CC BY
83
Селезнева Е.С., Белоусова З.П., Моисеева Л.М.
Самарский государственный университет E-mail: catana7@yandex.ru
ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ СИНТЕТИЧЕСКИХ ФЕНОЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА
Изучена генотоксичность для Allium cepa бензимидазолилметилфенолов и 2-метил бензи-мидазолилметилфенолов. Показано, что она зависит от положения ОН-группы в бензольном кольце, в частности 4-замещенные фенолы генотоксичнее 2-замещенных. Обсуждаются возможные механизмы действия этих соединений.
Ключевые слова: бензимидазол, фенолы, генотоксичность, митотический индекс, хромосомные аберрации, Allium cepa.
Биологическая активность широко распространенных в природе различных органических фенолов часто проявляется в токсичности для растений [3, 4, 5, 8]. Это привело к необходимости изучения механизмов их действия [12].
Многие из них являются регуляторами процессов роста и развития и участвуют в разнообразных окислительно-восстановительных процессах растительных клеток. Характер действия этих соединений на растения определяется расположением гидроксильных групп в бензольном кольце относительно заместителя [6, 10].
Несмотря на многочисленные исследования, вопросы, связанные с ролью строения фенольных производных в развитии мутагенного ответа, остаются открытыми. Полученная информация позволит оценить и вред, наносимый антропогенными фенолами, и процессы, протекающие в популяциях растений, подвергнутых интенсивному антропогенному воздействию.
Целью данного исследования является анализ цитогенетической активности фенольных производных бензимидазола.
Материал и методы
Синтез соединений, использованных в работе, осуществлен по методике, описанной в [9]. Их общая формула представлена на рисунке 1.
Семена Allium cepa, рекомендованного ВОЗ в качестве тест-объекта для анализа мутагенности ксенобиотиков, проращивали в термостате при температуре +22 оС в течение 5 суток. Для этого в чашки Петри, содержащие растворы соединений I-IV в концентрациях 0,001 и 0,01 мг/мл. Данные концентрации не вызывали плазмолиз в клетках эпидермиса лука в течение 30 минут. Контролем служили семена, проро-щенные в растворителе. В качестве растворителя использовали 5% изопропиловый спирт.
Исследовали влияние фенольных соединений (I-IV) на всхожесть семян Allium cepa и на рост корней относительно контроля путем подсчета отношения длины корней на 5-й день роста проростков в опыте к длине корней в контроле за это же период.
По стандартной методике готовили давленные и окрашенные ацетокармином препараты меристемы корней [2]. Для подсчета митотического индекса анализировали 1000 клеток для каждого опыта, для оценки способности индуцировать хромосомные аберрации анализировали 900 ана-телофаз [2].
Достоверность различий между действием соединений оценивали с помощью полного двухфакторного дисперсионного анализа. Для выявления связей между физико-химическими параметрами соединений, их токсичностью и мутагенностью был применен корреляционный анализ [7].
Результаты и обсуждения
Проведенный полный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что фенольные производные бензимидазола ингибируют всхожесть семян Allium cepa (рис. 2). С увеличением концентрации растет их токсичность (p<0,001),
(I) - 4- [(1Я-бензимидазол-1-ил)метил]фенол (R1- H, R2-OH, R3- H), (II) - 2- [(1Я-бензимидазол-1-ил)метил]-фенол (R1- H, R2- H, R3 - OH), (III) - 4- [(2метил-1Я-бензимидазол-1-ил)метил]фенол (R1- CH3, R2- OH, R3 - H), (IV) -2-[(2-метил-1Я-бензимидазол-1-ил) метил]-фенол (R1- CH3, R2- H, R3 - OH).
Рисунок 1. Общая формула 2- и 4-(1Я-азол-1-илметил)фенолов I-IV
R
2
IV
,
1—1 1
" ^
1 1 1
■ ь+н^
20
40 60
Всхожесть в % И 0.01 ■ 0.001 ■ контроль
100
Рисунок 2. Влияние фенольных производных бензимидазола (I-IV) на всхожесть семян Allium cepa
длина корней относительно контроля
И 0.01 ■ 0.001 ■ контроль
Рисунок 3. Влияние фенольных производных бензимидазола (I-IV) на относительную длину корней Allium cepa
IV
200
700
300 400 500 600
величина митотического индекса в промилле Н0.01 ■ 0.001 В контроль
Рисунок 4. Влияние фенольных производных бензимидазола (I-IV) на величину митотического индекса корневой меристемы Allium cepa
однако они достоверно не различаются по данному типу биологической активности.
Исследуемые фенольные соединения подавляли рост корней лука (рис. 3). Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что с увеличением концентрации растет токсичность растворов (p<0,001), соединения достоверно различаются по токсичности (p<0,001), производные 2-метилбензимидазола (III-IV) токсичнее своих аналогов производных бензимидазола (I-II). Соединения I и III, содержащие ОН-группу в пара-положении, достоверно токсичнее соединений II и IV, с ОН-группой в орто-положении.
Ростовые процессы зависят и определяются пролиферативной активностью меристематичес-кой ткани, поэтому мы изучили влияние фенольных производных на величину митотического индекса корневой меристемы Allium cepa, который является показателем цитотоксичности. Результаты исследований представлены на рис. 4.
Были выявлены следующие тенденции в действии соединений, в концентрации 0,001 мг/мл воздействие фенолами (II-IV) приводит к увеличению величины митотического индекса, при увеличении концентрации наблюдается тенденция подавления пролиферативной активности, что выражается в уменьшении митотического индекса по сравнению с контролем (p<0,01).
Это обстоятельство привело к необходимости исследования относительной продолжительности фаз митоза в меристемах, подвергнутых воздействию исследованными соединениями (рис. 5).
Оценку влияния соединений на определенные стадии митоза производили, рассчитывая относительную продолжительность фаз митоза по формуле:
FM
tFM =
где ЬВЫ - относительная длительность исследуемой фазы митозы,
^ бы - число клеток исследуемой фазы митоза,
^ N - сумма всех делящихся клеток.
Как видно из представленных результатов, фенольные производные бензимидазола и 2-метилбензимидазола отличаются механизмом действия. Фенольное производное бензимидазола, имеющее ОН-группу в шра-положе-
I
0
II
I
нии, вызывает один блок на стадии анафазы, его аналог с ОН-группой в орто-положении -вызывает блоки как на стадии анафазы в низкой концентрации, так и на стадии метафазы и анафазы в более высокой концентрации. Фенольные производные 2-метилбензимидазола независимо от концентрации индуцируют блоки на стадии метафазы и телофазы.
Соединения, способные изменять относительную продолжительность фаз митоза, вмешиваются либо в метаболизм пуринов, либо в метаболизм веществ, определяющих развитие и формирование клеточного аппарата деления, так или иначе способны индуцировать мутагенный ответ. Поэтому с помощью метода ана-те-лофазного анализа мы проверили способность соединений индуцировать хромосомные аберрации в клетках корневой меристемы лука. Результаты суммированы на рис. 6.
Как видно из представленных результатов, все соединения проявили мутагенную активность, вызывая различного рода хромосомные аберрации, выражающиеся в появлении аберраций типа «мосты» простые и двойные, «обломки» и «отставания». Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что соединения, содержащие ОН-группу в пара-положении, достоверно мутагеннее своих аналогов с ОН-группой в ортоположении (р<0,01). С ростом концентрации достоверно растет количество индуцированных аберрантных ана-телофаз (р<0,01).
Полученные результаты согласуются с ранее проведенными исследованиями, которые показали, что воздействие экзогенными фенолами усиливает цитоплазматическую активность фенолоксидаз [12], что приводит к окислению фенолов, превращая их в токсиканты. Проведенные нами исследования позволяют утверждать, что экзогенные синтезированные фенолы превращаются в генотоксиканты.
Анализируя полученные результаты, можно отметить следующее: если роль природных фенолов многопланова и незаменима [1, 4, 5], то экзогенные фенолы, вмешиваясь в метаболизм, нарушают сложную регуляцию растущего организма растений и способны выступать и как клеточные яды, и как мутагены, снижая механизмы адаптациогенеза растений, подвергнутых их воздействию.
Проведенные нами исследования не позволяют определить механизмы вмешательства син-
тезированных нами фенолов в клеточный метаболизм, но можно предположить, что они могут активно взаимодействовать с ауксиноксидазами и цитокининоксидазами. В пользу этого свидетельствует тот факт, что фенольные соединения, имеющие ОН-группу в пара-положении, проявляют более сильную цитогенетическую активность, чем их аналоги с ОН-группой в орто-по-
0.01
ЕЕ
0.001
0.01
0.001
сонтроль (!!-!У)
0.01
0.001
40% 50% 60% 70% 80% 90% 100
□ профаза ЕЭ метафаза Ш анафаза Ш телофаза
Рисунок 5. Влияние растворов фенольных производных бензимидазола (І-ІУ) разных концентраций на относительную продолжительность фаз митоза
5 10 15 20 25
количество аберрантных ана-телофаз в %
10.01 ■ 0.001 В контроль
Рисунок 6. Мутагенность фенольных производных бензимидазола (1-1У)
ложении. Это совпадает с данными других авторов, показавших, что введение ОН-группы в параположение придает фенольному соединению свойства антагониста в-индолилуксусной кислоты [6]. Антагонизм проявляется за счет повышения активности оксидаз, разрушающих в-индо-лилуксусную кислоту. Если ОН-группа находится в орто- или мета- положении, активность фенола резко снижается или исчезает [14].
Также было показано, что в некоторых тканях активность цитокинин оксидазы фермента, участвующего в катаболизме цитокининов, определяющих пролиферативную активность тканей, может регулироваться посредством ауксинов [13]. Некоторые природные производные фенола повышают активность цитокининокси-дазы, так Wang и Letham обнаружили, что кофейная кислота (3,4-дигидрокси-транс-корич-ная кислота) стимулирует активность цитоки-
ниноксидазы [15]. Ванилиновая и синаповая кислоты при этом были менее эффективны. Другие же фенольные кислоты, такие как пара-кумариновая, 3,4-дигидроксибензойная и феруловая кислоты, не оказывали стимулирующего действия на цитокининоксидазы. Синтетическое соединение 2,6-диметоксифенол повышает активность фермента в 50 раз [11].
Таким образом, можно утверждать, что все фенольные соединения взаимодействуют с ферментами, участвующими в метаболизме фитогормонов, и именно структура фенола обеспечивает эффективное взаимодействие активных центров ферментов с субстратами - фенолами.
Поскольку многие фитогормоны способны воздействовать на активность генетического аппарата растений, то неудивительно, что фенольные соединения, взаимодействующие с ними, проявляют мутагенную активность.
Список использованной литературы:
1. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. М.: Мир, 1977. 239 с.
2. Гостимский С.А., Дьяков М.И., Ивановская Е.В., Монахова М.А. Практикум по цитогенетике / С.А. Гостимский., М.И. Дьяков, Е.В. Ивановская, М.А. Монахова. М.: МГУ, 1974. 275 с.
3. Гродзинский А.М. Аллелопатия растений и почвоутомление. К.: Наукова думка, 1991. 294 с.
4. Запрометов М. Н. Фенольные соединения растений и их биогенез // Итоги науки и техники. Сер. биол. химия. М., 1988. Т. 27. 188 с.
5. Запрометов М.Н. О функциональной роли фенольных соединений в растениях // Физиология растений, 1992. Т. 39. №6. С. 1197-1207.
6. Кефели В.И. Природные ингибиторы роста // Физиология растений, 1997. Т. 44. №3. С. 471-480.
7. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.
8. Мороз П.А., Комиссарченко Н.Ф. Аллелопатическая активность некоторых фенольных соединений // Роль токсинов растительного и микробиального происхождения в аллелопатии. К.: Наукова думка, 1983. С. 118-122.
9. Осянин В.А., Пурыгин П.П., Белоусова З.П. Синтез и гликозилирование 4-(1Я-азол-1-илметил)фенолов // Известия вузов. Сер. химия и химическая технология. 2003. - Т. 46, вып. 1.- С. 138-141.
10. Рощина В.Д., Рощин В.В. Выделительная функция высших растений./ В.Д.Рощина, В.В. Рощин. М.: Наука, 1989. 173 с.
11. Armstrong D.J. Cytokinin oxidase and regulation of cytokinin degradation// D.W.S.Mok and M.C. Mok (eds.). Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. CRC Press, Boca Raton, FL, 1994. P. 139-154.
12. Blum U., Shafer S.R., Lehman M.E. Evidence for inhibitory allelopathic interactions envolving phenolic acids in field soils: Concepts vs. experimental model // Crit. Rev. Plant., 1999. Vol. 18. P. 637 -693.
13. Burch L.R., Horgan R. The purification of cytokinin oxiadse from Zea mays kernels. // Phytochemistry. 1989. 28(5). P. 1313-1319.
14. Gaspar Th., Pennel C., Thorpe I., Greppin H. Peroxidases. / Th. Gaspar, C. Pennel, I. Thorpe, H. Greppin. Geneve: Univ. of Genev. 1982. 324 p.
15. Wang J., Letham D.S. Cytokinin oxidase-purification by affinity chromatography and activation by caffeic acid. // Plant Science, 1995. V. 112. P. 161-166.
Сведения об авторах: Селезнева Екатерина Сергеевна, доцент кафедры зоологии, генетики и общей экологии Самарского государственного университета, канд. биол. наук, e-mail: catana7@yandex.ru Белоусова Зоя Петровна, доцент кафедры органической, биоорганической и медицинской химии Самарского государственного университета, канд. хим. наук, e-mail: zbelousova@mail.ru Моисеева Людмила Михайловна, студентка 6 курса вечернего отделения кафедры органической, биоорганической и медицинской химии Самарского государственного университета
Selezneva E.S., Belousova Z.P., Moiseeva L.M.
Genotoxicity of synthetic phenolic derivatives of benzimidazole
We studied genotoxicity for Allium sulfur benzimidazolilmethylphenol and 2-methyl benzimidazolilmethylphe-nols. It is shown that it depends on the position of the OH group in the benzene ring, in particular, 4-substituted phenols are more genotoxic than 2-substituted ones. Possible mechanisms of action of these compounds are discussed.
Keywords: benzimidazole, phenols, genotoxicity, mitotic index, chromosomal aberrations, Allium sulfur
