CC BY
46
УДК 577.1
Дериватизация аминогликозидных антибиотиков
трис(2,6-диметоксифенил)метилием
A. П. Топольян1, М. А. Беляева1, Е. Е. Быков2, П. В. Кудан3, Е. А. Рогожин1,2,
Д. А. Стрижевская1, О. М. Иванова1, А. В. Устинов1, И. В. Михура1, И. А. Прохоренко1,2,
B. А. Коршун1,2, А. А. Формановский1*
1Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
2Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе, 119021, Москва, ул. Большая Пироговская, 11
3Федеральный исследовательский центр питания и биотехнологии, 109240, Москва,
Устьинский пр., 4/14
*E-mail: formanovsky@yandex.ru
Поступила в редакцию 25.01.2016
Принята к печати 20.04.2016
РЕФЕРАТ Детекция аминогликозидных антибиотиков как методами масс-спектрометрии, так и высокоэффективной жидкостной хроматографии представляет серьезную проблему, поскольку а) углеводная природа молекул снижает их способность к ионизации по сравнению с другими органическими молекулами, особенно в методе МАЛДИ-МС; б) отсутствие в молекулах ароматических фрагментов и амидных связей делает невозможным применение обычных УФ-детекторов в ВЭЖХ. Разработанный нами ранее подход для дериватизации аминов с использованием трис(диметоксифенил)метилиевых солей успешно применен для селективной модификации аминогликозидных антибиотиков. Модификация происходит по аминогруппе при первичном атоме углерода; присоединяемый остаток имеет ароматическую природу и несет перманентный положительный заряд, что позволяет легко детектировать аминогликозидные антибиотики методами масс-спектрометрии и обращенно-фазовой ВЭЖХ как в индивидуальном виде, так и в смесях. КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА аминогликозидные антибиотики, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, тритильный катион.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОФ-ВЭЖХ - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ГХ-МС - газовая хроматография/масс-спектрометрия; ИФА - иммуноферментный анализ; МАЛДИ-МС (MALDI MS) - масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией; НСМО ^иМО) - низшая свободная молекулярная орбиталь; ТСХ - тонкослойная хроматография; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; СНСА - 1-циано-и-гидроксикоричная кислота; DMSO - диметилсульфоксид.
ВВЕДЕНИЕ
Аминогликозиды представляют собой класс бактерицидных антибиотиков (преимущественно активных в отношении аэробной грамотрицательной микро-биоты, высокоэффективных при большинстве тяжелых инфекций (туберкулез, эндокардит, сепсис)) [1]. Действие аминогликозидов не зависит от фазы размножения микроорганизма, они необратимо связываются с белками 30S субъединицы бактериальных рибосом, нарушая тем самым синтез белка в них. Однако необходимость аэробных условий делает их применение менее эффективным в плохо снабжаемых кровью и омертвевших тканях. Еще одним фактором, влияющим на бактерицидную активность
аминогликозидов, оказывается рН среды - в кислой и нейтральной средах они менее эффективны, чем в слабощелочной среде. Главным недостатком этой группы лекарств является их высокая ото- и нефро-токсичность [2, 3] по сравнению с другими антибиотиками, что требует проведения постоянного контроля их содержания не только в биологических жидкостях, но и в продуктах питания животного происхождения. За несколько десятилетий использования этих антибиотиков в клинической медицине разработано большое число лабораторных методов детекции аминогликозидов (с использованием ГХ-МС, ВЭЖХ, в том числе с дериватизацией, ИФА, капиллярного электрофореза и т.п.). Совсем недавно опубликованы
ТОМ 8 № 3 (30) 2016 | АСТА ^ТОИАЕ | 139
ОН
НЕМ
/
НО
но
-рч
Сисомицин, М = 447 Да
ОН
НО
НгМ-^-^^ НО ОН
Канамицин, М = 484 Да
.ОН
ОН
ЫН2
НО Н2Ы
НО
ОН
Тобрамицин, М = 467 Да ОН
Н2М
NN
НО^, г
ОН
|ЧН2/
но
но^-^о
о он
Паромомицин, М = 615 Да
Рис. 1. Примеры структур аминогликозидных антибиотиков
два достаточно подробных обзора по этой тематике [4, 5]. Большое число публикаций [6-18] свидетельствует об актуальности проблемы и необходимости поиска удобных, простых и быстрых процедур, поскольку большинство существующих оказываются либо трудоемкими и долгими, либо предполагают использование дорогостоящих реагентов.
Молекулы аминогликозидных антибиотиков, как правило, содержат несколько аминогрупп (рис. 1). Помимо аминогрупп, непосредственно связанных с гетероциклом или алициклом, молекулы содержат аминогруппы, связанные с первичным атомом углерода (выделены красным цветом). Другая особенность аминогликозидов - прозрачность их растворов в УФ-диапазоне, поскольку в их молекулах отсутствуют сопряженные связи или ароматические фрагменты. Поэтому их невозможно анализировать с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором. Обилие гидрок-сильных групп и аминогрупп, способных образовывать водородные связи, затрудняет высвобождение индивидуальных молекул, что сильно снижает эффективность ионизации аминогликозидов в масс-спектрометрии, например, по сравнению с пептидами близкой массы. Кроме того, обнаружение аминогли-козидов в МАЛДИ масс-спектрометрии может осложняться попаданием сигналов вещества в область «шумов» матрицы.
Недавно нами был разработан мягкий метод де-риватизации низкомолекулярных аминов реакцией
с катионом трис(2,6-диметоксифенил)метилия 1 [19]. Образующиеся производные 9,10-дизамещенного акридиниевого катиона обладают перманент-
ным положительным зарядом (рис. 2). В результате дериватизации происходит также увеличение массы молекулы на постоянную величину (инкремент массы +359 Да), что позволяет успешно детектировать методом масс-спектрометрии МАЛДИ амины даже самой малой массы [19]. В то же время модификация гидрофильных алифатических молекул гидрофобным ароматическим катионом Q+ может иметь перспективы с точки зрения обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-детекцией.
Представляло интерес выяснить применимость этого метода для определения данного класса лекарственных препаратов. В настоящей работе представлен качественный метод обнаружения дериватизи-
ОМе
// % п®
С + р-мн2
3
ОМе
30 мин к.т.
1
МеО-
" 1<
МеО—\\ //
Рис. 2. Общая схема метода дериватизации аминов с использованием трис(2,6-диметоксифенил)метилие-вых солей (тетрафторбората или гексафторфосфата)
рованных неотщепляемои масс-спектрометрическои меткой аминогликозидных антибиотиков с помощью масс-спектрометрии и ВЭЖХ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы
В работе использовали следующие растворители: диметилсульфоксид, ацетонитрил (Panreac), остальные растворители - отечественного производства («Химмед» и «ЭКОС-1») квалификации «х. ч.» (гек-сан, метанол, дихлорметан, этилацетат, хлороформ, этанол) и «ос. ч.» (толуол, ацетон). Дихлорметан перегоняли над гидридом кальция, ДМФА перегоняли над гидридом кальция в вакууме и хранили над молекулярными ситами 3А Реактивы и сорбенты: триэтиламин, 1,3-диметоксибензол, н-бутиламин (Sigma-Aldrich-Fluka, США), аминогликозид-ные антибиотики канамицин (ОАО «Биохимик», г. Саранск, Россия), сисомицин, тобрамицин, паромо-мицин (Минхимпром СССР), алюминиевые пластины для тонкослоинои хроматографии со слоем силика-геля (Kieselgel 60 F254) или оксида алюминия, силика-гель и оксид алюминия (активность I) для колоночной хроматографии (Merck, США).
Оборудование и условия
1D и 2D (COSY, HMBC, HSQC) спектры ЯМР регистрировали при 500 МГц 0H), 125.7 МГц (13C) на спектрометре Bruker AC-500. Спектры калиброваны по остаточным сигналам протонов растворителя, DMSO-d6 (6H 2.50 м.д. и 6C 39.7 м.д.) или CD3CN (6H 1.94 м.д. для 1H и 6C 1.32 м.д.); химические сдвиги приведены относительно SiMe4 (1H и 13C). Визуализацию ТСХ-пластин проводили с помощью ультрафиолетовой лампы при 254 и 360 нм. Масс-спектры регистрировали с использованием времяпролетного масс-анализатора Ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonics, Германия), оснащенного азотным лазером (длина волны 337 нм), работающим при частоте 50 Гц в режиме регистрации положительно заряженных ионов с применением рефлектрона. Анализ и препаративное разделение модифицированных амино-гликозидных антибиотиков проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила на хроматографе Agilent Technologies 1200 Series на обращен-но-фазовой колонке Synergi Polar RP (4.5 х 250 мм) в следующих условиях: скорость потока 0.9 мл/мин, 15-50% 80% MeCN + 0.1% TFA за 30 мин, 50-70% за 20 мин, 70-90% за 10 мин, 90% за 5 мин, изократич. в течение 5 мин. Поглощение определяли при 285 нм. Анализ конверсии соединения (1) в соединение (2) проводили с помощью ВЭЖХ в градиенте ацетони-трила на хроматографе Agilent 1100 Series с муль-
тиволновым детектором на основе диодной матрицы на обращенно-фазовой колонке Symmetry C8, Waters в следующих условиях: скорость потока 1 мл/мин, градиент ацетонитрила - от 50 до 70% за 20 мин, от 70 до 98% за 10 мин.
Для проведения дериватизации, растворения аналитов и матричных соединений использовали ацетонитрил (HPLC-grade, J.T. Baker), метанол (HPLCgrade, Merck), хлороформ (HPLC-grade, Merck), ультрачистую воду типа I, полученную с использованием системы Milli-Q (Millipore). В качестве матриц применяли 2,5-дигидроксибензойную, синапиновую и 1-циано-4-гидроксикоричную кислоты (раствор 20 мг/мл в ацетонитриле с добавкой 0.1% трифторуксусной кислоты). Раствор образца (0.5 мкл) в смеси с раствором матрицы (0.5 мкл) наносили в лунку стальной мишени (MTP 384 massive target gold plate T, Bruker Daltonics, Германия) и высушивали на воздухе.
Гексафторфосфат трис(2,6-диметоксифенил)-карбения (1)[20-22]
К раствору 1,3-диметоксибензола (10.0 г, 72.4 ммоль) в 100 мл тетрагидрофурана при перемешивании в атмосфере аргона и охлаждении до -20оС прибавляли по каплям 2.5 М раствор н-бутиллития (30 мл, 76 ммоль). Через 1 ч медленно добавляли раствор ди-этилкарбоната (2.85 г, 24 ммоль) в тетрагидрофуране (10 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 сут. Растворитель удаляли при пониженном давлении. К остатку при перемешивании добавляли 200 мл диэтилового эфира, 50 мл дихлор-метана и 30 мл HPF6. Через 3 ч растворитель удаляли при пониженном давлении, затирали в 300 мл диэтилового эфира и отделяли выпавшие фиолетовые кристаллы. Получали 31.0 г (76%) соединения 1. *Н-ЯМР-спектр (CD3CN, 0Н, м. д.): 3.55 (м, 18Н, ОСН3), 6.61 (6д, 6Н, J 8.54 Гц), 7.6Н (3т, 3Н, J 8.54 Гц). Масс-спектр (МАЛДИ, m/z, CHCA): 423.15.
Гексафторфосфат 1,8-диметокси-9-(2,6-диметоксифенил)-10-(бутил)акридиния (2)
К раствору гексафторфосфата трис(2,6-диметокси-фенил)метилия (1) (1.0 г, 1.76 ммоль) в ацетонитриле (15 мл) при перемешивании при комнатной темпе-
ТОМ 8 № 3 (30) 2016 | ACTA NATURAE | 141
ратуре в атмосфере аргона добавляли н-бутиламин (350 мкл, 3.52 ммоль). Цвет раствора изменялся от фиолетового к красному. Через 1 ч растворитель удаляли при пониженном давлении, твердый осадок затирали в диэтиловом эфире, образовавшийся красный осадок отфильтровывали и сушили в эксикаторе при пониженном давлении. Получали 1.0 г соединения 2 (98%). *Н-ЯМР-спектр (CD3CN, 6Н, м. д.): 1.15 (т, 3H, J 7.3 Гц, Н-4"), 1.73-1.80 (м, 2H, Н-3"), 2.16-2.22 (м, 2H, Н-2"), 3.57 (с, 6H, OCH3), 3.59 (с, 6H, OCH3), 5.065.09 (м, 2H, Н-1"), 6.81 (д, 2H, J 8.5 Гц, H-3', H-5'), 7.12 (д, 2H, J 8.2 Гц, Н-2, Н-7), 7.45-7.48 (м, 1H, Н-4'), 7.93 (д, 2H, J 9.2 Гц, Н-4, Н-5), 8.20-8.24 (м, 2H, Н-3, Н-6). 13С-ЯМР-спектр (CD3CN, 6С, м. д.): 12.96 (4''), 19.61 (3''), 29.52 (2''), 52.37 (1''), 55.64 (О CH3), 56.76 (OCH3), 103.74 (3', 5'), 106.50 (2, 7), 109.26 (4, 5), 119.67 (1'), 119.89 (9), 129.40 (4'), 139.87 (3, 6), 141.61 (1, 8), 155.79 (2', 6'), 157.18 (8a, 9a), 160.58 (4a, 10a). Масс-спектр (МАЛДИ, m/z, CHCA): 432.30.
Общая методика получения конъюгатов гексафторфосфата трис(2,6-диметоксифенил)-метилия с аминоуглеводами (аминоглюцитолом, тобрамицином, паромомицином, сисомицином)
К 150 мкл 0.5 х 10-2 М раствора гексафторфосфата трис(2,6-диметоксифенил)метилия в ацетонитри-ле добавляли 1 экв. соответствующего аминоу-глевода в 200 мкл карбонатного буфера (рН 9.55). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Анализ конъюгатов проводили прямо из реакционной смеси без дополнительной очистки.
Гексафторфосфат 1,8-диметокси-9-(2,6-диметоксифенил)-10-(6'-дезазаканамицин-6'-ил)-акридиния (3)
К раствору сульфата канамицина (7.8 мг, 0.015 ммоль) в 2 мл буферного раствора (рН 9.55) при перемешивании добавляли 2.8 мг (0.005 ммоль) гексафторфосфата трис(2,6-диметоксифенил)метилия (1) в ацетонитриле. Реакционную смесь выдерживали в течение 30 мин и очищали с помощью препаративной ВЭЖХ. Получали 10.9 мг соединения (3) (74%). *Н-ЯМР-спектр (БМБО-^, 6Н, м. д.): 1.69-1.72 (м, 1Н, Н-2), 2.31-2.33 (м, 1Н, Н-2), 3.17-3.22 (м, 1Н, Н-3"),
3.36 (м, 1Н, Н-2'), 3.38 (м, 1Н, Н-1/Н-3), 3.40 (м, 1Н, Н-4'), 3.45 (м, 1Н, Н-1/Н-3), 3.48 (м, 3Н, ОСН3), 3.50 (м, 6Н, ОСН3), 3.51 (м, 1Н, Н-3'), 3.52 (м, 1Н, Н-6"), 3.53 (м, 1Н, Н-4"), 3.56 (м, 3Н, ОСН3), 3.57 (м, 1Н, Н4/6), 3.60 (м, 1Н, Н-6"), 3.66 (м, 1Н, Н4/6), 3.68 (м, 1Н, Н-2"), 3.73 (м, 1Н, Н-5), 3.76 (м, 1Н, Н-5"), 4.57-4.60 (м, 1Н, Н-5'), 4.74 (с, 1Н, ОН), 5.03 (д, J 3.7 Гц, 1Н, Н-1''), 5.26 (с, 1Н, ОН), 5.32 (м, 1Н, Н-1'), 5.35 (м, 1Н, Н-6'), 5.55 (м, 1Н, Н-6'), 6.49 (м, 1Н, ОН), 6.79-6.83 (м, 2Н, Н-3"", Н-5""), 6.91 (с, 1Н, ОН), 7.17 (м, 1Н, Н-2'''), 7.20 (м, 1Н, Н-7'''), 7.42-7.45 (т, 1Н, J 8.5 Гц, Н-4''''), 8.18 (м, 1Н, Н-3'''), 8.19 (м, 1Н, Н-6'''), 8.33-8.35 (м, 1Н, Н-5'''), 8.45 (м, 1Н, Н-4'''). 13С-ЯМР-спектр (DMSO-d6, 6С, м. д.): 27.48 (2), 46.78 (1/3), 49.28 (1/3), 53.34 (6'), 55.32 (3''), 55.87 (ОСН3), 57.06 (ОСН3), 59.49 (6''), 65.28 (4''), 68.39 (2''), 70.49 (5'), 70.94 (5), 70.98 (2'), 72.33 (4'), 72.58 (3'), 73.08 (5''), 80.33 (6/4), 83.46 (4/6), 95.66 (1'), 99.28 (1''), 103.57 (3"75""), 103.79 (3"75""), 106.50 (2'''), 106.75 (7'''), 110.78 (5'''), 111.12 (4'''), 117.60 (1''''), 119.21 (2"'У6'"'), 119.30 (2''''/6''''), 129.19 (4''''), 139.08 (3'''), 139.68 (6'''), 142.32 (1'''/8'''), 143.00 (8"'/Г"), 155.65 (9'''), 156.39 (10а'''/4а'''), 158.37 (9а'''/8а'''), 159.63 (8а'''/9а'''), 159.70 (4а'''/10а'''). Масс-спектр (МАЛДИ, тД, СНСА): 843.67.
Методика дериватизации смеси антибиотиков
Смешали по 10 мкл 0.005 М растворов каждого антибиотика (канамицина, сисомицина, тобрамицина и паромомицина) в карбонатном буфере (рН 9.55). К полученному раствору добавили 100 мкл карбонатного буфера (рН 9.55) и 50 мкл 0.005 М раствора соли 1 в ацетонитриле. Пробы для анализа отбирали прямо из реакционной смеси.
Экспериментальная оценка значения рКк+ соединения 2 [21, 22]
Для оценки значения рКн+ соединения 2 был приготовлен ряд растворов в смеси Н2О/ DMSO/Bu4NOH с различным содержанием DMSO при постоянной концентрации вещества. Стоковый раствор исходного соединения добавляли непосредственно перед спектрофотометрическими измерениями. В сильноосновных условиях в системе присутствуют как кар-бокатион Н+, так и его неионизированная форма в виде соответствующего тританола НОН, имеющие максимальное поглощение при различных длинах волн. Полученные значения оптической плотности в области максимального поглощения карбокатиона (^ = 289 нм) использовали для расчета соотношения [Н+]/[НОН]. Для определения значения рКН+ были построены зависимости log([R+]/[ROH]) от функций основности Н_ и С_, значения которых в каждом растворе определяются мольным содержанием DMSO. С учетом погрешности измерений полученное значение рКН+ составляет 18.1 ± 0.5.
Квантово-химические расчеты
Структуры участников модельного механизма превращений рассчитывали посредством программного пакета Gaussian-09 [23] полуэмпирическим методом РМ3 с полной оптимизацией геометрических параметров молекул реагентов и продуктов. Последующее вычисление частот нормальных колебаний по стандартной процедуре пакета Gaussian-09 показало, что рассчитанные структуры отвечают критериям стационарной точки (минимумы и седловые точки ППЭ). Результаты расчетов визуализировали при помощи программы СЬетСга^ [24].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С целью определения оптимальных условий функ-ционализации аминов была изучена реакция гек-сафторфосфата трис(2,6-диметоксифенил)метилия 1 с п-бутиламином (рис. 3).
Установлено, что при избытке амина полная конверсия исходного субстрата 1 в единственный продукт 2 завершается уже при комнатной температуре в течение 10 мин в ацетонитриле. Полнота превращения легко контролируется обычной ОФ-ВЭЖХ, поскольку соединение 2 поглощает свет в УФ-диапазоне (рис. 4). Реакция не требует каких-либо специальных условий.
Структура аддукта 2 была подтверждена с помощью Ш и 2D ЯМР-спектроскопии с полным отнесением сигналов в спектрах ЯМР 1Н и 13С (см. «Экспериментальную часть»). Механизм образования вещества 2, по-видимому, включает ипсо-атаку аминогруппы в ортоположение одного из бензольных колец с последующим элиминированием метокси-группы в виде метанола и повторным нуклеофиль-ным замещением во второе кольцо [21].
В сильнощелочной среде окрашенный катион 2 способен присоединять гидроксид-анион и переходить в бесцветный тританол. Один из параметров для оценки стабильности карбокатиона - величина рК^, физический смысл которой заключается в значении рН, при котором равны концентрации катионной (окрашенной) и неокрашенной формы. Для соединения 2 экспериментальная оценка дает значение рК^ « 18, что свидетельствует об исключительно высокой стабильности катиона: даже в слабощелочных условиях доля катионной формы составляет 100%.
Квантово-химический расчет полуэмпирическим методом РМ3 показывает, что для катиона 1 характерна структура пропеллерного типа (рис. 5А). Рассчитанная геометрическая конфигурация катиона 2 (на примере Q+-Et) характеризуется ярко выраженным выведением диметоксифенильной
ОМе ОМе
У/
С© +
30 мин
МеО
ОМе \=
Н2М-
к.т.
(© N1-
ОМе, МеО—^
1 2
Рис. 3. Схема реакции катиона 1 с н-бутиламином
к и л
48 |
40 =
32 | 1
24 |
16 |
8 I У
10 15 20
Время удерживания, мин
480 :
400 :
320 :
240 :
160 :
80
0.75-
е и
ен ?
о гл
о П
1-1-1-1—
200 240 280 320
(нм)
I I 11 I I I 11 I I I 11 I I I 11 I I I 11 I I I 11 I I I I I I I I I 11 I I I 11 I
0 5 10 15 20
Время удерживания, мин
Рис. 4. Профиль ОФ-ВЭЖХ исходного соединения 1 (верхний) и реакционной смеси с 1 с н-бутиламином (нижний). Условия - в «Экспериментальной части». На врезке - спектр поглощения вещества 2
группы в плоскость, ортогональную акридиновому фрагменту, и высокой симметрией (рис. 5Б).
Также были оценены формальные заряды, которые составляют 0.324 на С-атоме и 0.300 на ^атоме центрального кольца акридинового фрагмента. С этим распределением зарядов совпадает и рассчитанная плотность НСМО-орбитали на тех же ато-
ТОМ 8 № 3 (30) 2016 | АСТА NATURAE | 143
Л
* >> 1
т
. У 1
т 1
, 4> ,
а т *
____•
V
■^ггт
2а 2Ь
Рис. 6. Резонансные структуры соединения 2
15000 12000
с о н
ш
и с н е т н
X
9000
6000
3000
350
400
450
500
550
600
т^
Рис. 5. Рассчитанные методом РМ3 - конфигурация НСМО-орбитали исходного гексаметокситрильного карбокатиона (Л); 3D-структура катиона 0+-Е1 (Б); конфигурация НСМО-орбитали катиона 0+-Е1 (Б). Б и Б — атомы углерода показаны желтым цветом, кислорода — красным, азота — розовым, водорода — бирюзовым
мах (рис. 5В). Таким образом, положительный заряд в большей степени локализован на центральном атоме углерода и резонансная структура 2а лучше отражает строение веществ типа Q+-R (рис. 6).
Затем была изучена дериватизация простейшего аминоуглевода, аминоглюцитола. Аминоглюцитол в свободном виде невозможно определить методом масс-спектрометрии МАЛДИ из-за небольшой молекулярной массы (181 Да) и затрудненной ионизу-емости молекулы. Контролируя методом ТСХ исчезновение пятна исходного аминоспирта при действии на него избытка дериватизирующего агента, установлено, что реакция проходит за 30 мин при комнатной температуре, и в спектре МАЛДИ-МС виден четкий сигнал, соответствующий ожидаемой массе конъю-гата (рис. 7).
Для изучения возможности аналогичной дерива-тизации аминогликозидных антибиотиков мы выбрали канамицин, сисомицин, паромомицин, тобрамицин
Рис. 7. Масс-спектр МАЛДИ конъюгата 1 с аминоглю-цитолом (матрица — синапиновая кислота)
(рис. 1). Поскольку коммерчески доступный препарат канамицина выпускается в форме сульфата канами-цина, образец был растворен в карбонатном буфере (рН 9.55). Как и в случае с п-бутиламином, реакция идет практически с полной конверсией (рис. 8).
Особенностью строения исследуемых аминоглико-зидов является присутствие нескольких аминогрупп, и модификация может проходить по любой из них. Однако реакция протекает гладко и дает один основной продукт (рис. 8), который был выделен препаративно методом ОФ-ВЭЖХ. Анализ 2D ЯМР-спектров вещества 3 показал, что дериватизация проходит селективно по аминогруппе первичного атома углерода (см. «Экспериментальную часть»). По-видимому, это связано с более высокой стерической доступностью этой аминогруппы по сравнению с аминогруппами, непосредственно связанными с атомами углерода шестичленных циклов и экранированных соседними гидроксильными группами.
Продукт дериватизации легко детектируется масс-спектрометрически: при нанесении в ячейку мишени масс-спектрометра 2 х 10-12 моль конъюгата 3 в спектре МАЛДИ-МС (рис. 9) наблюдается соответствующий сигналу вещества отчетливый пик с высоким соотношением сигнал/шум. Стоит отме-
Б
300
250
200
С 150
о 100
50
11111111111111111111111111111111111111111
1111111111111111111
10 20 30 40 50
Время, мин
2500 j
OH
2000 : < о
"E 3 HO НО-/
HO f
1500 E
1000 j
500 E 1
I ■ и 1111111111111111 L h . h I 1 II 1 I 1 1 1 1 I 1 1 1 1 I 1 II 1 I 1 1 M I 1 1 1 1 I II 1 1 I 1 1 1 1 I
nh2
^он
V
10 20 30 40 50 Время, мин
Рис. 8. Профиль ВЭЖХ соединения 1 (верхний) и конъюгата 3 (1 с канамицином) (нижний). Условия см. в «Экспериментальной части»
2500 2000 1500 1000 500
и О
н
CQ
и
U
н е
9000
6000
3000
200 300 400 500 600 700 800 900
m/z
Рис. 9. Пик в масс-спектре конъюгата 3 при нанесении 2 х 10-12 моль вещества в ячейку мишени для масс-спектрометра (матрица — синапиновая кислота) (s/n 47.2)
тить, что увеличение массы исследуемого вещества на 359 Да позволяет сместить сигнал в спектре в сторону больших значений, что исключает перекрывание с сигналами матрицы.
Чтобы ответить на вопрос, как дериватизация влияет на чувствительность обнаружения канамицина в МАЛДИ-МС, был проведен эксперимент по со-
300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
m/z
Рис. 10. Спектр МАЛДИ-МС эквимолярной смеси соединения 3 (m/z 843 (s/n 301.3)) и немодифицирован-ного канамицина (m/z 485 (s/n 1.8) [M+H+]) (матрица — синапиновая кислота)
вместнои детекции канамицина и продукта его дери-ватизации. На рис. 10 представлен спектр МАЛДИ-МС эквимолярной смеси немодифицированного канамицина и соединения 3.
Интенсивность пика тритил/акридиниевого производного настолько высокая, что превосходит интенсивность пика немодифицированного антибиотика не менее чем на два порядка, и визуально полностью нивелирует его. При увеличении соотношения канамицин/канамицин-Q* до 200 : 1 видно, что интенсивности сигналов становятся одного порядка, но интенсивность пика производного 3 все равно превосходит таковую для немодифициро-ванного соединения (рис. 11). Таким образом, Q+-дериватизация снижает предел обнаружения кана-мицина в МАЛДИ-МС на несколько порядков.
При обработке канамицина избытком соли 1 продуктом все равно остается соединение 3: реакционная способность остальных аминогрупп значительно уступает активности группы -CH2NH2. Это свойство было использовано для одновременной детекции нескольких аминогликозидных антибиотиков с помощью масс-спектрометрии. На смесь четырех антибиотиков действовали избытком соли 1 и регистрировали МАЛДИ-масс-спектр образующихся аддуктов (рис. 12). В полученном масс-спектре видны сигналы аддуктов канамицин-Q* (3) (m/z 843, s/n 142.8), сисомицин-Q* (m/z 806, s/n 166.4), тобрамицин-Q* (m/z 826, s/n 233.2) и паромомицин-Q* (m/z 974, s/n 56.7).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предложенный метод дериватизации аминосодер-жащих углеводов позволяет определять их с помощью масс-спектрометрии МАЛДИ и ОФ-ВЭЖХ
ТОМ 8 № 3 (30) 2016 | ACTA NATURAE | 145
и О X СП
s
и
X
ф
н X
X
3000 2500 2000 1500 1000 500
500 550 600 650 700 750 800 850
m/z
Рис. 11. Спектр МАЛДИ-МС смеси канамицина (m/z 485 (s/n 49.1) [M+H+]) и конъюгата 3 (m/z 843 (s/n 89.5)) в соотношении концентраций 200 : 1 (0.01 М : 0.00005 М) (наносили по 0.9 мкл каждого) (матрица -1-циано-4-гидроксикоричная кислота)
20000
и
115000
m
х
и
£10000 i X
5000
810 840 870 900
930 960
990 m/z
Рис. 12. Спектр МАЛДИ-МС смеси модифицированных антибиотиков (матрица — синапиновая кислота). Условия в «Экспериментальной части»
с УФ-детектором. Показано, что модификация идет по аминогруппе, связанной с первичным атомом углерода. Дериватизация позволяет увеличить чувствительность масс-спектрометрической детекции аминогликозидов на несколько порядков. Преимуществами метода являются экспрессность, экспериментальная простота и доступность реагентов. •
Авторы выражают благодарность Н.В. Бовину за предоставленный аминоглюцитол и Р.С. Борисову за полезное обсуждение. Работа выполнена при поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Siegenthaler W.E., Bonetti A., Luthy R. // Am. J. Med. 1986. V. 80. № 6B. P. 2-14.
2. Jackson J., Chen C., Buising K. // Curr. Opin. Infect. Dis. 2013. V. 26. № 6. P. 516-525.
3. Becker B., Cooper M.A. // ACS Chem. Biol. 2013. V. 8. № 1. P. 105-115.
4. Tian Y., Chen G., Guo L., Guo X., Mei X. // Food Anal. Meth. 2015. V. 8. № 7. P. 1842-1857.
5. Farouk F., Azzazy H.M.E., Niessen W.M.A. // Anal. Chim. Acta. 2015. V. 890. P. 21-43.
6. Diez C., Guillarme D., Sporri A.S., Cognard E., Ortelli D., Edder P., Rudaz S. // Anal. Chim. Acta. 2015. V. 882. P. 127-139.
7. Li R., Liu Y., Cheng L., Yang C., Zhang J. // Anal. Chem. 2014. V. 86. № 19. P. 9372-9375.
8. Zengin A., Tamer U., Caykara T. // Anal. Chim. Acta. 2014. V. 817. P. 33-41.
9. Котова В.Ю., Рыженкова К.В., Манухов И.В., Завильгель-ский Г.Б. // Прикл. биохим. микробиол. 2014. Т. 50. № 1.
С. 112-117.
10. Dijkstra J.A., Sturkenboom M.G.G., van Hateren K., Koster R.A., Greijdanus B., Alffenaar J.-W.C. // Bioanalysis. 2014. V. 6. № 16. P. 2125-2133.
11. Li D., He S., Deng Y., Ding G., Ni H., Cao Y. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2014. V. 93. № 1. P. 47-52.
12. Sharma T.K., Ramanathan R., Weerathunge P., Mohammad-taheri M., Daima H.K., Shukla R., Bansal V. // Chem. Com-mum. 2014. V. 50. № 100. P. 15856-15859.
13. Bijleveld Y., de Haan T., Toersche J., Jorjani S., van der Lee J., Groenendaal F., Dijk P., van Heijst A., Gavilanes A.W.D., de Jonge R., et al. // J. Chromatogr. B. 2014. V. 951/952. P. 110-118.
14. Korany M.A.-T., Haggag R.S., Ragab M.A., Elmallah O.A. // J. Chrom. Sci. 2014. V. 52. № 8. P. 837-847.
15. Воронежцева О.В., Ермолаева Т.Н. // Сорбц. хром. проц. 2011. Т. 11. № 1. С. 68-76.
16. Левин Г.Я., Соснина Л.Н. // Антибиот. химиотер. 2014. Т. 59. № 3/4. С. 10-11.
17. Chen J., Li Z., Ge J., Yang R., Zhang L., Qu L., Wang H., Zhang L. // Talanta. 2015. V. 139. P. 226-232.
18. Wang Y., Ji S., Zhang F., Zhang F., Yang B., Liang X. // J. Chromatogr. A. 2015. V. 1403. P. 32-36.
19. Топольян А.П., Стрижевская Д.А., Слюндина М.С., Беляева М.А., Иванова О.М., Коршун В.А., Устинов А.В., Михура И.В., Формановский А.А., Борисов Р.С. // Масс-спектрометрия. 2015. Т. 12. № 4. С. 253-258.
20. Martin J.C., Smith R.G. // J. Am. Chem. Soc. 1964. V. 86. № 11. P. 2252-2256.
21. Laursen B.W., Krebs F.C. // Chem. Eur. J. 2001. V. 7. № 8. P. 1773-1783.
22. Laursen B.W., Krebs F.C., Nielsen M.F., Bechgaard K., Christensen J.B., Harrit N. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. № 47. P. 12255-12263.
23. Frisch M.J., Trucks G.W., Schlegel H.B., Scuseria G.E., Robb M.A., Cheeseman J.R., Scalmani G., Barone V., Mennucci B., Petersson G.A., et al. // Gaussian, Inc., Wallingford CT, 2009.
24. http://www.chemcraftprog.com/
