицином в концентрациях 1СГ13 -ИСТ19 М. Уровень цитокинов в супернатантах измеряли методом ELISA В качестве контроля исследовались нативные (неинкубированные) мононуклеары. Результаты этого исследования представлены на рис.3.
Как видно на рис. 3, инкубация с рицином в концентрации Ю-15 ■¥ Ю-16 М приводит к заметному увеличению секреции всех тестируемых цитокинов, что вызывает активизацию механизмов дифференцировки и пролиферации мононуклеарных клеток. В этих условиях эффект рицина подобен действию классических стимуляторов лимфоцитов (см. таблицу).
Из представленных в таблице данных следует, что цитотоксичность мононуклеаров, стимулированных рицином в концентрациях Ю-13 + Ю-15 М, несколько выше цитотоксичности этих клеток, стимулированных ФГА, Кон А и Са2+-ионофором при том, что они используются в концентрациях на 5—7 порядков выше, чем рицин.
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать вывод, что снижение доз исследованных цитотоксинов на 2 (абрин), 4 (микотоксин
- Т-2) и 8 (рицин) порядков приводит к появлению у этих цитотоксинов иммуномодулирующего действия на мононуклеарные клетки и повышению цитотоксичности за счет секретирования цитокинов.
Выявленные эффекты дают основание полагать, что дальнейшее развитие представленных исследований может оказаться перспективным в поиске лекарственных веществ, которые способны давать терапевтический эффект без существенного общего токсического действия.
ЛИТЕРАТУРА
1. Stirpe Е, Barbieri L., Batteli М. е. a. Bio technology, 1992, v. 10, № 4, p. 405-412.
2. Theuer Ch.P., Pastan I. Amer. J. Surg., 1993, v. 166, № 3, p. 284-288.
3. Sweeney E.B., Murphy J.R. Assays Biochem., 1995, v. 30, p. 119-131.
4. Sandvig K, Van Deurs B. Physiol. Revs., 1996, v. 76, № 4, p. 949-966.
5. Kieitman R.J., Pastan I. Adv. Drug. Delivery Rev., 1998, v. 31, № 1-2, p. 53-88.
6. Engert A., Sausville E.A., Vitetta E. Curr. Top. Microbiol, and Immunol., 1998, v. 234, p. 13-33.
7. O'Tool J.E., Esseltine D., Lynch T.J. e. a. Ibid., 1998, v. 234, p. 35-56.
8. Pietersz G.A., Roland M.J., Smyth J.F. Adv. Immunol., 1994, v. 56, p. 301-386.
9. Abel M„ Kay N.E., Jacob G. Blood, 1985, v. 65, p. 1252.
10. Dillman R.O. Cancer Biother., 1994, v. 9, № 3, p. 183-209.
11. Тез. 2-го Межд. симп. «Механизмы действия сверхмалых доз», Москва, 1995.
12. Фомина М.М., Островская Л.А., Корман Д.Б., Бурлако-ва Е.Б. Изв. АН, Сер. биол., 1995, № 4, с. 430-434.
13. Lin J.-Y., Chang Y.-Ch., Huang L.-K., Tung T.-Ch. Toxicon, 1973, v. 11, № 4, p. 379-381.
