Действие фарнезола на чувствительность микроорганизмов из бактериально-грибковой биопленки к антимикробным средствам in vitro Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

RUDN Journal of Agronomy and Animal Industries. ISSN 2312-797X (Print). ISSN 2312-7988 (Online) 2024,19 (2): 370-382 Вестник РУДН. Серия: АГРОНОМИЯ И ЖИВОТНОВОДСТВО http://agrojournal.rudn.ru

DOI: 10.22363/2312-797X-2024-19-2-370-382

EDN:HBBYLN

УДК 619:636.8:615

Научная статья / Research article

Действие фарнезола на чувствительность микроорганизмов из бактериально-грибковой биопленки к антимикробным средствам in vitro

Н.П. Сачивкина1 О.В. Нечет1 , И.С. Гашимова1 , Д.В. Кондратьева2 , Н.В. Сахно3

Российский университет дружбы народов, г. Москва, Российская Федерация 2Частный конный ветеринарный врач Москвы и Московской области, г. Москва, Российская

Федерация

3Орловский государственный аграрный университет им. Н.В. Парахина, г. Орел, Российская

Федерация СЕЗ [email protected]

Аннотация. Исследовано 2 микроорганизма — Staphylococcus aureus и Candida albicans, выделенных из смешанной бактериально-грибковой биопленки раны лошади. В лаборатории определяли профиль резистентности этих клинических штаммов к антимикробным средствам стандартным диско-диффузионным методом на плотной питательной среде. Далее к дискам добавляли Фарнезол в концентрациях 12,5...200 мкМ/мл (опыт) или физиологический раствор (контроль). В ходе исследования показано, что в большинстве случаев при добавлении Фарнезола регистрируется увеличение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам и нет случаев отрицательного влияния Фарнезола на чувствительность. Причем в процентном соотношении лучшие результаты синергизма отмечены в сочетании с противогрибковыми препаратами, нежели с антибактериальными. Есть и уникальный показатель: чувствительность C. albicans к Нистатину и Миконазолу выросла вдвое при добавлении Фарнезола в концентрации 25.200 мкМ/мл. Кроме того, доказано что клинический штамм золотистого стафилококка был полностью резистентен к пенициллину, а при добавлении Фарнезола чувствительность появилась. Аналогично изначально наблюдалась резистентность штамма кандиды к Амфотери-цину В, а с Фарнезолом даже в небольших концентрациях этот препарат стал работать. Данные in vivo свидетельствуют об адъювантном эффекте Фарнезола в сочетании с большинством антибиотиков и/или противогрибковых препаратов.

© Сачивкина Н.П., Нечет О.В., Гашимова И.С., Кондратьева Д.В., Сахно Н.В., 2024

(^©П This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License https://creativecommons.Org/licenses/by-nc/4.0/legalcode

Ключевые слова: Staphylococcus aureus, Candida albicans, рана лошади, антибиотики, противогрибковые препараты

Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Коммерческий препарат Фарнезол (Sigma-Adrich, Германия) приобретался на собственные средства Н.П. Сачивкиной, поскольку является единственным очищенным препаратом без дополнительных примесей.

Вклад авторов: Н.П. Сачивкина и Д.В. Кондратьева придумали идею и дизайн исследования; О.В. Нечет и И.С. Гашимова осуществляли сбор и обработку материалов, выполняли анализ полученных данных; Н.П. Сачивкина и Н.В. Сахно написали текст статьи. Все авторы ознакомлены с окончательной версией статьи и одобрили ее.

История статьи: поступила в редакцию 17 апреля 2024 г., принята к публикации 8 мая 2024 г.

Для цитирования: Сачивкина Н.П., Нечет О.В., Гашимова И.О., Кондратьева Д.В., Сахно Н.В. Действие фарнезола на чувствительность микроорганизмов из бактериально-грибковой биопленки к антимикробным средствам in vitro // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Агрономия и животноводство. 2024. Т. 19. № 2. C. 370—382. doi: 10.22363/2312-797X-2024-19-2-370-382

The effect of Farnesol on sensitivity of microorganisms from bacterial-fungal biofilm to antimicrobial agents in vitro

Nadezhda P. Sachivkina1 Oksana V. Nechet1 , Iman S. Gashimova1 , Diana V. Kondratev* Nikolay V. Sakhno' ®

:RUDN University, Moscow, Russian Federation 2Private equine veterinarian in Moscow and Moscow region, Moscow, Russian Federation 3Orel State Agrarian University named after N.V. Parakhin, Orel, Russian Federation

CE3 [email protected]

Abstract. Two microorganisms — Staphylococcus aureus and Candida albicans isolated from a mixed bacterial-fungal biofilm of horse wound were studied. Resistance profile of these clinical strains to antimicrobial agents was determined using standard disc diffusion method on solid nutrient medium in the laboratory. Next, Farnesol was added to the disks at concentrations of 12.5...200 pM/ml (experiment) or physiologic saline solution (control). The experiments showed that in most cases addition of Farnesol increased sensitivity of microorganisms to antimicrobial drugs, and there were no cases of a negative effect of Farnesol on sensitivity. Moreover, the best results of synergism were observed in combination with antifungal drugs rather than with antibacterial drugs. There were also unique indicators: sensitivity of C. albicans to Nystatin and Miconazole doubled after the addition of Farnesol at a concentration of 25.200 pM/ml. Furthermore, it was proved that the clinical strain of S. aureus was completely resistant to penicillin. And sensitivity appeared after the addition of Farnesol. A similar situation was with the Candida strain: resistance to Amphotericin B was initially observed, and in combination with Farnesol, this drug began to work even in small concentrations. In vivo data indicate that Farnesol has an adjuvant effect in combination with most antibiotics and/or antifungal drugs.

Keywords: Staphylococcus aureus, Candida albicans, horse wound, Farnesol, antibiotics, antifungal drugs.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interest. The commercial drug Farnesol (Sigma-Adrich, Germany) was purchased by Sachivkina N.P. since it is the only purified drug without additional impurities.

Authors contribution. Sachivkina N.P. and Kondrateva D.V. developed and designed the experiments; Nechet O.V. and Gashimova I.S. collected and analyzed the data; Sakhno N.V. wrote the paper.

Article history: Received: 17 April 2024. Accepted: 8 May 2024.

For citation: Sachivkina NP, Nechet OV, Gashimova IS, Kondrateva DV, Sakhno NV. The effect of Farnesol on sensitivity of microorganisms from bacterial-fungal biofilm to antimicrobial agents in vitro. RUDN Journal of Agronomy and Animal Industries. 2024;19(2):370—382. doi: 10.22363/2312-797X-2024-19-2-370-382

Введение

В научной литературе пристальное внимание уделяется изучению лекарственных средств растительного происхождения и возможности их использования для терапии инфекционных заболеваний [1, 2]. Впервые о фарнезоле в микробиологии заговорили в 2001 г. [3]. Оказалось, что этот сесквитерпен с алифатической углеродной цепью является одной из молекул кворума дрожжеподобных грибов (ДПГ) Candida albicans — важного патогена человека и животных. Фарнезол способен блокировать трубкообразование у этих грибов и развитие их биопленок [4]. Позже появились сообщения об антигрибковых свойствах фарнезола по отношению к плесневым грибам Aspergillus nidulans и Aspergillus fumigatus [5, 6]. В следствии этих новостей возобновился интерес к фарнезолу и родственным ему молекулам, например, 2,3-дигидрофарнезолу, как потенциальным новым противогрибковым препаратам. Например, Дж. Браш с соавт. в 2014 г. подробно описали их эффективность против дерматофитов [7], а А. Катрагко в 2015 г. продемонстрировал их синергетическую эффективность с флуконазолом, амфотерицином B и микафунгином в биопленках C. albicans [8]. В 2020 г. Ф. Нэджи с соавт. сообщили, что фарнезол подавляет рост и способность Candida auris образовывать биопленки [9]. В 2022 г. Дж. Деккерова и др. подтвердили синергетический эффект фарнезола с флуконазолом на модели C. auris [10]. А в 2023 г. Ф. Никуманэш с соавт. подтвердили синергизм между фар-незолом с флуконазолом или итраконазолом, в результате чего восстанавливалась исходная чувствительность устойчивых к азолу C. albicans и C. parapsilosis [11].

Но фокусироваться только на биопленках грибов было бы неправильно, так как чаще всего в организме биопленки состоят из смешанных видов микробов. Например, кандиды очень часто в качестве партнера выбирают стафилококков [12]. Их совместная работа обычно является показателем неблагоприятного исхода. Особенно восприимчивы к полимикробным биопленкам пациенты с ослабленным иммунитетом. Логично, что в 2006 г. появилась работа [13], подтверждающая антибактериальное действие фарнезола по отношению к золотистому стафилококку. Но не это самое главное. Ведь антибактериальные свойства фарнезола как компонента растительного происхождения давно известны фармацевтической промышленности и активно используются в косметологической продукции. Главное, что было доказано в этой работе, что фарнезол повышал чувствительность S. aureus к противомикробным препаратам. Например, резистентные штаммы стафилококков к гентамицину становились чувствительными к нему при добавлении фарнезола в концентрации 150 цМ. А противомикробный эффект всех антибиотиков, к кото-

рым штаммы были и так чувствительны, увеличивался в несколько раз. Эффект синергизма фарнезола и гентамицина повторился и на стафилококковых биопленках. Комбинированный эффект гентамицина в дозе, в 2,5 раза превышающей минимальную подавляющую концентрацию, и фарнезола в концентрации 100 цМ позволил снизить бактериальные популяции более, чем в 2 раза [13]. Однако эти исследования проводились с применением однократной дозы фарнезола и гентамицина на 24-часовых сформированных биопленках. Учитывая тот факт, что обычное лечение большинства биопленочных инфекций заключается в пролонгированном приеме или введении антибиотиков в течение нескольких дней или даже недель, фарнезол может демонстрировать еще более высокую эффективность in vivo.

Механизм действия фарнезола на Staphylococcus aureus был раскрыт японскими учеными в 2016 г. Они исследовали действие фарнезола 100 цМ на цито-плазматическую мембрану бактериальных клеток. Концентрация ионов калия в живой бактериальной клетке выше, чем вне клетки. А концентрация ионов натрия, наоборот, снаружи клетки выше, чем в внутри. Изменения концентрации ионов калия и натрия в бактериальной суспензии наблюдались при добавлении фарнезола. Концентрация ионов калия повышалась, а концентрация ионов натрия снижалась. Их различия были статистически значимыми (р < 0,05). Эти результаты показали, что ионы калия, существующие в бактериальной клетке, вытекали наружу, а ионы натрия, находящиеся снаружи, текли внутрь клетки. Это означает, что бактериальная цитоплазматическая мембрана была повреждена и потеряла свой гомеостаз. Соответственно, фарнезол проникает в цитоплазматическую мембрану клеток S. aureus и вызывает ее полное или частичное разрушение. Этот факт был подтвержден обратным опытом: эффекты фарнезола уменьшались при добавлении каротиноида, который был стабилизирующим «заживляющим» препаратом для билипидного слоя [14].

Но самое интересное явление было раскрыто М.Дж. Варго с соавт. в 2006 г. Их исследования были направлены на выяснение потенциальной роли фарнезола как молекулы кворума в управлении динамикой между C. albicans и S. aureus внутри смешанной биопленки. Было доказано, что фарнезол вырабатывается кандидами не сразу, не в моменте адгезии и прикрепления, а с возрастом биопленки. Максимальные концентрации фарнезола составляли 40 цМ в зрелой 24-48 часовой биопленке, и при дальнейшем культивировании его концентрация не повышалась [15].

Эти результаты очень важны, поскольку в следующем исследовании Е.Ф. Конг с соавт. в 2017 г. доказал обратный эффект фарнезола по отношению к S. aureus. А именно: добавление 30...40 цМ фарнезола повышало устойчивость стафилококка к ванкомицину. Опыт заключался в следующем: питательную среду, в которой несколько дней культивировали биопленки C. albicans, слили, профильтровали от клеток грибов, замерили концентрацию фарнезола. Она составляла 40 цМ. В эту отработанную среду добавили стафилококк и после суток инкубации измерили стандартным диско-диффузионным методом его чувствительность к противоми-кробным препаратам. В качестве контроля использовали стафилококк, который культивировали в среде после мутантного штамма кандид, который не способен

вырабатывать фарнезол. Значит, в небольших концентрациях — до 40 цМ, фарне-зол не усиливает действие антибиотиков, а наоборот, усиливает резистентность патогена. При искусственном добавлении в питательную среду фарнезола (50 цМ и выше) наблюдалось большая восприимчивость S. aureus к антибиотикам и частичная гибель бактерий. Тем самым ученые доказали доза-зависимый эффект фарнезола [16]. Поскольку ванкомицин является одним из немногих антибиотиков, которые по-прежнему эффективны против метициллин-резистентного S. aureus (MRSA), демонстрация повышенной толерантности S. aureus к этому препарату, опосредованной его взаимодействием с C. albicans, имеет важное клиническое значение, поскольку эти виды часто изолируются вместе в смешанных биопленках.

Цель исследования — выделить 2 патогена из смешанной бактериально-грибковой биопленки раны лошади и in vitro определить эффективность применения фарнезола в разных концентрациях на восприимчивость микроорганизмов к антимикробным препаратам.

Материалы и методы исследования

Для наших экспериментов использовали S. aureus и C. albicans, полученные клинически из открытой раны лошади (рис. 1, а). Работа с микроорганизмами не требовала разрешения этического комитета, поскольку проходила только в лаборатории in vitro. Рану лошади фарнезолом не обрабатывали. Предварительную идентификацию штаммов проводили по морфологии и результатам микроскопии колоний, выращенных на маннитол-солевом агаре для стафилококков с окраской по Граму и агаре Сабуро для ДПГ (Himedia, Индия) (рис. 1, б, в).

а б в

Рис. 1. Этапы выделения микроорганизмов: а — клиническая картина раны лошади, от которой были получены штаммы; б — рост S. aureus на маннитол-солевом агаре;

в — C. albicans на агаре Сабуро Источник: фото Н.П. Сачивкиной, О.В. Нечет, KC. Гашимовой, Д.В. Кондратьевой, Н.В. Сахно Fig. 1. Stages of microorganism isolation: а — Clinical picture of the horse's wound from which the strains were obtained; б — growth of S. aureus on mannitol-salt agar; в — C. albicans on Sabouraud agar Source: photo taken by N.P. Sachivkina, O.V. Nechet, I.S. Gashimova, D.V. Kondrateva, N.V. Sakhno

S. aureus идентифицировали с помощью биохимической тест-системы api® (Bio Mérieux, Франция) и программного обеспечения API WEB [12]. C. albicans идентифицировали на хромогенной среде HiCrome Candida Agar (Himedia, Индия) по цвету зеленых колоний [17]. Затем идентификацию двух штаммов подтвердили с применением матрично-активируемой технологии лазерной десорбции/ ионизации Bruker Daltonik MALDI Biotyper (Bruker Daltonik Inc., США). После учета значений показателя X, который колебался от 0 до 3, успешными считали значения от 2 до 3. Штаммы для дальнейших исследований хранили в пробирках с триптиказо-соевым бульоном (TSB, Merck, Германия) с добавлением 30 % стерильного глицерина (Sigma, США) при -18 °C.

Тестирование на устойчивость к антибиотикам проводили с антибактериальными препаратами (табл. 1) по стандартному диско-диффузионному методу на мясо-пептонном агаре (рис. 2).

Таблица l

Антибиотики и антимикотики, используемые в эксперименте

Сокращения Название антибиотика/ противогрибкового препарата Группа препаратов Нагрузка на диск, мкг

FOX Цефокситин Цефалоспорин 2-го поколения 10

PNG Пенициллин/бензилпенициллин Пенициллины 1

LIN Линкомицин Линкозамиды 10

SXT Триметоприм/сульфаметоксазол Сульфонамиды-триметоприм 25

ERY Эритромицин Макролиды 15

CMN Клиндамицин Линкозамиды 2

NXN Норфлоксацин Фторхинолон 15

NS Нистатин Полиеновый макролид 50

AP Амфотерицин-Б Полиеновый макролид 10

KT Кетоконазол Производное имидазола 10

CC Клотримазол Производное имидазола 10

VOR Вориконазол Триазол 10

FU Флуконазол Триазол 25

MIC Миконазол Производное имидазола 10

IT Итраконазол Производное триазола 10

Table l

Antibiotics and antimycotics used in the experiment

Abbreviations Name of antibiotic/antifungal dru Group of drugs Disk load, |jg

FOX Cefoxitin Cephalosporin of 2nd generation 10

PNG Penicillin/benzylpenicillin Penicillins 1

LIN Lincomycin Lincosamides 10

SXT Trimethoprim/sulfamethoxazole Sulfonamides-trimethoprim 25

End of Table 1

Abbreviations Name of antibiotic/antifungal dru Group of drugs Disk load, |jg

ERY Erythromycin Macrolides 15

CMN Clindamycin Lincosamides 2

NXN Norfloxacin Fluoroquinolone 15

NS Nystatin Polyene macrolide 50

AP Amphotericin^ Polyene macrolide 10

KT Ketoconazole Imidazole derivative 10

CC Clotrimazole Imidazole derivative 10

VOR Voriconazole Triazole 10

FU Fluconazole Triazole 25

MIC Miconazole Imidazole derivative 10

IT Itraconazole Triazole derivative 10

Рис. 2. Чувствительность штамма Staphylococcus aureus к антибиотикам Источник: фото Н.П. Сачивкиной, О.В. Нечет, KC. Гашимовой, Д.В. Кондратьевой, Н.В. Сахно

Fig. 2. Antibiotic sensitivity of Staphylococcus aureus strain Source: photo taken by N.P. Sachivkina, O.V. Nechet, I.S. Gashimova, D.V. Kondrateva, N.V. Sakhno

Для определения изменения чувствительности S. aureus и C. albicans к лечебным препаратам с помощью фарнезола использовали коммерческий препарат с аналогичным названием (Sigma-Adrich, Германия), молярная масса равна 222,37 гр/моль, масса вещества—0,886 г/мл, количество вещества в молях—0,886 : 222,37 = 0,004 М/мл или 4000 мкМ/мл [18, 19]. Суточную культуру микроорганизмов наносили на чашки Петри газоном, затем накладывали диски с антибиотиком, плюс 25 мкл физиологического раствора (ФР) или пять различных концентраций Фарнезола (12,5.200 мкМ/мл).

Мы решили сосредоточиться на этих 5 концентрациях, поскольку, согласно нашему предыдущему опыту со штаммами Candida и Malassezia, более высокие разведения Фарнезола были не очень эффективны [20, 21]. Эксперименты с дисками проводили в трех повторностях. Данные в табл. 2 и 3 по чувствительности к антимикробным препаратам приведены без указания отклонения для лучшего визуального восприятия. Отклонение не превышало 0,4. Результаты исследований обрабатывали общепринятыми статистическими методами и считали достоверными при р < 0,05.

Результаты исследования и обсуждение

Результаты эксперимента по изменению чувствительности двух микроорганизмов к антимикробным препаратам (АБ — антибиотик; АМ — антимикотик) при добавлении к последним Фарнезола приведены в табл. 2 и 3.

Таблица 2

Чувствительность штамма S. aureus к антибиотикам и влияние пяти концентраций Фарнезола на эти результаты

Сокращенное название АБ Время инкубации, ч Только АБ АБ + ФР (контроль) АБ + 12.5 Фар АБ + 25 Фар АБ + 50 Фар АБ + 100 Фар АБ + 200 Фар

FOX 24 12 12 13 (+ 8,3%) 13 (+ 8,3%) 13 (+ 8,3%) 15 (+ 25,0%) 16 (+ 33,3%)

48 12 12 13 (+ 8,3%) 13 (+ 8,3%) 14 (+ 16,7%) 16 (+ 33,3%) 16 (+ 33,3%)

PNG 24 0 0 10 10 11 12 14

48 0 0 10 10 11 12 15

LIN 24 16 16 16 17 (+ 6,3%) 17 (+ 6,3%) 18 (+ 12,5%) 19 (+ 18,8%)

48 15 16 16 17 (+ 6,3%) 17 (+ 6,3%) 18 (+ 12,5%) 20 (+ 25,0%)

SXT 24 16 16 17 18 (+ 12,5%) 18 (+ 12,5%) 20 (+ 25,0 %) 20 (+ 25,0%)

48 15 16 17 18 (+ 12,5%) 19 (+ 18,8%) 20 (+ 25,0 %) 20 (+ 25,0%)

ERY 24 17 17 17 17 17 17 17

48 16 17 17 17 17 17 17

CMN 24 17 17 18 (+ 5,9%) 19 (+ 11,8%) 19 (+ 11,8%) 20 (+ 17,6 %) 22 (+ 29,4%)

48 17 17 18 (+ 5,9%) 18 (+ 5,9%) 19 (+ 11,8%) 20 (+ 17,6 %) 22 (+ 29,4%)

NXN 24 23 23 23 24 (+ 4,3%) 24 (+ 4,3%) 25 (+ 8,7 %) 27 (+ 17,4 %)

48 23 23 23 23 24 (+ 4,3%) 26 (+ 13,0%) 27 (+ 17,4 %)

Примечания.

— Фарнезол увеличивает зону задержки роста.

— Фарнезол не влияет на зону задержки роста.

В скобках указаны проценты, на которые увеличивается чувствительность к антибиотикам.

Table 2

Antibiotic sensitivity of S. aureus strain and the effect of Farnesol five concentrations on these results

Antibiotic name Incubation time, h Antibiotic Antibiotic + PSS (control) Antibiotic + 12.5 Far Antibiotic + 25 Far Antibiotic + 50 Far Antibiotic + 100 Far Antibiotic + 200 Far

FOX 24h 12 12 13 (+ 8.3%) 13 (+ 8.3%) 13 (+ 8.3%) 15 (+ 25.0%) 16 (+ 33.3%)

48h 12 12 13 (+ 8.3%) 13 (+ 8.3%) 14 (+ 16.7%) 16 (+ 33.3%) 16 (+ 33.3%)

PNG 24h 0 0 10 10 11 12 14

48h 0 0 10 10 11 12 15

LIN 24h 16 16 16 17 (+ 6.3%) 17 (+ 6.3%) 18 (+ 12.5%) 19 (+ 18.8%)

48h 15 16 16 17 (+ 6.3%) 17 (+ 6.3%) 18 (+ 12.5%) 20 (+ 25.0%)

SXT 24h 16 16 17 18 (+ 12.5%) 18 (+ 12.5%) 20 (+ 25.0%) 20 (+ 25.0%)

48h 15 16 17 18 (+ 12.5%) 19 (+ 18.8%) 20 (+ 25.0%) 20 (+ 25.0%)

ERY 24h 17 17 17 17 17 17 17

48h 16 17 17 17 17 17 17

CMN 24h 17 17 18 (+ 5.9%) 19 (+ 11.8%) 19 (+ 11.8%) 20 (+ 17.6%) 22 (+ 29.4%)

48h 17 17 18 (+ 5.9%) 18 (+ 5.9%) 19 (+ 11.8%) 20 (+ 17.6%) 22 (+ 29.4%)

NXN 24h 23 23 23 24 (+ 4.3%) 24 (+ 4.3%) 25 (+ 8.7%) 27 (+ 17.4%)

48h 23 23 23 23 24 (+ 4.3%) 26 (+ 13.0%) 27 (+ 17.4%)

Note.

— Farnesol increases the inhibition zone.

— Farnesol does not affect the inhibition zone.

The percentages by which antibiotic sensitivity increases are indicated in parentheses.

Таблица 3

Чувствительность штамма C. albicans к антимикотикам и влияние пяти концентраций Фарнезола на эти результаты

Сокращенное название АМ Время инкубации Только АМ АМ+ ФР (контроль) АМ + 12.5 Фар АМ + 25 Фар АМ + 50 Фар АМ + 100 Фар АМ+ 200 Фар

NS 24h 10 10 17 (+ 70,0%) 20 (+ 100,0%) 21 (+ 110,0%) 21 (+ 110,0%) 21 (+ 110,0%)

48h 10 10 16 (+ 60,0%) 16 (+ 60,0%) 18 (+ 80,0%) 18 (+ 80,0%) 18 (+ 80,0%)

AP 24h 0 0 8 10 11 11 11

48h 0 0 6 10 11 11 11

KT 24h 13 13 13 13 15 (+ 15,4%) 15 (+ 15,4%) 16 (+ 23,1 %)

48h 12 13 13 13 14 (+ 7,7%) 15 (+ 15,4%) 16 (+ 23,1 %)

CC 24h 14 14 14 14 14 14 15 (+ 7,1 %)

48h 13 13 13 13 13 13 15 (+ 15,4%)

Окончание табл. 3

Сокращенное название АМ Время инкубации Только АМ АМ+ ФР (контроль) АМ + 12.5 Фар АМ + 25 Фар АМ + 50 Фар АМ + 100 Фар АМ+ 200 Фар

VOR 24h 17 17 18 (+ 5,9%) 19 (+ 11,8%) 19 (+ 11,8%) 20 (+ 17,6%) 20 (+ 17,6%)

48h 16 17 18 (+ 5,9%) 18 (+ 5,9%) 19 (+ 11,8%) 20 (+ 17,6%) 20 (+ 17,6%)

FU 24h 8 8 8 10 (+ 25,0%) 11 (+ 37,5%) 11 (+ 37,5%) 11 (+ 37,5%)

48h 6 6 6 10 (+ 66,7%) 11 (+ 83,3%) 11 (+ 83,3%) 11 (+ 83,3%)

MIC 24h 11 11 18 (+ 63,7%) 19 (+ 72,7%) 19 (+ 72,7%) 20 (+ 81,8%) 22 (+ 100,0 %)

48h 11 11 18 (+ 63,7%) 18 (+ 63,7%) 19 (+ 72,7%) 20 (+ 81,8%) 22 (+ 100,0 %)

IT 24h 13 13 13 14 (+ 7,7%) 14 (+ 7,7%) 14 (+ 7,7%) 15 (+ 15,4%)

48h 13 13 13 13 14 (+ 7,7%) 14 (+ 7,7%) 15 (+ 15,4%)

Примечания.

- Фарнезол увеличивает зону задержки роста

- Фарнезол не влияет на зону задержки роста

В скобках указаны проценты, на которые увеличивается чувствительность к антибиотикам.

Table 3

Sensitivity of the C. albicans strain to antimycotics and the effect of five concentrations of Farnesol on these results

Anti-my-cotic name Incubation time, h Antimy-cotic Antimycotic + PSS (control) Antimycotic + 12.5 Far Antimycotic + 25 Far Antimycotic + 50 Far Antimycotic + 100 Far Antimycotic + 200 Far

NS 24h 10 10 17 (+ 70.0 %) 20 (+ 100.0 %) 21 (+ 110.0%) 21 (+ 110.0%) 21 (+ 110.0%)

48h 10 10 16 (+ 60.0%) 16 (+ 60.0%) 18 (+ 80.0%) 18 (+ 80.0%) 18 (+ 80.0%)

AP 24h 0 0 8 10 11 11 11

48h 0 0 6 10 11 11 11

KT 24h 13 13 13 13 15 (+ 15.4%) 15 (+ 15.4%) 16 (+ 23.1 %)

48h 12 13 13 13 14 (+ 7.7%) 15 (+ 15.4%) 16 (+ 23.1 %)

CC 24h 14 14 14 14 14 14 15 (+ 7.1 %)

48h 13 13 13 13 13 13 15 (+ 15.4%)

VOR 24h 17 17 18 (+ 5.9%) 19 (+ 11.8%) 19 (+ 11.8%) 20 (+ 17.6%) 20 (+ 17.6 %)

48h 16 17 18 (+ 5.9%) 18 (+ 5.9%) 19 (+ 11.8%) 20 (+ 17.6%) 20 (+ 17.6 %)

FU 24h 8 8 8 10 (+ 25.0%) 11 (+ 37.5%) 11 (+ 37.5%) 11 (+ 37.5%)

48h 6 6 6 10 (+ 66.7%) 11 (+ 83.3%) 11 (+ 83.3%) 11 (+ 83.3%)

MIC 24h 11 11 18 (+ 63.7%) 19 (+ 72.7%) 19 (+ 72.7%) 20 (+ 81.8%) 22 (+ 100.0%)

48h 11 11 18 (+ 63.7%) 18 (+ 63.7%) 19 (+ 72.7%) 20 (+ 81.8%) 22 (+ 100.0%)

IT 24h 13 13 13 14 (+ 7.7%) 14 (+ 7.7%) 14 (+ 7.7%) 15 (+ 15.4%)

48h 13 13 13 13 14 (+ 7.7%) 14 (+ 7.7%) 15 (+ 15.4%)

Note.

- Farnesol increases the inhibition zone.

- Farnesol does not affect the inhibition zone.

The percentages by which sensitivity to antimycotics increases are indicated in parentheses.

Из табл. 2 следует, что клинический штамм золотистого стафилококка был полностью резистентен к пенициллину, а при добавлении Фарнезола чувствительность появилась. Аналогичная ситуация прослеживается и со штаммом кандиды: изначально мы наблюдали резистентность к Амфотерицину В, а с Фарнезолом даже в небольших концентрациях этот препарат стал работать.

Однако надо обратить внимание и на наличие результатов с некоторыми препаратами, где Фарнезол никак не повлиял на чувствительность: это у S. aureus с Эритромицином и у C. albicans с Клотримазолом. Последний препарат все же «сдался» при добавлении Фарнезола в наибольшей концентрации 200 мкМ/мл.

Таким образом, в большинстве случаев при добавлении Фарнезола регистрируется увеличение чувствительности микроорганизмов к препаратам в опыте по сравнению с контролем. Причем в процентном соотношении лучшие результаты синергизма отмечены в сочетании с противогрибковыми препаратами, нежели с антибактериальными. Есть и уникальный показатель (см. табл. 3): чувствительность C. albicans к Нистатину и Миконазолу выросла вдвое при добавлении Фарнезола в концентрации 25.200 мкМ/мл. Помимо этого, наблюдается интересная тенденция: через 48 часов инкубации зона задержки роста стафилококка вокруг дисков чуть увеличивается за счет действия Фарнезола по сравнению с диаметром через 24 часа инкубации. А у грибов, наоборот, зона задержки роста при увеличении времени инкубации с 24 до 48 часов чуть уменьшается или остается такой же.

Заключение

Доказано эффективное симбиотические действие Фарнезола с антимикробными препаратами по отношению к патогенным или условно-патогенным микроорганизмам. Таким образом, местное применение Фарнезола при микст-инфекции окажет воздействие сразу на несколько микроорганизмов в смешанной биопленке. Данные in vivo свидетельствуют о том, что в сочетании с большинством антибиотиков и/ или противогрибковых препаратов Фарнезол имеет адъювантный эффект.

Библиографический список / References

1. Sachivkina N, Karamyan A, Semenova V, Ignatiev A, Abdurasulov A, Muratova R, et al. The Effects of Angelica ternata Extract from Kyrgyzstan on the Formation of Candida albicans ATCC 10231 Biofilms. Appl Sci. 2023;13(21):12042. doi: 10.3390/app132112042

2. Kumar R, Das J, Rode S, Kaur H, Shah V, Verma P, et al. Farnesol dehydrogenase from Helicoverpa armigera (Hubner) as a promising target for pest management: molecular docking, in vitro and insect bioassay studies using geranylgeraniol as potential inhibitor. 3 Biotech. 2023;13(6):175. doi: 10.1007/s13205-023-03598-9

3. Hornby JM, Jensen EC, Lisec AD, Tasto JJ, Jahnke B, Shoemaker R, et al. Quorum sensing in the dimorphic fungus Candida albicans is mediated by farnesol. Appl Environ Microbiol. 2001;67(7):2982-2992. doi: 10.1128/AEM.67.7.2982-2992.2001

4. Ramage G, Saville SP, Wickes BL, Lopez-Ribot JL. Inhibition of Candida albicans biofilm formation by farnesol, a quorum-sensing molecule. Appl Environ Microbiol. 2002;68(11):5459-5463. doi: 10.1128/ aem.68.11.5459-5463.2002

5. Semighini CP, Hornby JM, Dumitru R, Nickerson KW, Harris SD. Farnesol-induced apoptosis in Aspergillus nidulans reveals a possible mechanism for antagonistic interactions between fungi. Mol Microbiol. 2006;59(3):753-764. doi: 10.1111/j.1365-2958.2005.04976.x

6. Shirtliff ME, Krom BP, Meijering RA, Peters BM, Zhu J, Scheper MA, et al. Famesol-induced apoptosis in Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 2009;53(6):2392-2401. doi: 10.1128/AAC.01551-08

7. Brasch J, Horter F, Fritsch D, Beck-Jendroschek V, Tröger A, Francke W. Acyclic sesquiterpenes released by Candida albicans inhibit growth of dermatophytes. Med Mycol. 2014;52(1):46-55. doi: 10.3109/1369378 6.2013.814174

8. Katragkou A, McCarthy M, Alexander EL, Antachopoulos C, Meletiadis J, Jabra-Rizk MA, et al. In vitro interactions between farnesol and fluconazole, amphotericin B, or microfungin against Candida albicans biofilms. J Antimicrob Chemother. 2015;70(2):470-478. doi: 10.1093/jac/dku374

9. Nagy F, Vitalis E, Jakab A, Borman AM, Forgacs L, Toth Z, et al. In vitro and in vivo effect of exogenous farnesol exposure against Candida auris. Front Microbiol. 2020;11:957. doi: 10.3389/fmicb.2020.00957

10. Dekkerova J, Cernakova L, Kendra S, Borghi E, Ottaviano E, Willinger B, et al. Farnesol boosts the antifungal effect of fluconazole and modulates resistance in Candida auris through regulation of the CDR1 and ERG11 genes. J Fungi. 2022;8(8):783. doi: 10.3390/jof8080783

11. Nikoomanesh F, Falahatinejad M, Cernakova L, dos Santos ALS, Mohammadi SR, Rafiee M, et al. Combination of farnesol with common antifungal drugs: inhibitory effect against Candida species isolated from women with RVVC. Medicina. 2023;59(4):743. doi: 10.3390/medicina59040743

12. Lenchenko E, Sachivkina N, Petrukhina O, Petukhov N, Zharov A, Zhabo N, Avdonina M. Anatomical, pathological, and histological features of experimental respiratory infection of birds by biofilm-forming bacteria Staphylococcus aureus. Veterinary World. 2024;17(3):612-619. doi: 10.14202/vetworld.2024.612-619

13. Jabra-Rizk MA, Meiller TF, James CE, Shirtliff ME. Effect of farnesol on Staphylococcus aureus biofilm formation and antimicrobial susceptibility. Antimicrob Agents Chemother. 2006;50(4):1463-1469. doi: 10.1128/ AAC.50.4.1463-1469.2006

14. Inoue Y, Togashi N, Hamashima H. Farnesol-induced disruption of the Staphylococcus aureus cytoplasmic membrane. Biol Pharm Bull. 2016; 39(5):653-656. doi: 10.1248/bpb.b15-00416

15. Wargo MJ, Hogan DA. Fungal-bacterial interactions: a mixed bag of mingling microbes. Curr Opin Microbiol. 2006;9(4):359-364. doi: 10.1016/j.mib.2006.06.001

16. Kong EF, Tsui C, Kucharikova S, Van Dijck P, Jabra-Rizk MA. Modulation of Staphylococcus aureus response to antimicrobials by the Candida albicans quorum sensing molecule farnesol. Antimicrob Agents Chemother. 2017;61(12):e01573-17. doi: 10.1128/AAC.01573-17

17. Boone CHT, Parker KA, Gutzmann DJ, Atkin AL, Nickerson KW. Farnesol as an antifungal agent: comparisons among MTLa and MTLa haploid and diploid Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae. Front Physiol. 2023;14:1207567. doi: 10.3389/fphys.2023.1207567

18. Erdal B, Baylan B, Batar B, Öztürk A, Topçu B. Investigation of the Effect of Farnesol on Biofilm Formation by Candida albicans and Candida parapsilosis complex isolates. Mikrobiyol Bul. 2024;58(1):49-62. doi: 10.5578/mb.20249905r

19. Li T, Liu ZH, Fan LY, Zhang Z, Bai HH, Wang FJ, et al. The fungal quorum-sensing molecule, farnesol, regulates the immune response of vaginal epithelial cells against Candida albicans. BMC Microbiol. 2023;23(1):251. doi: 10.1186/s12866-023-02987-7

20. Olabode IR, Sachivkina N, Karamyan A, Mannapova R, Kuznetsova O, Bobunova A, et al. In vitro activity of farnesol against Malassezia pachydermatis isolates from otitis externa cases in dogs. Animals. 2023;13(7):1259. doi: 10.3390/ani13071259

21. Sachivkina N, Senyagin A, Podoprigora I, Vasilieva E, Kuznetsova O, Karamyan A, et al. Enhancement of the antifungal activity of some antimycotics by farnesol and reduction of Candida albicans pathogenicity in a quail model experiment. Veterinary World. 2022;15(4):848-854. doi: 10.14202/vetworld.2022.848-854

Об авторах:

Сачивкина Надежда Павловна — кандидат биологических наук, доцент департамента ветеринарной медицины, Российский университет дружбы народов, Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, корп. 2; e-mail: [email protected] ORCID: 0000-0003-1100-929X SPIN-код: 1172-3163

Нечет Оксана Викторовна — руководитель Лабораторного центра «Биохим», заместитель директора НОЦ «Нанотехнологии» института биохимической технологии и нанотехнологии, Российский университет дружбы народов, Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 10, корп. 2; e-mail: [email protected] ORCID: 0009-0002-3855-5653

Гашимова Иман Солтановна — магистрант института биохимической технологии и нанотехнологии, Российский университет дружбы народов, Российская Федерация, 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 10, корп. 2; e-mail: [email protected] ORCID: 0009-0004-0645-3980 SPIN-код: 3661-9354

Кондратьева Диана Валерьевна — частный конный ветеринарный врач Москвы и Московской области, основатель мобильного конного госпиталя Moscow Equine Services, Российская Федерация, г. Москва; e-mail: [email protected] ORCID: 0009-0001-4387-8281

Сахно Николай Владимирович — доктор ветеринарных наук, доцент, профессор кафедры эпизоотологии и терапии, Орловский государственный аграрный университет им. Н.В. Парахина, Российская Федерация, 302019, г. Орел, ул. Генерала Родина, д. 69; е-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-3281-1081 SPIN-код: 5461-3191

About authors:

Sachivkina Nadezhda Pavlovna — Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Department of Veterinary Medicine, RUDN University, 8 Miklukho-Maklaya st., bldg. 2, Moscow, 117198, Russian Federation; e-mail: [email protected]

ORCID: 0000-0003-1100-929X SPIN-code: 1172-3163

Nechet Oksana Viktorovna — head of the Microbiological Laboratory Center "Biochim", deputy director of the Research Center "Nanotechnologies" of the Institute of Biochemical Technology and Nanotechnology, RUDN University, 10 Miklukho-Maklaya st., bldg. 2, Moscow, 117198, Russian Federation; e-mail: [email protected] ORCID: 0009-0002-3855-5653

Gashimova Iman Soltanovna — Master student, Institute of Biochemical Technology and Nanotechnology, RUDN University, 10 Miklukho-Maklaya st., bldg. 2, Moscow, 117198, Russian Federation; e-mail: [email protected] ORCID: 0009-0004-0645-3980 SPIN-code: 3661-9354

Kondratieva Diana Valerievna — private equestrian veterinarian in Moscow and Moscow region, founder of the mobile equestrian hospital Moscow Equine Services, Moscow, Russian Federation; e-mail: Diakondratieva@ gmail.com

ORCID: 0009-0001-4387-8281

Sakhno Nikolay Vladimirovich — Doctor of Veterinary Sciences, Associate Professor, Professor, Department of Epizootology and Therapy, Orel State Agrarian University named after N.V. Parakhin, 69 Generala Rodina st., Orel, 302019, Russian Federation; e-mail: [email protected] ORCID: 0000-0002-3281-1081 SPIN-code: 5461-3191