CC BY
17Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice Т. 8. №3. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/76
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НА УКИ/BIOLOGICAL SCIENCES
УДК 577.18-049.8:575.224 https://doi.org/10.33619/2414-2948/76/02
AGRIS F30
ВЛИЯНИЕ БЕТА-ЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ НА ПАТОЛОГИЮ МИТОЗА В ALLIUM ТЕСТЕ
©Концевая И. И., канд. биол. наук, Гомельский государственный университет
им. Ф. Скорины, г. Гомель, Беларусь, ikantsavaya@mail.ru ©Минина А. В., Гомельский государственный университет им. Ф. Скорины, г. Гомель, Беларусь, minina_anastasia17@gmail.com
BETA-LACTAM ANTIBIOTICS EFFECT ON MITOSIS PATHOLOGY AT ALLIUM TEST
©Kantsavaya I., Ph.D., Francisk Skorina Gomel State University, Gomel, Belarus, ikantsavaya@mail.ru ©Minina A., Francisk Skorina Gomel State University, Gomel, Belarus, minina_anastasia17@gmail.com
Аннотация. Исследуется влияние бета-лактамных антибиотиков (цефотаксима и аугментина) на патологию митоза в Allium тесте в первой метафазе после обработки и после завершения восстановительного периода. Методы исследования: Allium тест, цитогенетический анализ, статистический анализ. Опыт был выполнен на партии лука обыкновенного (сорт Штуттгартен), который характеризовался как генетически нестабильный по итогам микроядерного теста. Результаты тестирования на генотоксичность показали отсутствие существенного негативного влияния цефотаксима (концентрация 500,0 мг/л) независимо от времени его действия (на протяжении 1-го или 2-3 клеточных циклов) на значение показателя «патология митоза» (ПМ) по сравнению с контролем. Повышение роста патологических процессов отмечали при тестировании аугментина в концентрации 800,0 мг/л. При действии аугментина доля клеток с микроядрами увеличилась с 0,3% (в контроле) до 2,3% (в опыте), также по сравнению с контролем увеличилось значение патологии митоза с 6,1% в контроле до 10,1-16,0% в опыте, существенно возросло число клеток с мостами и к-митозом. Колхициновый митоз отмечали в вариантах «период восстановления» после аугментина (концентрация 800,0 мг/л, экспозиция — 48 ч) и после цефотаксима (концентрация 500,0 мг/л, эспозиция — 48 ч), в первом случае как типичный к-митоз у 20% клеток с ПМ, во втором случае — как рассеивание хромосом в метафазе и анафазе у 30% клеток с ПМ. В варианте применения аугментина в первой метафазе клеточного цикла после обработки выявлено слипание хромосом (12%) и мосты хромосомные и хроматидные (35%). Полученные данные свидетельствуют, что аугментин в концентрации 800,0 мг/л (экспозиция 48 ч) проявляет по сравнению с контролем генотоксичность и способен изменять скорость вступления клеток лука обыкновенного в митоз и нормальное протекание процессов деления. Восстановительный период для данного антибиотика не снижает количество клеток с патологией митоза, но изменяет их состав и спектр.
Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice Т. 8. №3. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/76
Abstract. The beta-lactam antibiotics (cefotaxime and augmentin) effect on mitosis's pathology in the Allium test in the first metaphase after processing and after finishing the recovery period is investigated. Research methods: Allium test, cytogenetic analysis, statistical analysis. The experiment was conducted on a batch of the Stuttgarten variety which is genetically unstable as the result of micronucleus test. The results of aminoglycoside antibiotics on genotoxicity testing showed the lack of negative cefotaxime's influence (in the concentration of 500.0 mg/l) on the mitosis's pathology value in comparison with the control, regardless of action time/ valid time (during the 1 or 2-3 cell cycles). The increase of pathological processes was observed when testing augmentin (in the concentration of 800.0 mg/l). Under the influence of augmentin the percent of micronucleus cells increased from 0.3% (as a control/ in a control) to 2.3% (in the experiment). Also, in comparison with the control, the value of mitosis's pathology increased from 6.1% (as a control/ in a control) to 10.1-16.0% (in the experiment). There is a significant increase of cells with bridge / cells bridge and mitosis. C-mitosis was observed in recovery period variants after applying augmentin (in the concentration of 800.0 mg/l, on exposure of 48 hours) and after cefotaxime (in the concentration of 500.0 mg/l, on exposure of 48 hours), in the first case as a typical mitosis in 20% of the cells with PM (pathology mitosis), in the second case — chromosome discharge in the metaphase and the anaphase of the 30% cells with PM. When testing augmentin in the first metaphase of the cell period, chromatic agglutination (12%), chiasma and chromatid bridges (35%) were observed. It is indicated that augmentin (in the concentration of 800.0 mg/l, on exposure of 48 hours) shows genotoxicity in comparison with the control and it's able to change the rate of entry of onion cells into mitosis and the normal course of division processes. The recovery period for this antibiotic does not reduce the number of cells with mitosis pathology, but it changes their composition and spectrum.
Ключевые слова: Allium тест, бета-лактамные антибиотики, патология митоза.
Keywords: Allium test, beta-lactam antibiotics, mitosis pathology.
Хотя антибиотики и характеризуются высокой избирательностью действия, тем не менее, они оказывают целый ряд неблагоприятных влияний на макроорганизм. По каждому антибиотику указано их неблагоприятное влияние на органы и системы органов, в частности, человека [1]. Одной из самой многочисленной групп среди антимикробных средств, занимающей ведущее место в лечении большинства инфекционных заболеваний [2, 3], являются Р-лактамные антибиотики.
Механизм антибиотической активности бета-лактамов связан с теми ферментами-мишенями, которые не имеют аналогов в эукариотической клетке. В ней нет ни жесткой клеточной стенки, ни пептидогликана, ни, соответственно, ферментов его синтеза [4]. Таким образом, поскольку пептидогликана нет в стенках эукариотических организмов, то антибиотики данной группы обладают очень низкой токсичностью для макроорганизма, и их можно применять в высоких дозах (мегатерапия) [5].
Цель работы: изучить генотоксичность бета-лактамных антибиотиков (цефотаксима и аугментина) в клетках образовательной ткани корней Allium cepa L. в первой метафазе после обработки и после завершения восстановительного периода [6].
Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice https://www.bulletennauki.com
Т. 8. №3. 2022 https://doi.org/10.33619/2414-2948/76
Материал и методы исследований Исследование ответных реакций растений лука обыкновенного в условиях действия водных растворов антибиотиков выполняли с помощью Allium теста [7] на сорте Штуттгартен. В качестве негативного контроля использовали дистиллированную воду.
Тестировали следующие антибиотики: цефотаксим (РУП «Борисовский завод медицинских препаратов», Беларусь) в концентрации 500,0 мг/л; аугментин («СмитКляйн Бичем Фармасьютикалз», Великобритания) — 800,0 мг/л. Время обработки антибиотиками составило 24 и 48 часов. Клеточный цикл в меристематических клетках корешков лука обыкновенного составляет, по разным данным, примерно 14-20 часов [8, 9]. С одной стороны, известно, что наибольшей чувствительностью к действию большинства химических веществ обладает интерфаза [6]; с другой стороны, для образовательной ткани характерна асинхронность клеточного цикла. По этой причине в эксперименте дополнительно выдерживали период восстановления [6] длительностью 24 часа, в течение которого тестируемое вещество не воздействует (вариант последействия (=восстановительный период)), и только затем выполняли фиксацию корешков. Во всех вариантах опыта фиксация производилась с 6.00 до 7.00 утра.
Давленые препараты для цитогенетического анализа, окрашенные ацетогематоксилином, изготавливали по общепринятой методике [10]. Просмотр препаратов осуществляли на компьютеризированной кариологической станции, оснащенной микроскопом Leica DMR при увеличении 40*10x1,5. Цитогенетический анализ выполняли по [10, 11].
Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета прикладного программного обеспечения Microsoft Excel и Statsoft (USA) Statistica v.7.0. Для данных, подчиняющихся нормальному закону распределения, использовали t-критерий Стьюдента. Нулевую гипотезу отклоняли при уровне статистической значимости p<0,05 [12].
Результаты исследований Следует отметить, что, согласно микроядерному тесту, тестируемая партия лука обыкновенного характеризуется генетической нестабильностью. При анализе данных, полученных в результате микроядерного теста (Рисунок 1, 2), наблюдали наличие микроядер в контрольном варианте, число клеток с микроядрами достигало 0,3%. При этом из наблюдений следует, что основным механизмом формирования микроядер являются протрузии и ядерные почки интерфазных ядер (Рисунок 1а, 1б).
а б в
Рисунок 1. Типы патологий митоза в негативном контроле (увеличение микроскопа 400*): а, б — интерфазное ядро с ядерными почками; в — рассеивание хромосом
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 8. №3. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/76
Рисунок 2. Влияние бета-лактамных антибиотиков на процент клеток с микроядрами. Варианты опыта: 2 — вода дистиллированная; 2 — цефотаксим; 500,0 мг/л — 24 часа; 3 — восстановительный период варианта 2, 4 — цефотаксим, 500,0 мг/л — 48 ч; 5 — восстановительный период варианта 4, 6 — аугментин, 800,0 мг/л — 48; 7 — восстановительный период варианта 6
В 4 раза увеличилось число клеток с микроядрами в варианте применения цефотаксима, 500,0 мг/л (экспозиция 24 час) и в 7 раз — в варианте применения аугментина, 800,0 мг/л в течение 48 час. Однако следует подчеркнуть, что после восстановительного периода у вышеуказанных вариантах применения антибиотиков число микроядер существенно уменьшается до 0,07-0,08%. В остальных вариантах были отмечены единичные клетки с микроядрами. Необходимо подчеркнуть, что микроядра имели очень маленький размер.
Наблюдали при действии бета-лактамных антибиотиков существенное возрастание значений патологии митоза (ПМ), с 6,1% — в контроле до 9,2 и 15,1%, соответственно, при использовании аугментина в концентрации 800,0 мг/л на протяжении 48 часов и в восстановительном его периоде (Рисунок 3, вариант 6 и 7).
30,00 ~Т 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00
28,38
17,81
12,72 П 52
1036 7 5Л 9,64 9,16 028
л А л ill -
16,27
2
3
4
5
6
варианты опыта I ПМ с учетом профазы ■ ПМ без учета профазы
1
7
Рисунок 3. Влияние бета-лактамных антибиотиков на патологию митоза. Обозначения вариантов - те же, что для Рисунка 2
В остальных опытных вариантах изменения значений патологии митоза несущественны по отношению к контролю. В контрольном варианте среди типов патологии митоза преобладают забегание/отставание хромосом и асинхронное веретено деления (Рисунок 4). Необходимо подчеркнуть, что данные типы патологий типичны для физиологических условий.
Бюллетень науки и практики /Bulletin of Science and Practice Т. 8. №3. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/76
Не отмечали существенных изменений по составу и спектру патологий митоза в вариантах действия цефотаксима в концентрации 500,0 мг/л в течение 24 час и 48 час, а также в варианте его последействия при меньшей экспозиции. В варианте 5 (последействие цефотаксима в течение 48 час) наблюдали увеличение в 4-8 раз клеток с такими патологиями как выбросы хромосом за веретено деления до 9,1%, рассеивание хромосом до 28,3 % по сравнению с вариантом 4 (Рисунок 4).
ев
S
Н О ев
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%
варианты опыта
□ Ас Вер
□ фрагмент
□ з/отст хр
□ слипание
□ выбр хр
□ к-митоз
□ мосты
□ разное
□ рассеив
1
2
3
4
5
6
7
Рисунок 4. Влияние бета-лактамных антибиотиков на состав и спектр патологии митоза. Обозначения вариантов те же, что для Рисунка 2
Также существенные изменения по типам патологий митоза и их количественному участию выявлены в вариантах применения аугментина. При действии данного антибиотика отмечены ранее не встречаемые в других опытных вариантах патологии митоза: мосты (как одиночные, так и множественные) в 30,3%, фрагменты — в 3,1%, слипание хромосом — в 13,0%. Согласно Алову [11], набухание и склеивание хромосом относится как к группе «патологии митоза, связанные с повреждением хромосом», так и к группе «патологии митоза, связанные с повреждением митотического аппарата». В первом случае исходом является часто гибель клеток. Во втором случае исход шире: помимо гибели клеток, возможно формирование немногочисленных микроядер в клетке, возможно восстановление митотического аппарата и нормальное завершение митоза, также могут образовываться полиплоидные ядра. В нашем опыте косвенно о последнем исходе свидетельствует наличие одиночных ядер большого размера и напрямую указывает наличие полиплоидных метафазных клеток в варианте последействия. В варианте последействия аугментина (вариант 7) по сравнению с вариантом его действия (вариант 6) наблюдали к-митоз в 21,3% случаев, а также отмечали в 3,2% случаев полиплоидные клетки.
Наиболее часто встречаемые типы патологий митоза при действии бета-лактамных антибиотиков показаны на Рисунке 5. На слайдах с патологией наблюдали рассеивание хромосом в метафазе и более часто — в анафазе, мосты одиночные и двойные, асинхронное веретено деления. Рассеивание хромосом в метафазе и анафазе косвенно свидетельствует о возможной полиплоидизации ядер. Наблюдали напрямую полиплоидные клетки (в варианте
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice https://www.bulletennauki.com
Т. 8. №3. 2022 https://doi.org/10.33619/2414-2948/76
«цефотаксим, 500,0 мг/л» — при экспозиции 24 часа» (Рисунок 5, 1б) и 48 часов (Рисунок 5, 2а).
Регистрировали маленького размера микроядра, которые формировались в результате отпочковывания ядерных почек у интерфазных клеток (Рисунок 5, 1а, 2б, 4в).
а б в
1) цефотаксим, 500,0 мг/л, 24 ч: а - ядерные почки и микроядра; б - к-метафаза, полиплоид; в -асинхронное веретено деления, пикноз клетки
а б в
2) цефотаксим, 500,0 мг/л — 48 ч: а — полиплоидная клетка; б — к-анафаза, микроядра; в — выброс хромосом за веретено деления
а б
3) последействие цефотаксим, 500,0 мг/л, 48 ч: а — выброс хромосом за веретено деления; б — к-анафаза
9
а б в
4) аугментин, 800,0 мг/л, 48 ч: а — мосты; б — ядерный мост; в — ядерные почки
Рисунок 5. Типы патологий митоза при действии бета-лактамных антибиотиков (увеличение микроскопа 400х, 100х)
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 8. №3. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/76
Заключение
Таким образом, опыт был выполнен на партии лука обыкновенного сорта Штуттгартен, который характеризовался как генетически нестабильный по итогам микроядерного теста. Результаты тестирования на генотоксичность показали отсутствие существенного негативного влияния цефотаксима (концентрация 500,0 мг/л) независимо от времени его действия (на протяжении 1 или 2-3-х клеточных циклов) на значение показателя «патология митоза» по сравнению с контролем.
Повышение роста патологических процессов отмечали при тестировании аугментина в концентрации 800,0 мг/л. При действии аугментина процент клеток с микроядрами увеличился с 0,3% (в контроле) до 2,3% (в опыте), также по сравнению с контролем увеличилось значение патологии митоза с 6,1% в контроле до 10,1-16,0% в опыте, существенно возросло число клеток с мостами и к-митозом.
Колхициновый митоз отмечали в вариантах «период восстановления» после аугментина (концентрация 800,0 мг/л, экспозиция — 48 часов) и после цефотаксима (концентрация 500,0 мг/л, экспозиция — 48 часов), в первом случае как типичный к-митоз у 20% клеток с ПМ, во втором случае — как рассеивание хромосом в метафазе и анафазе у 30% клеток с ПМ. В варианте применения аугментина в первой метафазе клеточного цикла после обработки выявлено слипание хромосом (12%) и мосты хромосомные и хроматидные (35%).
Исход к-митоза зависит от дозы и времени воздействия статмокинетического яда на делящуюся клетку. Присутствие к-метафаз в клетках образовательной ткани приводит к ингибированию прогрессии клеточного цикла, во-первых, в результате потери времени на восстановление митотического аппарата, во-вторых, по причине изменения плоидности клеток (мозаичности образовательной ткани) и, в-третьих, из-за индукции микроядер.
Полученные данные свидетельствуют, что аугментин в концентрации 800,0 мг/л (экспозиция 48 час) проявляет по сравнению с контролем генотоксичность и способен изменять скорость вступления клеток лука обыкновенного в митоз и нормальное протекание процессов деления. Восстановительный период для данного антибиотика не снижает количество клеток с патологией митоза, но изменяет их состав и спектр.
Список литературы:
1. Харкевич Д. А. Фармакология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 908 с.
2. Альберт А. Избирательная токсичность: физико-химические основы терапии. М.: Медицина, 1989. Т. 2. 432 с.
3. Егоров А. Антибиотики: прошлое, настоящее и будущее препаратов для лечения инфекционных болезней // Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2007. №3. С. 1-6.
4. Желдакова Р. А. Механизмы биосинтеза антибиотиков и их действие на клетки микроорганизмов. Минск: БГУ, 2004. 111 с.
5. Сазыкин Ю. О., Орехов С. Н., Чакалева И. И. Биотехнология. М.: Академия, 2008.
256 с.
6. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных канцерогенных химических соединений. Гигиенические критерии окружающей среды. Женева: ВОЗ, 1989. №51. 212 с.
7. Fiskesjo G. Allium test for Screening chemicals; evaluation of cytological parameters // Plants for environmental studies. 1997. V. 11. P. 307-333.
Бюллетень науки и практики / Bulletin of Science and Practice Т. 8. №3. 2022
https://www.bulletennauki.com https://doi.org/10.33619/2414-2948/76
8. Песня Д. С., Романовский А. В. Митоз в растительной клетке: норма и патология. М., 2010. 29 с.
9. Kumar L. P., Paneerselwam N. G2 studies of antimutagenic potential of chemopreventive agent curcumin in Allium cepa root meristem cells // Facta Universitatis. Series: Medicine and Biology. 2008. V. 15. №1. P. 20-23.
10. Паушева З. П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988. 271 с.
11. Алов И. А. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина, 1972. 264 с.
12. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.
References:
1. Kharkevich, D. A. (2010). Farmakologiya. Moscow. (in Russian).
2. Albert, A. (1989). Izbiratel'naya toksichnost': fiziko-khimicheskie osnovy terapii. Moscow. (in Russian).
3. Egorov, A. (2007). Antibiotiki: proshloe, nastoyashchee i budushchee preparatov dlya lecheniya infektsionnykh boleznei. Vedomosti nauchnogo tsentra ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya, (3), 1-6. (in Russian).
4. Zheldakova, R. A. (2004). Mekhanizmy biosinteza antibiotikov i ikh deistvie na kletki mikroorganizmov. Minsk. (in Russian).
5. Sazykin, Yu. O., Orekhov, S. N., & Chakaleva, I. I. (2008). Biotekhnologiya. Moscow. (in Russian). 6. Rukovodstvo po kratkosrochnym testam dlya vyyavleniya mutagennykh kantserogennykh khimicheskikh soedinenii. Gigienicheskie kriterii okruzhayushchei sredy (1989). Zheneva: VOZ, (51), 212. (in Russian).
7. Fiskesjo, G. (1997). Allium test for screening chemicals; evaluation of cytological parameters. Plants for environmental studies, 11, 307-333. (in Russian).
8. Pesnya, D. S., Romanovskii, A. V. 2010. Mitoz v rastitel'noi kletke: norma i patologiya. Moscow. (in Russian).
9. Kumar, L. P., Paneerselwam, N. (2008). G2 studies of antimutagenic potential of chemopreventive agent curcumin in Allium cepa root meristem cells. Facta Universitatis. Series: Medicine and Biology, 15(1), P.20-23. (in Russian).
10. Pausheva, Z. P. (1988). Praktikum po tsitologii rastenii. Moscow. (in Russian).
11. Alov, I. A. (1972). Tsitofiziologiya i patologiya mitoza. Moscow. (in Russian).
12. Lakin, G. F. (1990). Biometriya. Moscow. (in Russian).
Работа поступила Принята к публикации
в редакцию 01.02.2022 г. 05.02.2022 г.
Ссылка для цитирования:
Концевая И. И., Минина А. В. Влияние бета-лактамных антибиотиков на патологию митоза в Allium тесте // Бюллетень науки и практики. 2022. Т. 8. №3. С. 25-32. https://doi .org/10.33619/2414-2948/76/02
Cite as (APA):
Kantsavaya, I., & Minina, A. (2022). Beta-lactam Antibiotics Effect on Mitosis Pathology at Allium Test. Bulletin of Science and Practice, 5(3), 25-32. (in Russian). https://doi .org/10.33619/2414-2948/76/02
