Действие фенольных производных бензимидазола на рост и ферментативную активность E. coli Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2013. № 9/1(110)

ХИМИЯ

УДК 547.78: 582.288

ДЕЙСТВИЕ ФЕНОЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА НА РОСТ И ФЕРМЕНТАТИВНУЮ

АКТИВНОСТЬ E. COLI

© 2013 З.П. Белоусова1 Н.А. Кленова, И.А Макеева2

Исследовано дозозависимое действие на рост и общую дегид-рогеназную, каталазную и сукцинатдегидрогеназную активность E. Coli фенольных производных бензимидазола, содержащих метиль-ную группу и гликозильный радикал (изученные концентрации — 50-200 мкг/мл). Все соединения оказывают дозозависимое бактериоста-тическое действие и вызывают напряжение метаболических процессов, что выражается в увеличении активных концентраций дегидроге-наз и каталазы. Наибольшим повреждающим воздействием обладает 4-(2-метил-1 Л-бензимидазол-1-илметил)фенил-2,3,4,6-тетра- О-ацетил-ß-D-глю-копиранозид в концентрации 200 мкг/мл.

Ключевые слова: бензимидазол, фенольные производные, E.coli, рост и ферментативная активность.

Введение

Производные бензимидазола и имидазола вследствие их структурной близости к пуринам, некоторым витаминным соединениям и ингибиторам цитохромов Р-450 проявляют высокую биологическую активность, давно нашедшую применение в фармацевтической практике. В частности, известны иммунотропное, противоопухолевое, противовоспалительное, противовирусное, фунгицидное, анальгетическое, гипотензивное и другие виды фармакологической активности [1; 2]. Практическая ценность производных бензимидазолов стимулирует синтез новых соединений, выявление взаимного влияния бензольного и имидазольного колец при наличии функциональных групп в разных положениях. Значительный интерес представляет также изучение действия гликозидов бензимидазолов.

Проведенные нами ранее исследования показали, что 4-(2-метил-1 Д-бензимидазол-1-илметил)фенол проявляет выраженные фунгио-статические свойства в концентрациях 150-250 мкг/мл, задерживая рост

хБелоусова Зоя Петровна (zbelousova@mail.ru), кафедра органической, биоорганической и медицинской химии Самарского государственного университета, 443011, Российская Федерация, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

2Кленова Наталья Анатольевна (klenova.ssu@yandex.ru), Макеева Ирина Александровна (biochemistry@rambler.ru), кафедра биологической химии Самарского государственного университета, 443011, Российская Федерация, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

плесневых грибов Aspergillus niger и Cladosporium herbarum в среднем на 50 %. При этом данное соединение не проявляло гемолитического действия, что свидетельствовало о его малой токсичности [3; 4].

Известно, что плесневые грибы и бактерии в природе эффективно конкурируют, синтезируя и выделяя антибиотики. Поэтому определенный интерес представляют исследования действия фунгиостатических соединений на рост и метаболические процессы бактерий.

Целью данной работы стало изучение дозозависимого влияния 2-(2-метил-1 Н-бензимидазол-1-илметил)фенола (I), 4-(1 Н-бензимидазол-1-илме-тил) фенола (II), 4-(2-метил-1Н-бензимидазол-1-илметил)фенола (III), 4-(2-ме-тил-1 Н-бензимидазол-1-илметил)фенил-2,3,4,6-тетра- О-ацетил- ^-D-глюкопирано-зида (IV) на рост и ферментативную активность E. coli.

Материалы и методики исследования

Синтезы 2-(2-метил-1 Н-бензимидазол-1-илметил)фенола (I), 4-(1 Н-бензимида-зол-1-илметил)фенола (II), 4-(2-метил-1Н-бензимидазол-1-илметил)фенола (III), 4-(2-метил-1Н-бензимидазол-1-илметил)фенил-2,3,4,6-тетра-0-ацетил-в-О-глюкопи-ранозида (IV) описаны в [4; 5].

Дозы воздействия соединений составили 50, 100, 150, 200 мкг/мл диметилсуль-фоксида (БМБО). Контролем служило воздействие растворителя (БМБО).

НО

ш

Рис. 1. Структурные формулы изученных производных бензимидазола (Ас —

ацетильный радикал)

Определение характера роста E. Coli. Выращивание E. coli М-17 осуществляли на агаризованной среде LB в чашках Петри. Растворы соединений разной концентрации в количестве 100 мкл вносили в лунки d = 5 мм, в контрольные пробы вносили по 100 мкл DMSO по 8 повторов для каждой концентрации и каждого соединения. После суточного роста при 37 °C измеряли зоны ограничения роста (мм).

Определение общей дегидрогеназной активности E. coli. Общую дегидрогеназ-ную активность (ОДГ) определяли с помощью окислительно-восстановительного

индикатора — 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (3 %-ного водного раствора), который, восстанавливаясь, окрашивает исследуемый раствор в розовый цвет [6].

В 3 мл суточного инокулята E.coli в среде LB добавляли 0,2 мл 2,3,5-трифе-нилтетразолиум хлорида, анализируемое вещество добавляли в зависимости от дозы воздействия, при 50 мкг/мл — 30 мкл, при 100 мкг/мл — 60 мкл, при 150 мкг/мл — 90 мкл, а при 200 мкг/мл — 120 мкл. В контрольные колбы добавляли сходное с опытом количество DMSO. Инкубировали 24 ч при 37 °C. Затем измеряли оптическую плотность при длине волны 492/630 нм на приборе ИФА START FAX 3200 (USA).

Активность ДГ = оптическая плотностьх 1000 (у. е.)

Подготовка гомогената бактерий для определения активностей сукцинатде-гидрогеназы и каталазы. 3 мл инокулята E.coli в среде LB гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера с добавлением 0,2 мл 0,2 %-ного тритона Х-100 в течение 3-х минут. Оставляли для экстрагирования ферментов на 2 ч при 12 ° C. Центрифугировали в режиме 650g, 10 мин при 0 °C для удаления фрагментов и неразрушенных клеток. В полученном супернатанте определяли активность ферментов. Для расчета удельной активности проводили определение содержания белка по методу Лоури.

Метод определения каталазной активности. В 2 мл 0,03 %-ного раствора перекиси водорода добавляли 0,1 мл гомогената бактерий, анализируемое вещество в опытные и растворитель в контрольные пробы в соответствии с дозой и разведением. Пробы оставляли на 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 4 %-ного молибдата аммония. В холостые пробы молибдат аммония добавляли сразу. Интенсивность окраски измеряли на спектрофотометре СФ-46 (Россия), длина волны 410 нм.

Активность рассчитывали по формуле:

А мкат/мг белка в мл гомогената = (Ехол. — Еоп.) • 1000/ 22,2 • 600 х х белок (мг/мл) [7].

Метод определения активности сукцинатдегидрогеназы. Инкубационная смесь состояла из 2,5 мл 100 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 7,8; 0,2 мл 2 мМ фер-рицианида калия и 0,1 мл гомогената. Анализируемое вещество в опытные и растворитель в контрольные пробы добавили в соответствии с дозой и разведением. Реакцию запускали добавлением 0,2 мл 10 мМ раствора сукцината натрия. Регистрировали изменение оптической плотности в течение 2 минут (А 420 нм, СФ-46, Россия).

Активность рассчитывали по формуле:

А(мМ/мин на мг белка в мл гомогената) = ДЕ • 1000 • 3,0 / 2 • 10~3-0,1 х х белок (мг/мл) [8].

Для статистической обработки результатов использовали критерий Стьюдента. Во всех случаях эмпирические выборки соответствовали нормальному распределению, а дисперсии групп сравнения отличались незначительно (для р = 0,05) [9]. Расчеты проводили с использованием бесплатного пакета программ SPSS 14.

Результаты и их обсуждение

У всех изученных соединений обнаружено бактериостатическое действие, так как регистрировались только зоны ограниченного роста, а не полного его отсутствия (в зонах присутствовали отдельные точечные колонии). Наибольший ингибирующий эффект у 2-(2-метил-1 Д-бензимидазол-1-илметил)фенола (I),

4-(2-метил-1Н-бензимидазол-1-илметил)фенола (III) и 4-(2-метил-1 Н-бензимида-зол-1-илметил)фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-,3-В-глк>копиранозида (IV) проявляется в дозе 200 мкг/мл. У 4-(1Н-бензимидазол-1-илметил)фенола (II) критической концентрацией оказывается 150 мкг/мл, увеличение дозы до 200 мкг/мл не усиливает ингибирующий эффект (рис. 2).

□50 мкг/мл В100 мкг/мл □ 150 мкг/мл □200 мкг/мл

контроль I II III IV

Рис. 2. Зоны ограничения роста E. Coli при выращивании на твердой среде с добавлением производных адамантана в лунки. Достоверность различий с контролем для всех доз от Р < 0,05 до Р<0,01.

Максимальное увеличение зоны ограничения роста наблюдали при действии III и IV в дозе 200 мкг/мл — 207 и 222 % соответственно. В концентрации 150 мкг/мл больший бактериостатический эффект оказали производные II и III (рис. 2), отличающиеся друг от друга только наличием метильной группы (III). Четко выраженный дозозависимый эффект выявили у соединения I, имеющего метильную группу в бензимидазольном кольце, как и III, но оксиг-руппу в ортоположении фенильного фрагмента. Однако максимально изученная доза 2-(2-метил-1Н-бензимидазол-1-илметил)фенола давала достоверно меньший бактериостатический эффект, чем 4-(2-метил-1Н-бензимидазол-1-илметил)фенол и 4-(2-метил-1Н-бензимидазол-1-илметил)фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-^-Б-глюко-пиранозид.

Воздействие всех соединений сопровождалось увеличением у E. Coli общей де-гидрогеназной активности (ОДА), сукцинатдегидрогеназной и каталазной активности клеток. Это свидетельствует об ответном напряжении метаболических процессов, причем практически во всех случаях не прослеживается четкой зависимости эффекта активации от дозы соединения, хотя наибольший процент повышения выявляется при действии максимально используемой дозы — 200 мкг/мл, кроме ОДА при действии соединения III (см. таблицу).

Наибольший эффект увеличения активности при культивировании в жидкой среде так же, как и эффект подавления роста на твердой среде, характерен для 4-(2-метил-1Н-бензимидазол-1-илметил)фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-^-Б-глюко-пиранозида (таблица). Это может быть связано с облегчением поступления соединения внутрь клеток за счет присутствия гликозидного радикала.

Наибольшие изменения характерны для сукцинатдегидрогеназной активности, фермента, чрезвычайно важного для окислительных процессов кишечной палоч-

Таблица

Ферментативная активность клеток E. coli в процентах от контроля при действии различных концентраций фенольных производных

бензимидазола*

Концентрация 50 мкг/мл 100 мкг/мл 150 мкг/мл 200 мкг/мл

Общая дегидрогеназная активность, %

I 40 9 9 62

II 64 12 12 144

III 59 41 9 15

IV 22 35 20 54

Сукцинатдегидрогеназная активность, %

I 53 55 54 60

II 64 60 64 72

III 87 83 93 94

IV 104 102 105 160

Каталазная активность, %

I 36 25 25 48

II 37 25 26 40

III 41 38 34 49

IV 45 29 50 82

* Примечание. Все отклонения от контроля достоверны с уровнями значимости от Р < 0,05 до Р < 0,01.

ки, использующей, кроме кислородного, фумаратное дыхание. Образующийся при этом сукцинат окисляется в цикле трикарбоновых кислот и стимулирует как кислородное дыхание, так и окислительное фосфорилирование. Полученные данные свидетельствуют о том, что данные производные не являются ингибиторами ферментов окислительного метаболизма E. Coli, а служат причинами развития окислительного стресса и гибели части клеток из-за чрезмерного напряжения метаболизма.

Литература

[1] Навашин С.П. Антифунгальная химиотерапия. Успехи и проблемы // Антибиотики и химиотерапия, 1998. № 8. С. 3-6.

[2] Нифонтов В.И., Бельская Н.П. Производные имидазола. Синтез и противоопухолевая активность имидазола и родственных веществ // Химико-фармацевтический журнал. 1986. Т. 20. № 3. С. 277-281.

[3] Действие 4-(2-метил-1Н-бензимидазол-1-илметил)фенола на показатели роста грибов видов Aspergillus niger и Cladosporium herbarum / Е.Ю. Атлашова [и др.] // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2010. № 9. C. 33-36.

[4] Белоусова З.П., Осянин В.А., Кленова Н.А. Гемолитическая активность 4-(1 Н-бензимидазол-1-илметил)- и 4-(2-метил-1 Н-бензимидазол-1-илметилфе-нолов // Хим.-фарм.журнал. 2004. Т. 37. № 5. С. 38-41.

[5] Осянин В.А., Пурыгин П.П., Белоусова З.П. Синтез и гликозилирование 4-(1Н-азол-1-илметил)фенолов // Известия вузов. Сер.: Химия и химическая технология. 2003. Т. 46. Вып. 1. С. 138-141.

[6] Романенко М.А. Экология микробиология пресных водоемов. Л.:Наука, 1974. 192 с.

[7] Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк [и др.] // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16-19.

[8] Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхарда. М.: Мир, 1984. Т. 2. С. 396-397.

[9] Леонов В.П., Ижевский П.В. Об использовании прикладной статистики при подготовке диссертационных работ по медицинским и биологическим специальностям // Бюл. ВАК РФ. 1997. № 5. С. 56-61.

Поступила в редакцию 4/II/2013; в окончательном варианте — 4/II/2013.

EFFECT OF PHENOLIC DERIVATIVES OF BENZIMIDAZOLE ON GROWTH AND ENZYME ACTIVITY OF E. COLI

© 2013 Z.P. Belousova? N.A. Klenova, I.A. Makeeva4

Dose-response stady (concentration of 50-200 mkg/ml) effect on growth total degidrogenase, catalase, sukcinatdegidrogenase activity of E. COLI phenolic benzimidazole derivatives containing a methyl group and the glycoside radical is researched. All compounds have dozo-respouse bacteriostatic effect and cause metabolic stress, resulting in higher concentrations of active degidrogenase and catalase. Most damaging effect has 4(2-methyl-1fi-benzimidazol-ylmethyl)phenyl-2,3,4,6-tetra-O-azethyl-^-D-glucopyranozyd in a concentration of 200 mkg/ml.

Key words: phenolic benzimidazole derivates, E.coli, growth and enzyme activity.

Paper received 4/II/2013. Paper accepted 4/II/2013.

3Belousova Zoya Petrovna (zbelousova@mail.ru), the Dept. of Organic, Bioorganic and Medical Chemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russian Federation.

4Klenova Natalia Anatolyevna (klenova.ssu@yandex.ru), Makeeva Irina Alexandrovna (biochemistry@rambler.ru), the Dept. of Biological Chemistry, Samara State University, Samara, 443011. Russian Federation.