CC BY
110
УДК 582.28:616-006.66-02:616-092.9
V. P. Deryagina1, N. I. Ryzhova1, A. N. Razin2,1. A. Philippova2, M. Yu. Volkov2,
O. A. Bocharova1
EFFECT OF FUNGI LENTINUS EDODES ON GROWTH INOCULATED EHRLICH ADENOCARCINOMA IN MICE
1 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
2 Shiitake Ltd., St. Petersburg
ABSTRACT
Effect of water suspension of fungi (WSF) Lentinus edodes on growth inoculated Ehrlich adenocarcinoma (ACE) was investigated in mice C57B1 and F1(C57BlxCBA). It was shown, that per os administration of WSF (188 and 376 mg/l) leads to the growth inhibition ACE (to 42; 50 and 53 %, volume) in mice C57Bl and F1(C57BlxCBA) and to 26,2 % (mass) in mice F1. Administration of WSF to healthy mice in dose 188 mg/l increased in 4,9 times total cells number of abdominal cavity basically due to increasing the lymphocytes number. When mice with ACE were given WSF (188 and 376 mg/l), total number of cells in abdominal cavity decreased in 4,7 times and was close to the index of control mice without tumors. WSF administrated to mice with tumors stimulated functional activity of abdominal cavity macrophages which was defined by formation of oxygen and nitrogen oxide active forms.
Key words: Ehrlich adenocarcinoma, Lentinus edodes fungi, tumor growth inhibition, macrophages, active forms of oxygen, nitrites, nitrates.
-Q-
В. П. Дерягина1, Н. И. Рыжова1, А. Н. Разин2, И. А. Филиппова2, М. Ю. Волков2,
О. А. Бочарова1
ДЕЙСТВИЕ ГРИБОВ ЬЕМГШШ ЕВОВЕЗ (ШИИТАКЕ) НА РОСТ ПОДКОЖНО ПЕРЕВИТОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА У МЫШЕЙ
-Q-
1 ГУ РО 'Н'Ц им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
2 ООО «Шиитаке», Санкт-Петербург
РЕЗЮМЕ
В эксперименте на мышах С57В1 и мышах-гибридах Р1(С57В1хСВА) изучено действие водной суспензии грибов (ВСГ) Ьепйпш edodes (Шиитаке, Фунго-Ши) на рост подкожно перевитой аденокарциномы Эрлиха (АКЭ). Показано, что пероральное введение ВСГ в дозе 188 и 376 мг/кг приводит к торможению роста АКЭ, определяемого по объему (42, 50 и 53 %), у мышей С57В1 и И(С57В1хСВА) и достоверному снижению массы опухоли на 26,2 % у мышей-гибридов. Введение здоровым мышам ВСГ (188 мг/кг) приводит к достоверному в 4,9 раза повышению общего количества клеток перитонеального содержимого, в основном за счет возрастания количества лимфоцитов. При регулярном пероральном поступлении в организм мышей с опухолями ВСГ Шиитаке, отмечается нормализация этого иммунологического показателя, повышенного в 4,7 раза у животных с АКЭ. ВСГ при введении мышам с опухолями стимулировала функциональную активность макрофагов, определяемую по образованию активных форм кислорода и оксида азота.
Ключевые слова: аденокарцинома Эрлиха, грибы ЬвЫтш edodes (Шиитаке), торможение роста опухоли, макрофаги, активные формы кислорода, нитриты, нитраты.
ВВЕДЕНИЕ
В системе противоопухолевой защиты важная роль принадлежит неспецифической противоопухолевой резистентности, составляющими элементами которой являются макрофаги, нейтрофилы и КК-клетки (паШга!
кШег). Макрофаги и нейтрофилы распознают и эффективно элиминируют трансформированные и опухолевые клетки независимо от того, экспрессируют ли последние специфические опухолевые антигены. Помимо этого макрофаги и нейтрофилы играют инструктивную
и контролирующую роль в индукции специфического (адаптивного) иммунитета [5; 6]. Один из путей реализации их эффекторных и регуляторных функций состоит в активации NADPH-зависимой оксидазы, что приводит к образованию ряда высокоактивных форм кислорода (супероксид анион-радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород). Все эти соединения обладают мощным окислительным и антимикробным потенциалом и в значительной мере определяют цитостатическое и цитотоксическое действие макрофагов и нейтрофилов, в т. ч. по отношению к опухолевым клеткам [1; 9].
К настоящему времени накопились сведения о том, что многие соединения, входящие в состав грибов Шиитаке, обладают иммуномодулирующим действием, активирующим звено неспецифической противоопухолевой защиты, и повышают продукцию интерферона в крови. Японский гриб Lentinus edodes (Шиитаке) характеризуется сложным составом, включающим полисахариды, простые сахара, аминокислоты, липиды, алкалоиды, фенолы, витамины группы В, С, эргостеролы, минеральные вещества и другие соединения. Его биорегулирующие эффекты связывают прежде всего с полисахаридом лентинаном, проявляющим модифицирующее действие на активность клеток врожденного иммунитета. Полисахарид лентинан представляет собой полиглюкан с в1-3-связями в основной цепи и в 1—6 — в боковой с м.м. 500 000 и составляет основную часть полисахаридного комплекса гриба. Высказывается мнение, что лентинан (как и классические иммуномодуляторы тимозин, Т-акти-вин, левамизол) обладает биорегулирующим разнонаправленным эффектом, способным усиливать слабую, ослаблять сильную или оставлять без изменения нормальную реакцию иммунной системы [7; 13]. Показано, что лентинан, входящий в состав грибов Ganoderma L., вызывал у больных меланомой усиление Т-киллерной активности и нормализовал другие показатели клеточного иммунитета [7]. Иммунокорригирующие свойства лентинана, входящего в состав грибов Lentinus edodes, послужили основанием для изучения протекторного действия водной суспензии из этих грибов на рост опухоли у мышей.
Цель настоящего исследования — экспериментальное изучение профилактического действия грибов Lentinus edodes в отношении опухоли и возможного механизма его реализации в эксперименте in vivo.
Задачи исследования:
— изучение влияния грибов на рост перевивной аденокарциномы Эрлиха (АКЭ);
— модулирование важных элементов противоопухолевой защиты — функциональной активности макрофагов перитонеального содержимого и активности NO-синтазы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали высушенные, измельченные плодовые тела грибов Шиитаке (Фунго-Ши) в виде порошка (ТУ 9164-001-03682201-2002). На основе этого
сырья производится БАД «Шии-Таке» (ТУ 9164-00171260555-03), в котором общее количество полисахаридов составляет 24 %, из них полиглюкана лентинана содержится не менее 4,5 %. Порошок грибов (ПГ) растворяли в дистиллированной воде. Перед введением мышам суспензию грибов дополнительно перемешивали и вводили перорально в объеме 0,3 мл водной суспензии грибов (ВСГ) каждому животному. Работа проведена на 82 мышах-самках линии C57Bl и F1(C57B1хСВА) разводки питомника «Столбовая» РАМН.
52 мыши C57Bl массой 29-31 г были разделены на пять групп:
1-я группа — интактные мыши (здоровые мыши);
n=5;
2-я группа — здоровые мыши, получавшие ВСГ 5 раз в неделю в течение 64 дней из расчета 188 мг/кг; n=5;
3-я группа — мыши с подкожно перевитой АКЭ (106 клеток в 0,5 мл раствора Хенкса), получавшие перорально 5 раз в неделю дистиллированную воду в течение 64 дней; n=13;
4-ю и 5-ю группу по 14 и 15 мышей в каждой составляли мыши с перевитой АКЭ, получавшие 5 раз в неделю в течение 28 дней до перевивки и 36 дней после перевивки опухоли ВСГ в разовой дозе 188 или 376 мг/кг.
Общее количество ПГ, полученное каждым животным на протяжении всего эксперимента, при введении дозы 188 мг/кг составило 282 мг, а при введении дозы 376 мг/кг — 564 мг.
Мыши-гибриды F1(C57B1хСВА) массой 28-30 г были разделены на две группы (контроль — 6-я группа и опыт — 7-я группа) по 15 особей в каждой. Продолжительность введения ВСГ мышам 7-й группы в разовой дозе 188 мг/кг составила 14 дней до перевивки АКЭ и 32 дня после перевивки с частотой введения 5 раз в неделю. Суммарная доза, полученная каждой мышью, составила 192 мг ПГ.
Штамм опухоли получен из банка ГУ РОНЦ. В опытах на мышах-самках C57Bl и F1(C57B1хСВА) использовали 2-3 пассажа опухоли in vivo.
Ингибирующий эффект ВСГ оценивали по торможению роста опухоли (ТРО) у животных опытных групп по сравнению с контрольной группой:
ТРО = [(Ук - Уэп)/Ук] х 100 %,
где Ук — средний объем опухоли в контрольной группе; Узп — средний объем опухоли в опытной группе (мм3).
Принимая во внимание, что форма опухоли не чисто сферическая и более напоминает эллипсоид, объем опухоли определяли по формуле для расчета объема эллипсоида:
У= AxBxCx п/6,
где А, В, С — длина большой, средней и малой оси [2].
Выделение активных форм кислорода фагоцитами крови и перитонеальной жидкости (нейтрофилами, моноцитами и макрофагами) определяли по люминолза-висимой хемилюминесценции (ХЛ) [3; 4; 12], регистрируемой прибором «Биолюмат», модель 9500
1GG
(BerthooІd, Геpмaния). Pезидентные клетки перитоне-aльнoй жидкости пoлyчaли промывшем брюшной полости paствopoм Xенксa в объеме 2 мл. Пеpитoнеaль-ные клетки oсaждaлись Ha предметном стекле в термостате при темпеpaтypе 37 °C в течение 20 мин. После фиксaции в метaнoле и oкpaшивaния по Poмaнoвскo-му—Гимзе определяли клеточный сoстaв пеpитoнеaль-ной жидкости по морфологическим критериям. Для пoстaнoвки pеaкции определения спoнтaннoй (CXH) и фaгoцитoзaвисимoй хемилюминесценции (ФЗX) крови и клеток пеpитoнеaльнoгo содержимого смешивaли 0,2 мл paствopa Xенксa + 0,1 мл люминoлa (0,56 мМ) + 0,1 мл крови (пpедвapительнo paзведеннoй 4 рязя ряство-ром Xенксa) или 0,1 мл пеpитoнеaльнoй жидкости. B кячестве aктивaтopa фaгoцитoзa испoльзoвaли грибы Candida albicans, oпсoнизиpoвaнные сывороткой 10-12 здоровых доноров. XH измеряли в течение 30 мин с ин-теpвaлoм 5 мин. Известно, что хемилюминесцентный ответ крови и перитонеяльной жидкости определяется, в основном, фягоцитирующими клеткями — нейтро-филями, моноцитями и мякрофягями, способными продуцировять aктивные формы кислородя. Учитывяя это, a тякже исходя из клеточного состявя изучяемого объекта, можно предположить, что в крови уровень AФK определяется в основном нейтрофилями. Моноциты, присутствующие в крови в меньшем количестве и проявляющие более низкую хемилюминесцентную яктивность (до 10 ряз), вносят меньший вкляд в общий хемилюминесцентный отклик крови [14; 15]. Прини-мяя это соотношение, приходим к выводу, что хемилю-минесцентняя яктивность перитонеяльной жидкости, содержящей m мякрофягов и n нейтрофилов, эквивя-лентня яктивности m + 10 n мякрофягов. Отсюдя яктив-ность одного мякрофягя может быть оцененя (по хеми-люминесцентному отклику) кяк Xn/(m + 10 n).
Содержание нитритов (НИ) в биологических жидкостях — крови, перитонеяльном содержимом и моче — определяли методом Грисся [4]. Нитряты (HA) при их определении предвярительно вoсстaнaвливaли до НИ пористым кядмием и aнaлизиpoвaли тем же методом. Для сборя мочи мышей помещяли по 6 штук в обменные клетки ня сутки, лишив кормя при свободном доступе к дистиллировянной воде. Bo избежяние рязрушения НИ в емкости для сборя мочи вносили 0,3 мл 30% гидроксидя нятрия. При янялизе HA и НИ в опухолевой ткяни опухоль измельчяли ня мелкие кусочки, тщятельно рястиряли в фярфоровой ступке. Опухолевую ткянь (нявескя 3-5 г) экстрягировяли в дистиллировянной воде (40 мл) ня водяной бяне при темперятуре 90 °C в течение 15 мин. Зятем экстрякт охляждяли до комнятной темперятуры и доводили ди-стиллировянной водой до 50 мл. Для удяления белково-углеводной состявляющей в экстрякте опухолевой ткяни, перитонеяльном содержимом и моче использо-вяли водные рястворы кялия железисто-синеродистого и цинкя сернокислого [4].
Антиоксидантную активность (АОА) водного экстракта грибов Шиитаке оценивяли в тест-системе, предложенной Ю. О. Tеселкиным и соявт. [10].
Метод основан на способности антиоксидантов продукта перехватывать свободнорадикальные соединения (супероксидный анион-радикал, гидроксильный радикал, феррил-радикалы НЬ), образующиеся в системе гемоглобин — пероксид водорода — люминол и подавлять люминолзависимую хемилюминесценцию. Оценку АОА продукта проводили по двум параметрам: временному интервалу задержки (латентному периоду) развития ХЛ и максимальной интенсивности ХЛ. Водный экстракт из грибов (экстрагирование при температуре 90 °С в течение 15 мин) вносили в реакционную смесь в растворе Хенкса перед инициированием свободнорадикального окисления до достижения концентрации 50, 100, 200, 300, 500 и 700 мкг/мл (в расчете на исходный продукт).
Статистическую обработку данных, представленных как среднее арифметическое значение ± стандартное отклонение, проводили, используя критерий Стьюдента [11].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В табл. 1 (опыт 1, опыт 2) представлены результаты действия ВСГ Шиитаке на рост АКЭ у мышей С57В1 и И(С57В1хСВА) с 5-го по 33-й день наблюдения после трансплантации опухоли.
Как видно из приведенных данных, опухоль была чувствительна к длительному введению ВСГ в максимальной разовой дозе 376 мг/кг у мышей С57В1. При этой дозе наиболее выраженное достоверное ТРО регистрируется к 12-м суткам и составляет 53 % (р<0,01). На ранних сроках наблюдения у некоторых мышей этой группы опухоли не пальпировались. При введении мышам меньшей дозы (188 мг/кг) эффективность регистрировалась на уровне ТРО 42 % (р<0,05) в те же сроки, что и при введении максимальной дозы. После 15 сут объем опухоли (среднее значение) у мышей, потреблявших ВСГ, был на 20-30 % меньше, чем у контрольных животных, и такое различие регистрировали до конца эксперимента. Случаи гибели мышей С57В1 с АКЭ, которым вводили ВСГ, имели место в более поздние сроки, чем в контроле, и регистрировались на 54-е сутки от начала введения ВСГ.
У мышей-гибридов Р1(С57В1хСВА) менее продолжительное профилактическое введение ВСГ в дозе 188 мг/кг вызывает достоверное торможение роста АКЭ на ранних сроках наблюдения, максимум которого отмечается к 8-11-м суткам роста опухоли и составляет 50 % (р<0,01). После 14 сут роста средний объем опухоли у мышей-гибридов был на 14-20 % ниже этого показателя у контрольных животных.
Взвешивание опухолей у мышей С57В1 4-й и 5-й группы на 37-е сутки после трансплантации АКЭ выявило незначительное (на 20 и 23 %) снижение средней массы опухолей (см. табл. 1, опыт 1).
Следует подчеркнуть, что у мышей-гибридов Р1(С57В1хСВА) регистрируется достоверное ингибирование роста опухоли по массе, которое составляет 27 % (р=0,02).
Таблица 1.
Влияние ВСГ Lentinus edodes (Шиитаке) на динамику роста опухоли у мышей С57В1 и F1(C57BlxCBA) с подкожно перевитой АКЭ
Опыт 1. Мыши С57В1
Группа, доза ВСГ, мг/кг Объем опухоли*, мм3 Масса опухоли на 37-е сутки, мг
Сутки после перевивки опухоли
5-е 8-е 12-е 15-е 18-е 21-е 25-е 28-е 33-и
3-я 29+16 110+74 621+340 1283+924 1629+805 2472+1251 3359+1443 3985+1727 5196+1796 5173+1558
АКЭ п=13 п=13 п=13 п=13 п=13 п=13 п=13 п=11 п=11 п=11
4-я 20±16 109±95 362±263" 814±550 1260±660 2032±1007 2678±1253 2953±1163 4169±1793 4126±1742
АКЭ+ 188 п=15 п=15 п=15 п=15 п=15 п=15 п=15 п=15 п=15 п=14
5-я 23+19 90+59 295+204*" 734+363** 1264+629 1777+604 2416+1165 2885+1456 4193+2113 3983+1605
АКЭ+376 п=14 п=14 п=14 п=14 п=14 п=14 п=14 п=14 п=14 п=13
Опыт 2. Мыши F1(C57B1хСВА)
Группа, доза ВСГ, мг/кг _ _ * Объем опухоли , мм 3 Масса опухоли на 31-е сутки, мг
Сутки после перевивки опухоли
6-е 8-е 11-е 14-е 18-е 21-е 25-е 28-е
6-я 151+77 207+92 475+267 742+322 1543+692 2134+805 2722+1142 3682+1244 3065+970
АКЭ и=15 и=15 и=15 и=15 и=15 и=15 и=15 и=15 и=15
7-я 82+65** 103+94*** 248+220** 590+280 1269+485 1760+713 2333+1011 3087+1628 2261+775**
АКЭ+188 и=15 и=15 и=15 и=15 и=15 и=15 и=15 и=15 и=14
* M±SD, где М — средний объем опухоли, мм3; SD — стандартное отклонение. ** p < 0,05.
*** p < 0,01.
В табл. 2 приведены показатели ТРО в зависимости от суммарной дозы ВСГ. Как видно из приведенных данных, мыши-гибриды с АКЭ, которые получили меньшее суммарное количество ВСГ, были более чувствительны к его действию, чем мыши С57В1. Достоверный показатель ТРО у мышей-гибридов фиксировали на самом раннем этапе роста АКЭ после 20-го дня введения ВСГ, суммарное количество которой к этому сроку составило 85 мг/мышь (разовая доза 188 мг/кг).
Мыши С57В1 с АКЭ были более резистентны к действию ВСГ. Достоверный эффект ТРО проявлялся только начиная с 40-го дня при получении каждой мышью 4-й и 5-й группы суммарных доз ВСГ 164 и 327 мг соответственно.
Можно предположить, что менее продолжительное профилактическое введение ВСГ мышам Б1(С57В1хСВА) является оптимальной схемой, при которой эффект ТРО выявляется на более ранних сроках.
Анализ данных лейкоцитарного состава клеток крови, полученной у мышей C57B1 по завершению эксперимента (табл. 3), показывает, что мыши с АКЭ характеризуются более высоким уровнем лейкоцитов по сравнению с мышами интактной группы, причем у мышей, потреблявших ВСГ, отмечается рост этого показателя. Наряду с этим в крови животных с опухолью наблюдается увеличение относительного количества нейтрофилов в 3,7-4,7 раза, а введение ВСГ несколько усиливает эту тенденцию.
Данные определения функциональной активности нейтрофилов в крови по выделению активных форм кислорода в хемилюминесцентном тесте показывают снижение активности нейтрофилов в спонтанном состоянии на 32,5-44,7 % у мышей с опухолью линии C57B1. Введение ВСГ не корректировало этого показателя. При стимулировании фагоцитарного процесса Candida albicans показатель ФЗХ крови мышей с АКЭ, независимо от того, вводили ВСГ или нет, был близким к значениям для интактной группы.
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
-Q-
Таблица 2.
Торможение роста подкожно перевитой АКЭ у мышей при длительном введении ВСГ Ьвпйпт вйойвв
Мыши С57В1
Группа, доза ВСГ, мг/кг ТРО, %
Сутки после начала введения ВСГ
33-и 36-е 40-е 43-и 46-е 49-е 53-и 56-е 61-е
4-я 31 0 42* 37 23 18 20 26 20
188 (130) (147) (164) (180) (186) (203) (214) (237) (254)
5-я 21 18 53** 43* 22 28 28 28 19
376 (259) (293) (327) (361) (372) (408) (429) (474) (508)
Мыши F1(C57BlxCBA)
Группа, доза ВСГ, мг/кг ТРО, %
Сутки после начала введения ВСГ
20-е 22-е 25-е 28-е 32-е 35-е 39-е 42-е
6-я 46’ 50** 48* 20 18 18 14 16
188 (85)*** (96) (102) (118) (130) (147) (158) (175)
Таблица 3.
Лейкоцитарный состав крови мышей С57В1 с подкожно перевитой АКЭ при введении ВСГ Ьвпйпт ейойеъ
Группа, (доза ВСГ, мг/кг) Количество животных Количество лейкоцитов в 1 мкл, xlO3 Содержание в крови, %
Эозинофилы Моноциты Нейтрофилы Лимфоциты
1-я Интактные 5 3,77±0,45 - 8,8±2,6 12,2±3,2 79±3,5
2-я Интактные + ВСГ (188) 5 3,08±0,64 0,4±0,6 5,2±2,1 15,6±5,0 78,8±8,2
3-я АКЭ 9 4,61±1,8 0,4±0,7 12,4±5,8 45,6±9,4* 41,6±9,6*
4-я АКЭ+ВСГ (188) 7 5,19±1,94 0,3±0,5 9,0±6,2 50,7±19,4* 40,0±23,2*
5-я АКЭ+ВСГ (376) 6 б,31±1,38** 0,5±0,5 13,7±8,8 57,0±17,4* 28,8±16*
* p < 0,05.
** p < 0,01.
*** B скобках приведена суммарная доза, полученная каждой мышью после начала введения ВСГ, мг.
Определение клеточного состава перитонеального содержимого мышей (табл. 4) показывает, что введение здоровым мышам ВСГ (188 мг/кг) приводит к достоверному повышению в 4,9 раза общего количества клеток. Увеличение количества клеток в перитонеальной жидкости здоровых мышей при введении ВСГ происходило в основном за счет возрастания доли и абсолютного количества лимфоцитов и, в меньшей мере, моноцитов и макрофагов. Увеличение общего количества клеток в перитонеальном экссудате в 4,7 раза в сравнении с животными интактной группы присуще и мышам с АКЭ, не потреблявших ВСГ. В то же время у мышей с АКЭ, которым регулярно вводили перорально ВСГ, наблюдали нормализацию показателя общего количества клеток, сравнимого с уровнем здоровых мышей. У животных с АКЭ видовой состав клеток в перитонеальном содержимом (соотношение макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток, лимфоцитов) отличается существенным возрастанием относительного количества нейтрофилов в 6,1-6,9 раза и одновременным снижением доли макрофагов в 2,2-2,4 раза. Введение ВСГ практически не сказывалось на видовом соотношении клеток у мышей с опухолью.
Измерение ХЛ макрофагов перитонеального содержимого у мышей с АКЭ, потреблявших ВСГ, выявило существенное повышение активности этих клеток как в спонтанном состоянии, так и при их активации Candida albicans (табл. 5). Особенно наглядно это проявляется у мышей, получавших ВСГ в разовой дозе 188 мг/кг, активность макрофагов у которых в спонтанном состоянии возросла в 36,8 раза, а при их активации
— в 58,2 раза в сравнении с таким же показателем для мышей с АКЭ. Более высокая доза вводимых ВСГ (376
* p < 0,01 (в сравнении с показателем интактных животных).
мг/кг) также вызывала хотя и значимую активацию макрофагов, но в существенно меньшей степени — в 6,2 и 13,4 раза. Наряду с этим еще один показатель — коэффициент усиления активности макрофагов при их инкубации с Candida albicans, отражающий скрытый потенциал клеток, — по сравнению с показателем СХЛ указывает на рост функциональной активности макрофагов перитонеального содержимого мышей, получавших грибы.
Таблица 4.
Клеточный состав перитонеальной жидкости мышей С57В1 с подкожно перевитой АКЭ при введении ВСГ Lentinus edodes
Группа, (доза ВСГ, мг/кг) Количество животных Количеств 0 клеток в 1 мкл, xlO3 Содержание в перитонеальной жидкости, % (абсолютное кол-во, хК^/мкл)
Макрофаги+ моноциты Нейтрофилы Тучные клетки Лимфоциты
1-я Интактные 5 8»5±1»2 27,4+8,6 (2,33) 2,1+0,6 (0,18) 0,7+0,5 (0,06) 69,8±12,1 (5,93)
2-я Интактные+ ВСГ (188) 5 41,5±8,7** 15,3±1,2* (6,35) 1,2±0,3* (0,5) 1,0±0,4 (0,42) 82,5±1,3* (34,23)
3-я АКЭ 10 39,8±16,1** 11,4+5,6** (4,54) 13,2+11,4 (5,25) 1,4+1,0 (0,56) 74,0+10,8 (29,45)
4-я АКЭ+ВСГ (188) 7 7,4±2,6*’* 11,9±3,6*’ (0,88) 13,0±5,7** (0,96) 2,4±2,9 (0,18) 72,7±5,3 (5,38)
5-я АКЭ+ВСГ (376) 7 7,4±3,0”* 12,2±6,1** (0,9) 14,4±7,Г* (1,07) —* ® S | 72,8±12,1 (5,39)
* р< 0,05.
** р< 0,01 в сравнении с мышами интактной группы.
*** р<0,01 в сравнении с показателем для мышей с АКЭ.
Результаты определения нитритов (НИ) и нитратов (НА) в опухолевой ткани, перитонеальном содержимом, моче, приведенные в табл. 6, отражают интенсивность их эндогенного образования в организме. Источником эндогенного образования НИ и НА является оксид азота, продукт активности ЫО-синтаз (конститутивной и индуцибельной). Оксид азота, окисляясь, образует более стабильные соединения — НИ и НА. Принято считать, что способность к активации индуцибельной ЫО-синтазы (ЫО-с) в макрофагах, моноцитах, нейтрофилах является одной из важных ха-
№1/том 5/2006
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
Таблица 5.
Хемилюминесцентная активность макрофагов перитонеального содержимого мышей С57В1 с перевитой АКЭ при введении ВСГ Lentinus edodes
Группа (доза ВСГ, мг/кг) Количество животных Хемилюминесценция, рассчитанная на 103 макрофагов, имп./мин
спонтанная ф агоцитз ав и с и мая коэффициен т усиления
1-я Интактные 5 4,2±1,5 114±14,8 27,1
2-я Интактные + ВСГ (188) 5 3,0+1,4 64,8+20,8 21,6
3-я АКЭ 8 7.9±3,6 38,1+10,1 4,8
4-я АКЭ+ ВСГ (188) 6 291+104,4* 2219,7±1051,2* 7,6
5-я АКЭ+ ВСГ (376) 6 49,3+17,7* 509,3+131,4* 10,3
*р< 0,01 в сравнении с показателем для животных с АКЭ
рактеристик неспецифической противоопухолевой резистентности этих клеток. Имеются данные о том, что рост и стадия опухоли связаны с изменением содержания ЫО-с в опухолевой ткани [8; 16].
Определение НИ и НА в опухолевой ткани (см. табл. 6) выявило достоверное снижение в 2,2 раза образования НА в опухолевой массе мышей, получавших ВСГ в дозе 188 мг/кг, в сравнении с мышами с АКЭ. В то же время в опухолях мышей, получавших максимальную дозу ВСГ (376 мг/кг), содержание НИ и НА было на уровне мышей контрольной группы.
Анализ НИ в перитонеальной жидкости мышей показал более высокий их уровень у интактных мышей. Животные с опухолями имели на 29,4-64,7 % бо-
Таблица 6.
Содержание нитритов и нитратов в опухолевой ткани и биологических жидкостях мышей С57В1
Группа, (доза ВСГ, мг/кг) Опухолевая ткань, мкг/г Перитонеальная жидкость, мкг/мл Моча, мкг/кг
no2- N03“ no2- N03“ ж>2- N03“
1-я Интактные (-) В 0,34±0,05 п=6 н 0 25,4
2-я Интактные+ВСГ (188) (-) В О,24±О,04** п=6 н (-) (-)
3-я АКЭ 0,62±0,17 п=5 3,3±1,1 п=5 0,12±0,03** п=6 н 28,4 213,3
4-я АКЭ+ВСГ (188) 0,66±0,26 п=5 1,51+0,44*** п=5 0,12±0,04** п=6 н 0 138,9
5-я АКЭ+ВСГ (376) 0,79±0,28 п=5 3,6±1,2 П=5 0,24±0,05 п=6 н 22,2 226,1
лее низкое содержание НИ в перитонеальной жидкости. Наиболее интенсивное выведение НИ и НА с мочой, отражающее суммарное количество эндогенного образования их в течение суток, зафиксировано у мышей с АКЭ и у мышей с опухолями, получавших максимальную дозу ВСГ. Образование этих соединений превышает в 8,4 и в 8,9 раза уровень, определяемый у здоровых животных.
Проведено исследование на наличие антиокси-дантных свойств у водного экстракта грибов Шиитаке в системе in vitro (табл. 7). Принимая во внимание, что при опухолевом росте усилены свободнорадикальные процессы, можно ожидать, что вещества с выраженными антиоксидантными свойствами могут модулировать рост и развитие опухолей. Экстрагирование препарата Шиитаке горячей водой (90 °С), позволяет обогатить экстракт грибов водорастворимыми гетерополисахаридами, связанными с белком и состоящими из глюкоз-ных, маннозных, арабинозных и галактозных остатков, которые предположительно могут обладать антиоксидантными свойствами.
Исследование показало, что грибы Шиитаке при концентрации до 75 мкг/мл в реакционной смеси не проявляют антиоксидантных свойств, определяемых в модельной системе гемоглобин — люминол — пероксид водорода. При более высоких концентрациях (от 100 мкг/мл и выше) регистрируется задержка развития и одновременное снижение максимума ХЛ. При этом проявляется дозозависимое антирадикальное действие грибов, определяемое как по задержке развития ХЛ, так и по максимуму ХЛ отклика. Антирадикальная активность грибов, начиная от концентрации 100 мкг/мл и выше, находится в прямой зависимости от количества грибов в реакционной смеси и в пересчете на эквивалентный раствор аскорбиновой кислоты составляет
0,16-0,26 мкг/мл. Сравнивая с известными водорастворимыми антиоксидантами (аскорбиновая кислота, проантоцианидины, антоцианы, ликопин и др.), экстракт грибов можно отнести скорее к слабым антиоксидантам. В то же время, учитывая возможность поступления в организм человека в составе рациона значимых количеств (100 г и более), нельзя пренебречь их антирадиальными свойствами.
Таблица 7.
Антирадикальная активность водного экстракта грибов Lentinus edodes in vitro
(-) — не определяли.
* Приведены данные для 6 животных, объединенных в группу. ** р < 0,01 в сравнении с показателем для мышей интактной группы.
*** р < 0,01 в сравнении с показателем для мышей с АКЭ.
Концентрация грибов Lentinus edodes, мкг/мл Задержка развития ХЛ, с* Максимальное значение ХЛ, ударов/10 с х 103* Антирадикальная активность аскорбиновой кислоты, мкг/мл
Контроль 3 159 —
50 3 150 0
100 5 85 0,16
200 12 69 0,17
300 18 60 0,19
500 29 42 0,23
700 42 30 0,26
* Результаты приведены как среднеарифметические значения трех параллельных определений.
**
^нтроль — Hb+люминол+H2O2.
№1/том 5/2006
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
Таким образом, результаты экспериментального исследования показывают, что ВСГ Шиитаке вызывают замедление роста АКЭ как у мышей C57B1, так и у мышей-гибридов, причем этот эффект более отчетливо проявляется при введении максимальной дозы вещества (376 мг/кг) и составляет 53 %. Рост опухоли сопровождается увеличением количества лейкоцитов в крови с одновременным увеличением относительного количества нейтрофилов. У животных с опухолями усилены свободнорадикальные процессы со стимуляцией образования нитросоединений (НИ и НА), по-видимому, в основном за счет их образования в опухолевой ткани. Введение ВСГ здоровым животным приводило к увеличению общего количества клеток в перитонеальном содержимом, прежде всего, за счет лимфоцитов и макрофагов. Поступление ВСГ в организм мышей до трансплантации АКЭ и в течение роста опухоли нормализовало количественный показатель содержания клеток в перитонеальной жидкости и одновременно вызвало выраженную активацию макрофагов перитонеального содержимого.
В работе выявлено снижение содержания НИ в перитонеальной жидкости мышей с опухолями, что может являться следствием подавления продукции макрофагами и нейтрофилами оксида азота и его метаболитов под влиянием продуцируемых опухолью активных соединений. Ранее было показано, что оксид азота, секретируемый макрофагами и нейтрофилами, выполняет защитную роль, направленную на инактивацию чужеродных клеток, в т. ч. и опухолевых [8; 16]. ВСГ в дозе 376 мг/кг корригировала активность макрофагов по показателю образования оксида азота до уровня активности клеток у здоровых мышей. Что касается образования НИ и НА в опухолевой ткани, то ВСГ либо не влияла на содержание продуктов окисления оксида азота в опухоли, либо существенно снижала его.
ВЫВОДЫ
1. ВСГ Lentinus edodes (Шиитаке) достоверно замедляет рост подкожно перевитой аденокарциномы Эрлиха у мышей-самок C57B1 и F1(C57B1xCBA). Торможение роста АКЭ (53 %) более отчетливо проявляется при длительном профилактическом введении максимальной дозы ВСГ в течение 28 дней до и 36 дней после перевивки опухоли.
2. ВСГ Шиитаке обладает иммуномодулирующим действием, нормализуя общее количество иммуноком-петентных клеток в перитонеальном содержимом и усиливая функциональную активность перитонеальных макрофагов у мышей с опухолями.
3. У животных с АКЭ, независимо от введения ВСГ, повышено эндогенное образование нитросоединений: выведение НИ с мочой (отсутствующее в контроле) достигало 28,4 мкг/кг, а НА — увеличилось в 8,4-8,9 раза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Билынский Б. Т., Володько Н. А., Шпарык Я. В. Иммунологические механизмы естественной противоопухолевой резистентности. — Киев: Наукова думка, 1991. — 248 с.
2. Бронштейн И. Н., Семендяев К. А. Справочник по математике для инженеров и учащихся ВТУЗОВ. — М.: Наука, 1986. — С. 208.
3. Владимиров Ю. А., Азизова О. А., Деев А. И. и др. Свободные радикалы в живых системах. — Итоги науки и техники / Сер. «Биофизика». — М.: ВИНИТИ, 1991. — № 24. — С. 177.
4. Дерягина В. П. Экспериментальное изучение функциональной активности нейтрофилов и макрофагов в условиях воздействия нитрита натрия // Биомед. хим. — 2003. — Т. 49, № 1. — С. 19-26.
5. Дейчман Г. И. Естественный отбор и ранние изменения фенотипа опухолевых клеток in vivo: приобретение новых механизмов защиты // Биохимия. — 2000. — Т. 65, вып. 1. — С. 92-111.
6. Дейчман Г. И. Итоги науки и техники / Сер. «Онкология». — М.: ВИНИТИ, 1984. — № 13. — С. 46-70.
7. Купин В. И., Уткина М. В., 'Малахова Н. В. и др. Препараты растительного происхождения — перспективные индукторы цитокинов в организме в норме и патологии // Вестник ОНЦ АМН России. — 1994.
— № 2. — С. 12-19.
8. Проскуряков С. Я., Коноплянников А. Г., Иванников А. И. и др. Оксид азота в неопластическом процессе // Вопр. онкол. — 2001. — Т. 47, № 3. — С. 257-269.
9. Суслов А. П. Итоги науки и техники / Сер. «Онкология». — М.: ВИНИТИ, 1990. — № 19. — С. 167.
10. Теселкин Ю. О., Бабенкова И. В., Любиц-кий О. Б. и др. // Вопр. мед. хим. — 1997. — Т. 43, вып. 2. — С. 87-93.
11. Урбах В. Ю. Биометрические методы. — М.: Медицина, 1964. — 416 с.
12. Хаитов Р М., Пинегин Б. В., Истамов Х. И. Экологическая иммунология. — М.: ВНИРО, 1995. — 219 с.
13. Bang Luu // International Symposium on Ganoderma Lucidum, 4th, Seul, 1992. — P. 49-52
14. Heberer M., Ernst M., Harder F // Cancer Detect Preven. — 1983. — Vol. 6. — P. 273-280.
15. Kato T., Wokalek H., Schopf E. et al. Measurement of chemiluminescence in freshly drawn human blood // Klin. Wochenschr. — 1981. — Vol. 59. — P. 203-211.
16. Tamir S., Tanenbaum S. R. The role nitric oxide (NO) in the carcinogenic process // Biochim. Biophys. Acta. — 1996. — Vol. 14. — P. 31-36.
Поступила 30.06.2005.
