CC BY
15Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice Т. 8. №5. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/78
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НА УКИ/BIOLOGICAL SCIENCES
УДК 577.181.5:576.353 https://doi.org/10.33619/2414-2948/78/04
AGRIS F30
ДЕЙСТВИЕ АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ НА ГЕНОТОКСИЧНОСТЬ В ALLIUM ТЕСТЕ
©Концевая И. И., канд. биол. наук, Гомельский государственный университет
им. Ф. Скорины, г. Гомель, Беларусь, ikantsavaya@mail.ru ©Минина А. В., Гомельский государственный университет им. Ф. Скорины, г. Гомель, Беларусь, minina_anastasia17@gmail.com
THE EFFECT OF AMINOGLYCOSIDE ANTIBIOTICS ON GENOTOXITY IN ALLIUM TEST
©Kantsavaya I., Ph.D., F. Scorina Gomel State University, Gomel, Belarus, ikantsavaya@mail.ru ©Minina A., F. Scorina Gomel State University, Gomel, Belarus, minina_anastasia17@gmail.com
Аннотация. Исследуется влияние аминогликозидных антибиотиков (стрептомицина и гентамицина) на патологию митоза в клетках корневой меристемы Allium cepa L. в первой метафазе после обработки и после завершения восстановительного периода. Методы исследования: Allium тест, цитогенетический анализ, статистический анализ. Опыт был выполнен на партии сорта Штуттгартер, который характеризовался как генетически нестабильный по итогам микроядерного теста. Результаты тестирования аминогликозидных антибиотиков (стрептомицина — в концентрации 1000 мг/л, экспозиции 24 и 48 часов; гентамицина — в концентрации 100,0 мг/л, экспозиции 48 часов) показали их негативное влияние и повышение роста патологических процессов в клетках образовательной ткани корней лука обыкновенного. Сравнительный анализ долей аберраций кластогенного типа и аберраций анеугенного типа по всем вариантам исследования позволил прийти к заключению, что тестируемые антибиотики проявляют большую способность вызывать нарушения митоза, связанные с повреждением митотического аппарата, чем нарушения, связанные с повреждением и нарушением структуры хромосом. Среди аберраций кластогенного типа доминируют: хромосомные и хроматидные мосты. Среди аберраций анеугенного типа доминируют: забегание/отставание хромосом, к-митоз в нескольких морфологических вариантах (гиперспирализация хромосом и их рассеивание в метафазе; рассеивание хромосом в метафазе и анафазе); слипание хромосом в разной степени, вплоть до образования комков на стадии метафазы с образованием аномальных структур). Установлено, что увеличение длительности действия стрептомицина вызывает более негативные последствия по сравнению с меньшим стрессовым давлением. После восстановительного периода на протяжении двух-трех клеточных циклов в вариантах применения стрептомицина происходит частичное восстановление клеток. При действии гентамицина отмечали у 80% клеток слипание хромосом и единичные кольцевые хромосомы. Эти эффекты оказались нерепарируемыми и после периода восстановления была установлена гибель 90% корешков.
Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice Т. 8. №5. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/78
Abstract. The influence of aminoglycoside antibiotics (streptomycin and gentamicin) on mitosis's pathology in the cells of root meristem Allium cepa L. in the first metaphase after processing and after finishing the recovery period is investigated. Research methods: Allium test, cytogenetic analysis, statistical analysis. The experiment was conducted on a batch of the Stuttgarter variety which is genetically unstable as the result of micronucleus test. The results of aminoglycoside antibiotics (streptomycin — in the concentration of 1000 mg/l, on exposure of 24 and 48 hours; gentamicin — 100,0 mg/l, on exposure of 48 hours) showed their negative influence and the increased growth of pathological processes in the cells of root meristem Allium cepa L. The comparative analysis of the part of clastogenic type aberrations and anogenic type aberrations according to all research methods let come to conclusion that antibiotics under test show the higher ability to cause mitosis's pathology, connected with damage of mitotic apparatus than pathology associated with damage and disruption of chromosomes structure. Among clastogenic type aberrations chiasma and chromatid bridges dominate. Among anogenic type aberrations chromosome lagging, mitosis in some morphological variants (hyperspiralization of the chromosomes and their discharge in the metaphase; chromosome discharge in the metaphase and the anaphase); chromatic agglutination at various degree, up to formation of clots at metaphase with abnormal structures formation) dominate. It's considered that increased duration of streptomycin action causes more negative consequences in comparison with less stress pressure. Since the recovery period partial cell repair after streptomycin occurs for 2-3 cell cycles. Under the influence of gentamicin, chromatic agglutination and single ring chromosomes were observed in 80% of the cells. These consequences have been unrepaired and after the recovery period the fatality of 90% rootlets was observed.
Ключевые слова: Allium тест, аминогликозидные антибиотики, патология митоза.
Keywords: Allium test, aminoglycoside antibiotics, mitosis pathology.
Аминогликозиды относятся к группе антибиотиков, блокирующих синтез белков. Данная группа антибиотиков не менее многочисленная, чем группа антибиотиков, нарушающих синтез клеточной стенки бактерий [1].
Нарушение синтеза белка прокариот может происходить на всех уровнях, начиная с процесса считывания информации с ДНК и заканчивая блокированием связывания т-РНК с 30S субъединицами рибосом [2]. Здесь следует отметить, что стрептомицин действует на 30S субъединицу, другие аминогликозиды связываются с обеими субъединицами рибосом, в их присутствии образуется нестабильный 70S инициаторный комплекс и обрывается биосинтез белка [3]. Избирательность действия антибиотиков этой группы на бактериальную клетку обеспечивается существенным различием рибосом у бактерий и эукариот. Частицы бактериальных рибосом, обозначаемые по коэффициенту седиментации как 50S- и 30S-частицы, отличаются по способности связываться с антибиотиками от частиц рибосом эукариотов, соответственно, 60S- и 40S-частиц. По этой причине цитоплазматические рибосомы животной клетки реагируют с ними гораздо слабее или вообще не связывают указанные антибиотики. Это в первую очередь и создает возможность использования этих антибиотиков в клинике, т.е. делают их малотоксичными для человека [3]. Аминогликозиды относятся к препаратам с низким терапевтическим индексом, т. е. малым разрывом между терапевтической и токсической дозой или концентрацией.
Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice Т. 8. №5. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/78
Цель работы: выявление повреждений генетического аппарата в клетках корневой меристемы Allium cepa L. в первой метафазе после обработки и после завершения восстановительного периода [4] при действии в течение одного-трех клеточных циклов аминогликозидных антибиотиков (гентамицина и стрептомицина).
Методика исследований
Исследование ответных реакций растений лука обыкновенного в условиях действия водных растворов антибиотиков выполняли с помощью Allium теста [5] на сорте Штуттгартен. В качестве негативного контроля использовали дистиллированную воду.
Тестировали следующие антибиотики: гентамицин (гентамицина сульфат, РУП «Белмедпрепараты», Беларусь) — 100,0 мг/л; стрептомицин (стрептомицина сульфат; ЗАО «Брынцалов-А», Россия) — 1000,0 мг/л. Согласно рекомендации ВОЗ [4], в эксперименте дополнительно выдерживали период восстановления длительностью 24 часа, в течение которого тестируемое вещество не воздействует (вариант последействия), и только затем выполняли фиксацию корешков. Во всех вариантах опыта фиксация производилась с 6.30 до 7.00 утра.
Давленые препараты для цитогенетического анализа, окрашенные ацетогематоксилином, изготавливали по общепринятой методике [10]. Просмотр препаратов осуществляли на компьютеризированной кариологической станции, оснащенной микроскопом Leica DMR при увеличении 40*10*1,5. Цитогенетический анализ выполняли по [6, 7].
Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета прикладного программного обеспечения Microsoft Excel и Statsoft (USA) Statistica v. 7.0. Для данных, подчиняющихся нормальному закону распределения, использовали t-критерий Стьюдента. Нулевую гипотезу отклоняли при уровне статистической значимости p<0,05 [8].
Результаты исследований
При микроскопировании препаратов в вариантах опыта наблюдали в апикальной меристеме некоторых придаточных корней лука отсутствие деления (Таблица).
Таблица
ВЛИЯНИЕ АМИНОГЛИКОЗДНЫХ АНТИБИОТИКОВ НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ МЕРИСТЕМНЫХ КЛЕТОК КОРЕШКОВ ЛУКА ОБЫКНОВЕННОГО
№ варианта опыта Тестируемые вещества, концентрация в мг/л Число корешков с митозом, %
1 вода водопроводная 100,0
2 стрептомицин, 1000,0 — 24 ч 100,0
3 последействие (стрептомицин, 1000,0 — - 24 ч) 91,9
4 стрептомицин, 1000,0 — 48 ч 95,0
5 последействие (стрептомицин, 1000,0 — - 48 ч) 100,0
6 гентамицин, 100,0 — 48 ч 96,4
7 последействие (гентамицин, 100,0 — 48 ч) 0
У них митотический индекс был близок к нулю и большинство клеток находились в профатическом состоянии. Однако, если применение гентамицина и стрептомицина в ряде вариантов опыта подавляло митотическую активность у 5,0-8,1% корешков на момент фиксации материала, то в варианте «последействие (гентамицин)» число выживших корешков составило два, с МИ равным 1,0-2,0%. В данном варианте на препаратах
Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice https://www.bulletennauki.com
Т. 8. №5. 2022 https://doi.org/10.33619/2414-2948/78
наблюдали как нормальные ядра, так и аномальные. В связи с низкой митотической активностью по указанному варианту не учитывали при анализе результаты критериев генотоксичности.
При анализе данных, полученных в результате микроядерного теста (Рисунок 1), наблюдали наличие микроядер в контрольном варианте, число клеток с микроядрами достигало 0,29%. Микроядра формировались в результате отпочковывания ядерных почек у интерфазных ядер (Рисунок 5: 1а, 1б). Наличие микроядер в клетках, как правило, рассматривается как морфологический пассивный маркер генетической нестабильности [9, 10]. Тестируемую партию лука обыкновенного по данному маркеру можно классифицировать как генетически нестабильный материал. В 1,5 раза по сравнению с контролем увеличивалось число клеток с микроядрами в варианте «стрептомицин, 1000,0 мг/л — 24 часа». В остальных вариантах были отмечены единичные клетки с микроядрами. Необходимо подчеркнуть, что микроядра были очень маленького размера.
0,46
-
и й
о &
н ч
03 «
« о
* &
^ 5
0,29
I
0,04
0,06
0,12
0,05
1 2 3 4 5 6
варианты опыта
Рисунок 1. Влияние аминогликозидных антибиотиков на процент клеток с микроядрами. Варианты опыта: 1 — вода дистиллированная, 2 — стрептомицин, 1000,0 мг/л — 24 часа, 3 — последействие варианта 2; 4 — стрептомицин, 1000,0 мг/л — 48 ч; 5 — последействие варианта 4; 6
— гентамицин, 100,0 мг/л — 48 ч
При действии антибиотиков отмечали существенное возрастание значения ПМ, с 6,0%
— в контроле до 22,0-61,1% — в опытных вариантах. Пролонгированный эффект стрептомицина оказал негативную реакцию на образование патологических митозов (Рисунок 2, вариант 4) по сравнению с более кратковременным действием антибиотика.
80,0 60,0 40,0 20,0 0,0
■
Г I
2
3
4
5
варианты опыта ■ ПМ с учетом профазы ■ ПМ без учета профазы
Рисунок 2. Влияние аминогликозидных антибиотиков на патологию митоза. Варианты опыта: 1 — вода дистиллированная, 2 — стрептомицин, 1000,0 мг/л — 24 часа, 3 — последействие варианта 2; 4 — стрептомицин, 1000,0 мг/л — 48 ч; 5 — последействие варианта 4; 6 —гентамицин, 100,0 мг/л — 48 ч
В вариантах последействия по аминогликозидным антибиотикам наблюдали существенное снижение патологических митозов, что свидетельствует о возможности
1
6
® I
Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice https://www.bulletennauki.com
Т. 8. №5. 2022 https://doi.org/10.33619/2414-2948/78
работы механизмов адаптации и репарации.
Действие стрептомицина на протяжении одного клеточного цикла вызывало к-митоз — 45,1%, слипание — 18,2%, мосты — 6,2% (Рисунок 3, вариант 2). В восстановительном периоде данного варианта доминирующим типом патологий стали мосты (более 40,0%), слипание хромосом осталось на прежнем уровне (Рисунок 3, вариант 3). Полученные результаты тестирования свидетельствуют о доминировании патологий митоза, связанных с повреждением митотического аппарата. Известно, что здесь задействованы белки, в том числе и циклины, которые контролируют переход одного этапа митоза на следующий этап.
100% 80% 60% 40% 20% 0%
18 81
3
4
варианты опыта
■ АсВер з/отст хр ■ выбр хр ■ мосты рассеив фрагменты слипание ■ к-митоз разное
Рисунок 3. Влияние аминогликозидных антибиотиков состав и спектр патологий митоза. Варианты опыта: 1 — вода дистиллированная, 2 — стрептомицин, 1000,0 мг/л — 24 часа, 3 — последействие варианта 2; 4 — стрептомицин, 1000,0 мг/л — 48 ч; 5 — последействие варианта 4; 6 — гентамицин, 100,0 мг/л — 48 ч
При действии стрептомицина в течение 2-3 клеточных циклов (Рисунок 3, вариант 4, Рисунок 4) отмечено преобладание слипания хромосом (свыше 60,0%), также более 10,1% клеток имели мосты и к-митоз. В варианте 5 (Рисунок 3) (последействие) не наблюдали существенных изменений по составу и спектру ПМ.
• **
б
1) контроль — вода дистиллированная: а, б — интерфазное ядро с ядерной почкой (ядерные протрузии); в — рассеивание хромосом
* ••
• • • 5 • 4
1 * • 5
I* Ж С _ w ш *
2) стрептомицин, 1000,0 — 24 ч: а-в — рассеивание хромосом + слипание; а — мост в анафазе; а, в — комки
1
2
5
6
в
в
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 8. №5. 2Q22
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/1Q.33619/2414-2948/78
% 'I
%
VtV
«t. -
» «
3) последействие «стрептомицин, 1000,0 — 24 ч»: а-в — рассеивание хромосом в метафазе и анафазе, слипание хромосом; б — множественный мост; в — мост
^ Ф иг #
9 Ф т
Ш 9 ш
I
m
*
б
4) стрептомицин, 1000,0 мг/л, 48 ч: а-в — рассеивание хромосом в метафазе и анафазе + слипание хромосом; в — мосты
I
Ф
'9
H
# -
S
•б
5) последействие «стрептомицин, 1000,0 мг/л, 48 ч»: а, б — рассеивание хромосом в метафазе + слипание; в - нормальный вид хромосом в метафазе и анафазе
Л *
Л1-
щ
б
6) гентамицин, 100,0 мг/л, 48 ч : а — набухание и склеивание хромосом в метафазе; б — рассеивание хромосом в метафазе + кольцевая хромосома; в — нормальный вид хромосом в метафазе, слипание хромосом
Рисунок 4. Типы патологий митоза при действии аминогликозидных антибиотиков (увеличение микроскопа 400x, 1QQx)
в
б
а
а
в
При действии гентамицина среди типов ПМ преобладало слипание хромосом (более 80,1%) (Рисунок 3, вариант 6).
Во всех препаратах при действии аминогликозидных антибиотиков наблюдали набухание хромосом, регистрировали рассеивание хромосом, их слипание (вплоть до образования комков, например, вариант «стрептомицин, 1000,0 мг/л — 24 ч» (Рисунок 4 , 2а, 2б, 2в), мосты одиночные (Рисунок 4, 2а) и двойные, асинхронное веретено деления.
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 8. №5. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/78
В вариантах «последействие» стрептомицина (Рисунок 4: 3а-3в, 5а, 5б), сохранялись ранее наблюдаемые типы патологий, однако в варианте последействия «стрептомицин, 1000,0 мг/л — 48 ч» у отдельных корней вид ядер и хромосом был нормальным (Рисунок 4, 5в).
В варианте «гентамицин, 100,0 мг/л, 48 ч» наблюдали в большинстве случаев слипание хромосом (Рисунок 4, 6а), в ряде корешков - кольцевые хромосомы, рассеивание хромосом в метафазе (Рисунок 4, 6б). В отдельных корешках вид хромосом у большинства клеток был в норме, но с наличием в 3,1-15,2% такой патологии как слипание хромосом (Рисунок 4, 6в).
Заключение
Таким образом, результаты тестирования аминогликозидных антибиотиков (стрептомицина — в концентрации 1000 мг/л, экспозиции 24 и 48 часов; гентамицина — в концентрации 100,0 мг/л, экспозиции 48 часов) показали их негативное влияние и повышение роста патологических процессов в клетках образовательной ткани корней лука обыкновенного.
Сравнительный анализ долей аберраций кластогенного типа и аберраций анеугенного типа по всем вариантам исследования позволил прийти к заключению, что тестируемые антибиотики проявляют большую способность вызывать нарушения митоза, связанные с повреждением митотического аппарата, чем нарушения, связанные с повреждением и нарушением структуры хромосом. Среди аберраций кластогенного типа доминируют: хромосомные и хроматидные мосты. Среди аберраций анеугенного типа доминируют: забегание/отставание хромосом, к-митоз в нескольких морфологических вариантах (гиперспирализация хромосом и их рассеивание в метафазе; рассеивание хромосом в метафазе и анафазе); слипание хромосом в разной степени, вплоть до образования комков на стадии метафазы с образованием аномальных структур).
Установлено, что увеличение длительности действия стрептомицина вызывает более негативные последствия по сравнению с меньшим стрессовым давлением. После восстановительного периода на протяжении двух-трех клеточных циклов в вариантах применения стрептомицина, происходит частичное восстановление клеток, об этом свидетельствует существенное снижение числа патологических клеток в 1,2-2,0 раза в вариантах последействия. В клетках некоторых корешков наблюдали пикноз ядер с последующей гибелью корней, у другой части корешков клетки полностью восстанавливалась до нормы.
При действии гентамицина отмечали у 80% клеток слипание хромосом и единичные кольцевые хромосомы. Эти эффекты оказались нерепарируемыми и после периода восстановления было установлено в 90,3% гибель корешков, а в 9,7% корешков отмечали низкую интенсивность деления (1-2%).
Список литературы:
1. Машковский М. Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 2012. 1216 с.
2. Алехин Е. К. Как действуют антибиотики // Биология: электронный Соросовский образовательный журнал. 2000. №4. C. 19-23.
3. Желдакова Р. А. Механизмы биосинтеза антибиотиков и их действие на клетки микроорганизмов. Минск: БГУ, 2004. 111 с.
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 8. №5. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/78
4. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических соединений. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. Женева: ВОЗ, 1989. №51. 212 с.
5. Fiskesjo G. Allium test for screening chemicals; evaluation of cytological parameters // Plants for environmental studies. 1997. V. 11. P. 307-333.
6. Паушева З. П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988. 271 с.
7. Алов И. А. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина, 1972. 264 с.
8. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.
9. Iqbal M., Abbas M., Nisar J., Nazir A., Qamar A. Bioassays based on higher plants as excellent dosimeters for ecotoxicity monitoring: a review // Chemistry International. 2019. V. 5. №1. P. 1-80. https://doi.org/10.31221/osf.io/z2ynm
10. Сутягина О. И. Микроядра и выживание опухолевых клеток человека в культуре: дисс. ... канд. биол. наук. М., 2019. 177 с.
References:
1. Mashkovskii, M. D. (2012). Lekarstvennye sredstva. Moscow. (in Russian).
2. Alekhin, E. K. (2000). Kak deistvuyut antibiotiki. Biologiya: elektronnyi Sorosovskii obrazovatel'nyi zhurnal, (4), 19-23. (in Russian).
3. Zheldakova, R. A. (2004). Mekhanizmy biosinteza antibiotikov i ikh deistvie na kletki mikroorganizmov. Minsk. (in Russian).
4. (1989). Rukovodstvo po kratkosrochnym testam dlya vyyavleniya mutagennykh kantserogennykh khimicheskikh soedinenii. Gigienicheskie kriterii okruzhayushchei sredy. Geneva, (51), 212. (in Russian).
5. Fiskesjo, G. (1997). Allium test for screening chemicals; evaluation of cytological parameters. Plants for environmental studies, 11, 307-333.
6. Pausheva, Z. P. (1988). Praktikum po tsitologii rastenii. Moscow. (in Russian).
7. Alov, I. A. (1972). Tsitofiziologiya i patologiya mitoza. Moscow. (in Russian).
8. Lakin, G. F. (1990). Biometriya. Moscow. (in Russian).
9. Iqbal, M., Abbas, M., Nisar, J., Nazir, A., & Qamar, A. (2019). Bioassays based on higher plants as excellent dosimeters for ecotoxicity monitoring: a review. Chemistry International, 5(1), 1-80. https://doi.org/10.31221/osf.io/z2ynm
10. Sutyagina, O. I. (2019). Mikroyadra i vyzhivanie opukholevykh kletok cheloveka v kul'ture. Ph.D. diss. Moscow. (in Russian).
Работа поступила Принята к публикации
в редакцию 18.04.2022 г. 23.04.2022 г.
Ссылка для цитирования:
Концевая И. И., Минина А. В. Действие аминогликозидных антибиотиков на генотоксичность в Allium тесте // Бюллетень науки и практики. 2022. Т. 8. №5. С. 41-48. https://doi.org/10.33619/2414-2948/78/04
Cite as (APA):
Kantsavaya, I., & Minina, A. (2022). The Effect of Aminoglycoside Antibiotics on Genotoxity in Allium Test. Bulletin of Science and Practice, 5(5), 41-48. (in Russian). https://doi.org/10.33619/2414-2948/78/04
