CC BY
127
1
БИОТЕРАПИЯ 21
>- УДК 582.28:616-006-092.9:576.385.5 N. I. Ryzhova1, V. P. Deryagina1, A. N. Razin2, L. S. Truchanova1, I. A. Philipova2, O. A. Bocharova1 THE EFFECT OF FUNGI LENTINUS EDODES ON GROWTH OF MICE TUMORS ON MODEL CHEMICAL CARCINOGENESIS 1N. N. Blokhin Russian Research Center RAMS, Moscow 2Shiitake Ltd., St. Petersburg ABSTRACT Preventive effect of water suspension of fungi (WSF) Lentinus edodes on growth of the tumours induced by 1,2-Dimethylhydrazine (DMG) was investigated in mice F1 (C57BlxCBA). Combination of DMG and WSF increased the toxic action of DMG. Administration of WSF in doses 18 and 188 mg|kg for 27 weeks has not affected on induction and multiplicity index of tumours in mice-hybrids. Administration the maximal doze - 376 mg|kg resulted in the tendency of decreasing of animals with tumours and multiplicity index. Decrease of these parameters, mainly, was due to reduction number of benign tumours. Key words: Lentinus edodes fungi, mice F1 (C57 BlxCBA), 1,2- Dimethylhydrazine, induced carcinogenesis. H. И. Рыжова1, В. П. Дерягина1, А. Н. Разин2, Л. С. Труханова1, И. А. Филиппова2, О. А. Бочарова1 ДЕЙСТВИЕ LENTINUS EDODES (ШИИТАКЕ) НА РОСТ ОПУХОЛЕЙ У МЫШЕЙ НА МОДЕЛИ ХИМИЧЕСКОГО КАНЦЕРОГЕНЕЗА 1ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН, Москва 22ООО «Шиитаке», Санкт-Петербург РЕЗЮМЕ В экспериментах на 102 мышах-самках F1 (C57BlxCBA) изучено профилактическое влияние водной суспензии грибов Lentinus edodes (ВСГ) на рост опухолей, индуцированных несимметричным 1,2-диметилгидразином (ДМГ). Показано усиление токсического действия ДМГ при сочетанном введении его с ВСГ. Введение ВСГ в дозах 18 и 188 мг/кг не повлияло на индукцию и множественность опухолей у мышей-гибридов. При максимальной дозе ВСГ- 376 мг/кг отмечалась тенденция к снижению числа животных с опухолями и коэффициента множественности. Эти показатели снизились за счет уменьшения числа доброкачественных опухолей. Ключевые слова: грибы Lentinus edodes (Шиитаке), мыши F1 (C57BlxCBA), 1,2- диметилгидразин, индуцированный канцерогенез. шую часть массы гриба составляют полисахариды ВВЕДЕНИЕ (38-59 %), которые в основном представлены полиК настоящему времени накопилось мн°г° сообще- аминосахарами и полиглюканами. Как показали рений о том, что ряд соединший, входящих в состав не- зультаты многочисленных исследований, биорегули-которых грибов, обёадают иммуномодулирующим рующие эффекты гриба Lentinus edodes относят преж-д^ствтем акгивируют звено неспецифической про- де всего к действию полиглюкана лентинана. тивоопухолевой защиты и повышают продукцию ин- в экспериментах на мышах и крысах показано, что терферона в крови [16]. лентинан, выделенный из грибов Lentinus edodes, до- Японский гриб Lentinus edodes (Шиитаке) отно- стоверно ингибировал рост Саркомы-180. Привнутри-сится к выс0им базидиомицетам. В его составе обна- венном или внутрибрюшинном введении его крысам ружены полисахариды, простые сахара, аминокисдо- отмечали уменьшение числа метастатических узлов ты, липиды, алкалоиды, фшолы, витамины группы В, в легких [4; 6]. Пероральное введение лентинана вы-С, эргостероды, минеральные вещества и др. Бодь- зывало значимую регрессию клеток лимфомы (К-36) ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1
1 1
22 БИОТЕРАПИЯ
к у мышей ЛКЯ [13]. Экстракт, полученный из грибов Ьепйпш еёоёеБ, увеличивал продолжительность жиз- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ни мышей с перевитыми опухолями [7]. В наших ис- В работе использовали высушенные измельчен-следованиях профилактическое пероральное введение ные плодовые тела грибов Шиитаке (Фунго-Ши) в ви-водной суспензии грибов в дозах 188 и 376 мг/кг до- де порошка (ТУ - 9164-001-03682201-2002). На осно-стоверно замедляло (до 53 %) рост подкожно переви- ве этого сырья производится БАД «Шии-Таке» той аденокарциномы Эрлиха (АКЭ) у линейных (ТУ 9164-001-71260555-03), в котором общее количес-мышей и мышей-гибридов [1]. На фоне лечения цис- тво полисахаридов составляет 24 %, из них полиглю-диаминодихлороплатиной лентинан повышал чув- кана лентинана содержится не менее 4,5 %. ствительность клеток опухоли толстой кишки мышей Порошок грибов (ПГ) растворяли в дистиллиро-к препарату [11]. ванной воде, перед введением водную суспензию гри- Полагают, что противоопухолевая активность лен- бов (ВСГ) дополнительно перемешивали и вводили тинана связана с его способностью модулировать ак- перорально в объеме 0,5 мл каждому животному. тивность иммунокомпетентных клеток противоопухо- Индукцию опухолей у мышей вызывали 1,2-диме-левой защиты. В работе Кига$Ы§е 8. показано, что пе- тилгидразином (ДМГ). Канцероген растворяли в фи-роральное введение грибов Ьепйпш еёоёеБ снижает зиологическом растворе, вводили подкожно в межло-число мышей с опухолями мочевого пузыря на фоне паточную область в дозе 7,2 мг/кг 1 раз в нед строго по действия канцерогенного Ы-бутил-Ы-бутанол нитроза- массе тела животных из расчета 0,1 мл раствора ДМГ мина, восстанавливая при этом хемотаксическую ак- на 10 г массы тела. Дозу рассчитывали на основании тивность макрофагов и ответ лимфоцитов на митоген действующего вещества без учета молекулярного веса конканавалин А [8]. Имеются сообщения, что лентинан гидрохлорида. изменяет соотношение субпопуляций Т-клеток и уси- Опыты проведены на 102 мышах-самках ливает продукцию фактора некроза опухоли у мышей, Р1(С57В1хСВА) массой 29-30 г разводки питомника, поддерживает или усиливает ответ лимфоцитов через «Столбовая» РАМН. Мыши были разделены на 5 потенцирование секреции цитокинов, стимулируя со- групп: 1-я - интактные, здоровые мыши, п=10; 2-я -зревание, дифференцировку и пролиферацию клеток мыши (контроль), которым 1 раз в нед на протяжении системы естественного иммунитета [3; 15]. 30 нед вводили подкожно ДМГ в дозе 7,2 мг/кг, п=21; В клинических испытаниях полиглюкан лентинан 3-я - мыши, получавшие это же количество ДМГ по способствовал улучшению качества и увеличению той же схеме и 5 раз в нед ВСГ Шиитаке перорально продолжительности жизни больных неоперабельным из расчета 18 мг/кг, п=24; 4-я - мыши, получавшие раком желудка, толстой кишки и молочной железы, не ДМГ по принятой схеме и ВСГ грибов из расчета проявляя при этом токсического эффекта [3; 12; 17]. 188 мг/кг, п=24; 5-я - мыши, получавшие ДМГ и ВСГ Исследование периферической крови больных различ- из расчета 376 мг/кг, п=23. Вводить ВСГ мышам 3-й, ными формами рака желудочно-кишечного тракта вы- 4-й и 5-й групп начали за 1 мес до начала воздействия явило стимулирование экспрессии рецептора 1Ь-2 1-й дозы ДМГ и продолжали в течение последующих в моноцитах периферической крови и изменение соот- 5 мес. Суммарное количество ПГ, которое получила ношения Тх1/Тх2 клеток у больных при воздействии каждая мышь 3-й, 4-й и 5-й групп за весь опыт, соста-лентинана [17]. вило соответственно 81; 846 и 1692 мг. В то же время имеются сведения о том, что грибы Усыпляли мышей 1-5-й групп под эфирным нар-Ьепйпш еёоёеБ, помимо вышеперечисленных соедине- козом на 255-й день эксперимента. Для гистологичес-ний, в своем составе содержат формальдегид (100- кого исследования брали все найденные при вскрытии 240 мг/кг), который по заключению МАИР является опухоли и органы с видимыми изменениями. Матери-канцерогеном. Сушка грибов заметно снижает содер- ал фиксировали в 10 %-ном формалине, морфологиче-жание этого вещества [10]. Более того, в процессе суш- ский диагноз устанавливали по результатам микроскоки формальдегид в реакции конденсации с цистеином пического исследования гистологических препаратов образует соединение тиазолидин-4-карбоксильную (окраска гематоксилином и эозином). кислоту, которая является эффективной ловушкой для По завершению эксперимента определяли следую-эндогенно образованных нитритов и канцерогенных щие показатели: выживаемость, частота опухолей, воз-нитрозосоединений. Кипячение грибов резко повыша- никших у животных каждой группы (спонтанных и ин-ет его выход [9]. Имеется единичная работа, в которой дуцированных), локализация и морфологический спектр тестирование грибов Ьепйпш еёоёеБ на мутагенность новообразований, коэффициент множественности (чис-в тесте Эймса дало положительный результат [14]. ло опухолей на число животных с опухолями), время об- Учитывая вышеизложенные результаты, получен- наружения первой опухоли (эффективное число). ные другими исследователями, в том числе и наши Статистическую обработку проводили с использо-собственные данные, представляется целесообразным ванием критериев Стьюдента [5]. изучить наличие профилактических свойств у грибов ЬепИпия в(1о(1ез в отношении химически индуцирован- РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ного канцерогенеза в хроническом эксперименте на Результаты, полученные в модельном опыте индуци-мышах. рованного ДМГ канцерогенеза, приведены в табл. 1 и 2. Ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 1
Таблица 1
Индукция опухолей у мышей-гибридов Р1(С57Б1хСБЛ) при воздействии ДМГ и ВСГ Ьепипш edodes
Группы (доза ВСГ, Число животных с опухолями
мг/кг) Эффек- Всего с Печени Лейкозы Легких Желудка Анальной Яичника Матки Кишечника Других
тивное опухолями области локали-
чиста зации
к к % к % к % к % к % к % к % к % к % К %
0 О О О о о 0 О о о о
л л л л л л л л л л л
и и и и и и и и и и и
ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч ч
е е е е е е е е е е е
с с с с с с с с с с с
т т т т т т т т т т т
в в в в в в в в в в в
О О О О О О О О О О О
2 ДМГ 20 20 100 14 70 7 35 - - - - 10 50 2 10 1 5 14 70 1* 5
3 ДМГ+ВСГ 23 23 100 15 65,2 5 21,7 4 17,4 6 26,1 1 4,3 1 4,3 18 78,3
(18)
4
ДМГ+ВСГ 23 20 87 17 73,9 4 17,4 3 13,0 1 4,3 7 30,4 1 4,3 1 4,3 16 69,6 1** 4,3
(188)
5 ДМГ+ВСГ 22 19 86,4 16 72,7 3 13,6 1 4,5 1 4,5 6 27,3 2 9Д 1 4,5 10 45,5
(376)
*Опухоль мочевого пузыря; **Опухоль почки___________
Выживаемость
Определяются различия в продолжительности жизни контрольных мышей, получавших ДМГ (2-я группа) и опытных мышей (группы 3-я, 4-я, 5-я), получавших ВСГ совместно с ДМГ. Хотя в течение первых 21 нед мыши во всех опытных группах не гибли, в дальнейшем частота гибели мышей, потреблявших ВСГ, была выше. К концу опыта на 255-й день выжили соответственно в группах 2-й, 3-й, 4-й, 5-й - 80,9 %, 54,2 %, 33,3 %, 47,8 %. Вскрытие павших мышей, ко-
торым вводили ВСГ, выявило очаговые некрозы и воспалительную инфильтрацию в печени и выраженную гиперемию слизистой кишечника.
Частота опухолей
Как видно из данных табл. 1, количество мышей с опухолями во всех опытных группах составило 86,4100 %, причем в группах мышей, получавшим ВСГ в дозах 188 или 376 мг/кг, этот показатель имел меньшие значения. В этих же группах при действии ВСГ
Таблица 2
Локализация и множественность опухолей у мышей-самок Р1(С57Б1хСБЛ) при воздействии ДМГ и ВСГ Ьвпйпт ейойеъ
Группа, (ВСГ, мг/кг), количество мышей Количество опухолей (на одну мышь)
Всего Доброкачественные Злокачественные Печень Анальная область Полип кишечника (доброкачественный) Полип кишечника (злокачественный)
1 Интактные п=10 1 1 0 0 0 0 0
2 ДМГ п=20 71 (3,55+1,47) 30 (1,5+1,19) 41 (2,05+1,1) 20 (1,0+0,86) 10 (0,5+0,6) 16 (0,8+0,83) 14 (0,7+0,92)
3 ДМГ+ВСГ (18) п=20 71 (3,09±1,34) 29 (1,26±1,0) 42 (1,83±1.03) 20 (0,87±0,69) 6 (0,26±0,45) 16 (0,7±0,88) 16 (0,69±0,76)
4 ДМГ+ВСГ (188) п=20 68 (3,4±1,6) 26 (1,3±0,92) 42 (2,1±1,4) 25 (1,25±0,72) 6 (0,3±0,47) 11 (0,55±0,83) 15 (0,75±0,85)
5 ДМГ+ВСГ (376) п=19 55 (2,89±1,88) 18 (0,95±1,27) 37 (1,95±1,65) 17 (0,89±0,46) 6 (0,32±0,48) 10 (0,53±0,9) 14 (0,74±0,99)
1 1
24 БИОТЕРАПИЯ
к отмечалось некоторое снижение числа животных Основание таких опухолей, как правило, было пред-с лейкозами (ДМГ - 35 %, ДМГ+ВСГ - 13,6-21,7 %) ставлено атипичной железистой тканью с мелкими не-и опухолями анальной области (ДМГ - 50,0 %, правильной формы железками, которые проявляли ДМГ+ВСГ - 26,1-27,3 %). Частота опухолей толстой признаки инвазивного роста в подлежащие более глу-кишки была наименьшей в группе мышей, получав- бокие отделы стенки толстой кишки. ших максимальную дозу ВСГ (ДМГ - 70,0 %, Таким образом результаты, полученные в опыте на ДМГ+ВСГ- 45,5%). В то же время спектр опухолей мышах, подвергнутых продолжительному воздей-несколько расширился у мышей, которым вводили ствию ДМГ, не выявили значимого ингибирующего ВСГ, за счет образования опухолей в легких (геманги- действия ВСГ Lentinus edodes на частоту, множествен-ома и аденомы) и желудке (гемангиома и папиллома ность и морфологическую характеристику опухолей. преджелудка). Наряду с этим отмечается тенденция снижения частоты опухолей анальной области и доброкачественных Расчет коэффициента множественности опухолей толстой кишки. В ранее выполненной нами Расчет коэффициента множественности (табл. 2) работе был получен достоверный ингибирующий эф-выявил незначимое снижение общего количества фект действия ВСГ на рост перевиваемой аденокарци-опухолей (на 4,2-18,6 %), рассчитанное на 1 мышь номы Эрлиха на мышах C57B1 и Р1(С57Б1хСВА). Пев группах мышей, получавших ВСГ. Показатель сни- роральное введение ВСГ до перевивки опухоли и в те-зился в основном благодаря уменьшению доли доб- чение ее роста нормализовало общее количество рокачественных опухолей, в то время, как доля иммунокомпетентных клеток в перитонеальном содер-злокачественных существенно не изменилась. Про- жимом и усиливало функциональную активность пе-слеживалось некоторое снижение коэффициента ритонеальных макрофагов у мышей с опухолями [1]. множественности злокачественных опухолей аналь- Учитывая, что действие ВСГ проявлялось на ранней ной области и доброкачественных опухолей толстой стадии развития перевитой АКЭ у мышей, можно кишки (соответственно на 36-48 % и 12,3-33,8 % по предположить, что ВСГ действует в основном на ста-сравнению с контролем) у мышей, получавших дии инициации развития опухоли. Отсутствие эффек-ВСГ. В то же время злокачественное поражение дру- та в условиях химического канцерогенеза, вероятно, гих органов, в том числе толстой кишки, не отлича- связано с усилением токсического действия ДМГ при лось от контрольных мышей. сочетанном продолжительном ведении его с ВСГ, с одной стороны, и морфологической разнородностью ин-Морфологический анализ опухолей дуцируемых опухолей с другой. Основываясь на полу-Морфологический анализ опухолей у мышей-гиб- ченных исследователями данных о развитии и сохра-ридов показал, что у животных всех опытных групп нении иммунного ответа на введение лентинана регистрировали новообразования, характерные для в течение 3-7 дней после поступления полисахарида канцерогенного действия ДМГ (аденокарциномы ки- [2], можно ожидать, что иная схема введения ВСГ мы-шечника, гемангиоэндотелиомы, опухоли кожи и ее шам, подвергнутым продолжительному воздействию придатков, локализованных в анальной области, а так- ДМГ, обладала бы большей эффективностью. же лейкозы). Поступление ВСГ в организм мышей практически не изменяло морфологической картины ВЫВОДЫ опухолей. 1. Выявлено усиление токсического действия ДМГ Наиболее часто встречаемые опухоли толстой при сочетанном продолжительном введении его с ВСГ кишки, индуцированные ДМГ, по макроскопическому у мышей-гибридов. строению разделялись на экзофитные (до 80 %) и эк- 2. Регулярное продолжительное введение ВСГ зофитно-эндофитные (5-10 %) новообразования. Гис- вдозах 18 и188мг/кг не повлияло на индукцию имно-тологические исследования показали, что индуциро- жественность опухолей у мышей-гибридов, подверг-ванные опухоли кишечника были представлены нутых воздействию ДМГ. В то же время при введении опухолевыми образованиями 2 типов: доброкачест- максимальной дозы 376 мг/кг отмечалась тенденция венными полипами (бороздчатыми и аденоматозны- к снижению числа животных с опухолями и коэффи-ми) и злокачественными экзофитными аденокарцино- циента множественности опухолей. Эти показатели мами, которые, по всей вероятности, являются резуль- снижаются прежде всего за счет уменьшения числа татом озлокачествления аденоматозных полипов. доброкачественных опухолей. Аденоматозная ткань полипов была хорошо отграничена от слизистой, образующей основание такой опу- ЛИТЕРАТУРА холи, и признаков инвазии не отмечалось. Экзофитные 1. Дерягина В. П., Рыжова Н.И., Разин А. Н., Бо-аденокарциномы характеризовались более крупными чарова О. А. Действие грибов Lentinus edodes (Шиита-размерами по сравнению с размерами полипов; кроме ке) на рост подкожно перевитой аденокарциномы Эр-того, они отличались выраженными признаками кле- лиха у мышей // Российский биотерапевтический жур-точной и структурной атипии паренхимы. Обязатель- нал. - 2006. - Т. 5, № 1. - С. 98-104. ным характерным компонентом их структуры было на- 2. Arinaga S., Karimine N., Takamuku K. et al. личие тубулярных образований неправильной формы. Enhanced induction of lymphokine-activated killer activi- Ч
№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
1 I
ty after lentinan administration in patients with gastric carcinoma // Int. J. Immunopharmacol. - 1992. - Vol. 14(4).
- P. 535-539.
3. Chihara G. Recent progress in immunopharma-cology and therapeutic effects of polysaccarides // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2005. - Vol. 330(1).
- P. 46-52.
4. Chihara G., Maeda Y.Y. Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from lentinus edodes // Nature. - 1969. - Vol. 222. - P. 687.
5. Gatt J., Krewski, Lee P. N. et al. Statistical methods in cancer research // IARC Publ. -1996. - Vol. 3. - P. 1-207.
6. Hattori T., Hamai Y., Ikeda T. et al. Inhibitory effects of immunopotentiators on the enhancement of lung metastases induced by operative stress in rats // Gann. -1982. - Vol. 73(1). - P. 132-135.
7. Ivankovic S., Hirsl N., Jakopovic I. The influence of medicinal mushroom preparations on mouse tumors // Int. J. Med. Mushrooms. - 2004. - Vol.6. - P. 2-20.
8. Kurashige S. Effects of Lentinus edodes, Grifola frondosa and Pleurotus ostreatus administratium on cancer outbreak, and activities of macrophages and lymphocytes in mice treated with a carcinogen, N-butyl-N-butanolnitrosoamine // Immunopharmacol. Immunotoxi-col. - 1997. - Vol. 19(2). - P. 175-183.
9. Kurascima Y., Tsuda M., Sugimura T. Marked formation of thiazolidine-4-carboxil acid, an effective nitrite trapping agent in vivo, on boiling of dried shiitake mushroom // J. Agric. food chem. - 1990. -Vol. 38(10). -P. 1945-1949.
10. Mason D. J., Sykes M. D., Panton S. W., Rippon E. H.Determination of naturally-occuring formaldehyde in raw and cooked Shiitake mushrooms by spectropho-
tometry and liquid chromatography-mass spectrometry // Food additives and contaminants. - 2004. - Vol. 21(11). -P. 1071-1082(12).
11. Murata T. Lentinan enhances sensitivity of mouse colon 26 tumor to cis-diamminedichloroplatinum (II) and decreases glutathione transferase expression // Jpn. J. Cancer Res. - 1990. - Vol. 87(11). - P. 1171-1178.
12. Nakano H., Namatame K., Nemoto H. et al. A multi-institutional prospective study of lentinan in advanced gastric cancer patients with unresectable and recurrent diseases: effect on prolongation of survival and improvement of quality of life // Anticancer Res. - 2002.
- Vol. 22(3). - P. 1737-1754.
13. Ng M. L., Yap A. T. Inhibition of human colon carcinoma development by lentinan from shiitake mushrooms (lentinus edodes) // Int. Immunopharmacol. - 2005.
- Vol. 5(7-8). - P. 1225-1233.
14. Von Wright A., Knuutinen J., Lindroth S. et al. Mutagenicity of some edible mushrooms in the Ames test // Food chem. Toxicol. - 1982. - Vol. 20(3). - P. 265-268.
15. Wang G. L., Lin Z. B. Immunomodulatory effect of lentinan // Acta Pharm. Sinica. - 1996. - Vol. 31. - P. 86-90.
16. Wasser S. P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - Vol. 60(3). - P. 258-274.
17. Yoshino S., Tabata T., Hazama S. et al. Immunoregulatory effects of the antitumor polysaccharide lentinan on Th1/Th2 balance in patients with digestive cancers // Developmental Biology Standards. - 1992. -Vol. 77. - P. 191-197.
Поступила 29.05.2006.
4
