CC BY
63
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
6. Bekesi G., Tulassay Z., Racz K. et al. The effect of estrogens on superoxide anion generation by human neutrophil granulocytes: possible consequences of the antioxidant defense // Gynecol. Endocrinol. - 2007. - Vol. 2. - P. 1-4.
7. Chiang K., Parthasarathy S., Santanam N. Estrogen, neutrophils and oxidation // Life Sci. - 2004. - Vol. 75, N 20. - P. 2425-2438.
8. CutoloM., SulliA., Capellino S. et al. Sex hormones influence on the immune system: basic and clinical aspects in autoimmunity // Lupus. - 2004. - Vol. 13. - P. 635-638.
9. Deitch E. A., Ananthakrishnan P., Cohen D. B. et al. Neutrophil activation is modulated by sex hormones after trauma-hemorrhagic shock and burn injuries // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2006. - Vol. 29, N 3. - P. 1456-1465.
10. Ellis T. M., MoserM. T., Le P. T. et al. Alterations in peripheral B cells and B cell progenitors following androgen ablation in mice // Int. Immunol. - 2001. - Vol. 13, N 4. - P. 553-558.
11. Itoh M., Takahashi T., Sakaguchi N. et al. Thymus and autoimmunity: production of CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self-tolerance // J. Immunol. - 1999. - Vol. 162, N 9. - P. 5317-5326.
12. Karpuzoglu E., PhillipsR. A., GodalR. M., Ansar-AhmedS. IFN-gamma-inducing transcription factor, T-bet is upregulated by estrogen in murine splenocytes: role of IL-27 but not IL-12 // Mol. Immunol. - 2007. - Vol. 44, N 7. - P. 1819-1825.
13. KincadeP. W., MedinaK.L.,PayneK. J. et al. Early B-lymphocyte precursors and their regulation by sex steroids // Immunol. Rev. -2000. - Vol. 175. - P. 128-137.
14. Klein S. L., Roberts C. W. Sex Hormones and Immunity to Infection. - Amsterdam, 2010.
15. Maurer M., Trajanoski Z., Frey G. et al. Differential gene expression profile of glucocorticoids, testosterone, and dehydroepi-androsterone in human cells // Horm. Metab. Res. - 2001. - Vol. 33, N 12. - P. 691-695.
16. Mullen A. C., High F. A., Hutchins A. S. et al. Role of T-bet in commitment of TH1 cells before IL-12-dependent selection // Science. - 2001. - Vol. 292, N 5523. - P. 1907-1910.
17. Olsen N. J., Kovacs W. J. Effects of androgens on T and B lymphocyte development // Immunol. Res. - 2001. - Vol. 23. - P. 281-288.
18. Prieto G. A., Rosenstein Y. Oestradiol potentiates the suppressive function of human CD4+CD25+ regulatory T cells by promoting their proliferation // J. Immunol. - 2006. - Vol. 118. - P. 58-65.
19. QiuC.L., ZhaoH., YangG.B. et al. Flow cytometric characterization of T lymphocyte subsets in the peripheral blood of Chinese rhesus macaques: normal range, age- and sex-related differences // Vet. Immunol. Immunopathol. - 2008. - Vol. 124. - P. 313-321.
20. Tai P., Wang J., Jin H. et al. Induction of regulatory T cells by physiological level estrogen // J. Cell. Physiol. - 2008. - Vol. 214, N 2. - P. 456-464.
21. Tryphonas H., Lacroix F., Hayward S. et al. Cell surface marker evaluation of infant Macaca monkey leukocytes in peripheral whole blood using simultaneous dual-color immunophenotypic analysis // J. Med. Primatol. - 1996. - Vol. 25. - P. 89-105.
22. Uppal S. S., Verma S., DhotP. S. Normal values of CD4 and CD8 lymphocyte subsets in healthy Indian adults and the effects of sex, age, ethnicity, and smoking // Cytometry B: Clin. Cytom. -2003. - Vol. 52. - P. 32-36.
23. WeinbergA.,EnomotoL.,MarcusR., CanniffJ. Effect ofmenstrual cycle variation in female sex hormones on cellular immunity and regulation // J. Reprod. Immunol. - 2011. - Vol. 89. - P. 70-77.
24. Wichmann M. W., Muller C., Meyer G. et al. Different immune responses to abdominal surgery in men and women // Langenbecks Arch. Surg. - 2003. - Vol. 387. - P. 397-401.
25. Wunderlich F., Benten W. P., Lieberherr M. et al. Testosterone signaling in T cells and macrophages // Steroids. - 2002. - Vol. 67, N 6. - P. 535-538.
Поступила 13.12.11
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 616-006.04-092:612.017.1-018.83]-092.9
Н. Ю. Анисимова2, R Я. Власенко1, М. В. Киселевский2, О. В. Козырева1, Ю. Е. Цветков3,
Е. А. Хатунцева3, Н. Э. Нифантьев3, R Н. Степаненко1
ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ - АДЪЮВАНТ ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА НА
синтетический углеводный фрагмент, конъюгированный с белком
Федеральное государственное бюджетное учреждение Государственный научный центр Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства (115478, г Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2); Российский онкологический научный центр им. акад. Н. Н. Блохина РАМН (115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24); 3Институт органической химии им. Н. д. Зелинского Российской академии наук (119991, г Москва, В-334, Ленинский пр-т, д. 47)
Известно, дендритные клетки (дК) являются эффективным эндогенным адъювантом иммунного ответа на онкоантигены белковой природы. Однако это свойство дК малоизучено в отношении гликолипидных онкоантигенов, одним из которых является ганглиозид GM3 - низкоиммуногенный опухольассоциированный антиген, представленный на клетках меланомы, нейробластомы и некоторых других опухолей. Нами был синтезирован синтетический аналог углеводного фрагмента этого ганглиозида. Синтезированные углеводные цепи были ковалентно присоединены к высокоиммуногенному белку гемоцианину. Цель данной работы - выяснить, способны ли ДК, пульсированные этим конъюгатом, индуцировать иммунный ответ на антигенные детерминанты, представленные на его углеводных и белковых компонентах. Установлено, что введение мышам ДК, пульсированным конъюгатом, приводит к образованию антител, синтетическому углеводному фрагменту и гемоцианину, а также к появлению цитотоксических лимфоцитов против клеток меланомы В16.
Ключевые слова: дендритные клетки, опухольассоциированные антигены, иммунный ответ на опухольассо-циированные антигены
- 123 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012
N.Yu. Anisimova, R.Ya. Vlasenko, M.V Kiselevsky, O.V Kozyreva, Yu.E. Tsvetkov, E.A. Khatuntseva, N.E. Nifantiev,
R.N. Stepanenko
DENDRITIC CELLS AS AN ADJUVANT FOR THE INDUCTION OF THE IMMUNE RESPONSE TO A SYNTHETIC PROTEIN-CONJUGATED CARBOHYDRATE FRAGMENT
Dendritic cells (DC) are known to constitute an efficacious endogenous adjuvant of the immune response to the oncoantigens of protein nature. At the same time, this property of DC with respect to glycolipid oncoantigens, such as ganglioside GM3 (a low-immunogenic tumour-associated antigen), is poorly known. This ganglioside is localized in the cells of melanoma, neuroblstoma, and some other tumours. we have synthesized a synthetic analog of the carbohydrate fragment of this ganglioside. The synthesized carbohydrate chains were covalently attached to the high-imunogenic protein hemocyanin. The objective of the present study was to elucidate whether the dendritic cells treated with this conjugate are capable of inducing an immune response to antigen determinants localized at its carbohydrate and protein components. It was shown that the administration of the conjugate-treated dendritic cells to the mice resulted in the formation of antibodies to both the synthetic carbohydrate fragment and hemocyanin. Simultaneously, cytotoxic lymphocytes against melanoma B16 cells appeared.
Key words: dendritic cells, tumour-associated antigens, immune response against tumour-associated antigens
Введение. Разработка методов стимуляции иммунного ответа на антигены опухолевых клеток в настоящее время рассматривается как один из возможных способов повышения эффективности лечения онкологических заболеваний [1, 7, 8, 15, 16, 20, 24]. Однако опухольассоциированные антигены являются слабоиммуногенными и без дополнительной стимуляции иммунной системы адъювантами практически не способны вызывать иммунный ответ [1, 8, 23]. В настоящее время считается, что одним из наиболее эффективных эндогенных адъювантов для индукции иммунного ответа на онкоантигены являются дендритные клетки (ДК). Разработанные в последние годы методики получения этих клеток и их культивирования ex vivo позволили использовать ДК в качестве индукторов специфического противоопухолевого иммунного ответа в экспериментальных исследованиях и клинических испытаниях [2, 9].
Наиболее часто для индукции противоопухолевого иммунного ответа ДК, полученные у пациентов с онкологическим заболеванием, инкубируют ex vivo - либо с лизатом опухолевых клеток, либо с опухоль ассоциированными антигенами белковой природы. Известно, что ДК процессируют захваченные белки в пептиды, которые экспрессируются совместно с главным комплексом гистосовместимости (HLA) I или II типов и в дальнейшем распознаются CD8+ и CD4+-Т-клетками соответственно [19]. В то же время многие опухольассоциированные антигены имеют гликолипидную природу, в этом случае ДК презенти-руют антигенные детерминанты опухолевых антигенов Т-клеткам на CD1-молекулах (CD1a-d), которые структурно аналогичны МНС I [21, 22].
Одним из характерных опухольассоциированных антигенов гликолипидной природы является ганглио-зид GM3. Повышенная экспрессия данного ганглио-зида выявлена на клетках меланомы, рака желудка, карцином различного происхождения, которые часто дают метастазы в мозг [3-5]. При этом получены многочисленные данные о существенной роли данного ганглиозида в процессах метастазирования [4, 6].
Современные методы олигосахаридного синтеза позволяют получать основные типы углеводных опу-хольассоциированных антигенов. Мы синтезировали
Степаненко Родион Николаевич - д-р мед. наук, зав. лаб., тел. 8(499)617-79-33
углеводный фрагмент ганглиозида GM3, аномерная конфигурация которого соответствует конфигурации в природном олигосахаридном антигене [13]. С целью повышения иммуногенности полученный синтетический углеводный фрагмент был конъюгирован с белком гемоцианином (KLH) [13]. Установлено, что данный конъюгат при введении экспериментальным животным способен индуцировать образование антител IgM- и IgG-класса к углеводному фрагменту ганглиозида GM3 [11, 12].
По своей химической природе конъюгат представляет собой комплекс синтетических углеводных цепей гликолипидного антигена и белка. В среднем на 1 молекулу белка приходится около 500 синтетических углеводных фрагментов.
Цель работы - выяснить, способны ли ДК после инкубации с полученным конъюгатом индуцировать иммунный ответ на антигенные детерминанты, представленные на его углеводных и белковых компонентах. Установлено, что введение экспериментальным животным ДК, пульсированных конъюгатом, приводит к образованию антител как к синтетическому углеводному фрагменту, так и KLH, а также к появлению цитотоксических лимфоцитов против клеток меланомы В16.
Материалы и методы. Животные. Исследования проводили на мышах-самцах линии C57B1/6 в возрасте 2,5 мес. Мышей содержали в виварии отдела лабораторных животных РОНЦ им. акад. Н. Н. Блохина РАМН на стандартном пищевом рационе брикетированных экструзированных кормов со свободным доступом к корму и питьевой воде.
Генерация ДК. Из костного мозга, полученного из трубчатых костей мышей, выделяли мононуклеарные лимфоциты (МЛ). Для получения МЛ взвесь клеток костного мозга центрифугировали при 400 g в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-урографина («Sigma», США) плотностью 1,077 г/см3. МЛ, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и трехкратно отмывали средой. МЛ вносили в пластиковые флаконы («Costar», США), инкубировали в течение 4 ч. Затем удаляли неприлипшие клетки и культивировали прилипшие клетки с добавлением по 20 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) («Biosourse», США) и интерлейкина (ИЛ)-4 («Biosourse», США) в среде RPMI-1640 («ПанЭко», РФ) в течение 5 сут. Затем ДК пульсировали конъюгатом (из расчета 20 мкг сиалиллактозы и 550 мкг белка гемоцианина на 10 млн ДК). На 7-е сутки в среду добавляли фактор некроза опухолей а - ФНОа («Biosourse», США) 10 нг/мл и через 24 ч клеточные культуры отмывали в среде. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g в течение 10 мин.
- 124 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Анализ фенотипа ДК. Фенотип ДК исследовали с использованием моноклональных антител («Caltag Laboratories», США) к соответствующим антигенам. Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и окрашивали FITC (флюоресцеинизотиоцианат)-меченными антителами. Затем отмывали 2 раза холодным ФСБ. Результаты учитывали на проточном цитометре FacsCalibur («Becton Dickinson», США). На ДК, полученных из красного костного мозга мышей, исследовали уровень экспрессии молекул CD40, CD80, CD83, CD86. Гейт популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 10 000 клеток в гейте. Статистическую обработку материала проводили при помощи программного пакета WINMDI 2.8.
Иммунизация животных. ДК, пульсированные конъю-гантом, вводили 2-кратно с интервалом 2 нед внутрибрюшинно по 250 тыс. клеток на 1 мышь.
Для иммунизации мышей конъюгатом синтетических углеводных фрагментов GM3 и белка гемоцианина использовали две схемы: 1-я - 2-кратно с интервалом 2 нед в дозе 2 мкг сиалиллактозы (углеводный фрагмент) на 1 мышь в 0,1 мл стерильного фосфатного буфера в мышечную ткань голени задней лапы; 2-я - 3-кратно (первые две с интервалом 2 нед, 3-ю спустя 2 мес). При 3-кратной иммунизации конъюгат в дозе 2 мкг сиалиллактозы вводили совместно с адъювантом сапонином.
Сыворотки получали на 7-е сутки после иммунизации, пулировали (каждая группа включала 6 животных) и хранили при -20°C.
Иммуноферментный тест против синтетических трисахаридных цепей GM. Уровень специфических сывороточных IgG- и IgM-антител определяли в прямом иммуноферментном анализе (ИФА) против синтетических трисахаридных цепей GM3 с помощью покрывающего антигена - конъюгата альфа-3-аминопропилгликозида трисахарида 3’-№ацетилнейраминиллактозы с полиакриламидом [13].
Тест проводили в 96-луночных планшетах Nunc Maxisorp с использованием 0,05% Tween-20 в 0,01 М ФБ (ФБ, содержащий 0,137 моль/л NaCl и 2,7 ммоль/л KCl; pH 7,3-7,5) для промывания планшетов и 1% раствора человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) в ФБ для блокировки, разведения сывороток и антител, конъюгированных с пероксидазой хрена («Jackson Immuno Research»).
Раствор покрывающего антигена в 0,1 М карбонатном буфере (10 мкг/мл) выдерживали в планшете (0,1 мл на 1 лунку) в течение ночи при 4°С. Далее в отмытом планшете инкубировали блокирующий буфер (0,12 мл на 1 лунку) 1 ч при 37°C. После удаления блокирующего буфера в лунки вносили по 0,1 мл разведенных сывороток и выдерживали ночь при 4°С. Планшеты отмывали, в лунки вносили изотипспецифические антитела (коза против мыши), конъюгированные с пе-роксидазой хрена, и инкубировали 1 ч при 37°C. Планшеты отмывали, в лунки вносили раствор o-фенилендиамина (0,4 мг/мл) в 0,1 М фосфат-цитратном буфере, содержащем 0,4 мкл/мл 30% H2O2. Реакцию останавливали через 25 мин раствором 2 н. серной кислоты и измеряли оптическую плотность при длине волны 492 нм.
Показатель оптической плотности для сыворотки интактных мышей (разведение 1:100 и выше) был менее 0,1.
Результаты исследования представлены в виде показателей оптической плотности графически как кривые титрования.
Иммуноферментный тест против KLH. Уровень специфических сывороточных IgG- и IgM-антител к KLH определяли в прямом ИФА.
Тест проводили в 96-луночных планшетах Nunc Maxi-sorp, активированных раствором KLH (10 мкг/мл) в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере. Использовали 0,05% Tween-20 в 0,01 М ФБ (ФБ, содержащий 0,137 моль/л NaCl и 2,7 ммоль/л KCl; pH 7,3-7,5) для промывания планшетов и 1% раствора ЧСА в ФБ для блокировки, разведения сыворо-
ток и антител, конъюгированных с пероксидазой хрена.
Раствор покрывающего антигена выдерживали в планшете (0,1 мл на 1 лунку) в течение ночи при 4°С. Далее в отмытом планшете инкубировали блокирующий буфер (0,12 мл на 1 лунку) 1 ч при 37°C. После удаления блокирующего буфера в лунки вносили по 0,1 мл разведенных сывороток и выдерживали ночь при 4°С. Планшеты отмывали, в лунки вносили изотипспецифические антитела (коза против мыши), конъюгированные с пероксидазой хрена («Jackson Immuno Research») и инкубировали 1 ч при 37°C. Планшеты отмывали, в лунки вносили раствор o-фенилендиамина (0,4 мг/мл) в 0,1 М фосфат-цитратном буфере, содержащем 0,4 мкл/мл 30% H2O2. Реакцию останавливали через 25 мин раствором 1 М серной кислоты и измеряли оптическую плотность при длине волны 492 нм.
Показатель оптической плотности для сыворотки интактных мышей (разведение 1:100 и выше) был менее 0,1.
Результаты исследования представлены в виде показателей оптической плотности графически как кривые титрования.
Трансплантация клеток меланомы. Высокометастази-рующую в легкие меланому В16 трансплантировали мышам в мышцы правой задней лапки. В опытах использовали 7-й пассаж опухоли in vivo. Трансплантацию взвеси опухолевой ткани выполняли по 105 клеток в 0,1 мл питательной среды RPMI-1640 («Sigma», США). Всем животным была привита меланома В16 в голень задней лапы (1 млн клеток на 1 мышь).
Культивирование клеток опухолевой линии К562. Клетки мышиной лимфомы К562 культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 5% фетальной сыворотки («Sigma», США) и 50 мкг/мл гентамицина («Sigma», США) при 37°С в атмосфере 4% CO2.
Цитотоксический тест. На 21-е сутки после трансплантации мышам меланомы животные были забиты. У животных с соблюдением условий стерильности изъяли селезенки. Селезенки гомогенизировали в среде RPMI-1640 и трижды осаждали центрифугированием. Для получения МЛ взвесь спленоцитов центрифугировали при 400 g в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-урографина («Sigma», США) плотностью 1,077 г/см3. МЛ, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и 3-кратно отмывали средой. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g. Для получения лимфоцитов взвесь МЛ в среде RPMI-1640 разливали во флаконы, инкубировали при 37°С в среду культивирования (106 клеток в 1 мл среды). Полученные клетки-эффекторы использовали для постановки цитотоксического теста.
Исследование противоопухолевой цитотоксической активности осуществляли с использованием МТТ-колори-метрического теста [116].
В качестве клеток-мишеней использовали клетки К562 (для исследования HK-активности) и В16 (для исследования специфической противоопухолевой активности) из коллекции опухолевых штаммов РОНЦ им. акад. Н. Н. Блохина РАМН. Подсчитывали количество живых эффекторных и опухолевых клеток в суспензиях методом исключения три-панового синего («Sigma», США). Для коинкубации клеток использовали 96-луночные планшеты («Nung», США, или «Costar», Франция), в лунки которых пассировали клетки. Концентрация К562 и В16 в среде соответствовала 500 000 кл/мл. Соотношение опухолевых клеток и клеток-эффекторов МЛ в среде соответствовало 1:2; 1:5 и 1:10.
Цитотоксичность выражена цитотоксическим индексом (ЦИ) в процентах.
Расчет ЦИ проводили по стандартной формуле:
ЦИ (в %) = (1 - (ОПэ + м-ОПэ)/ОПм) ■ 100, где ОПэ + м - значение оптической плотности в опытных сериях; ОПэ - значение оптической плотности в лунках с клетками-эффекторами; ОПм - значение оптической плотности в лунках с клетками-мишенями.
- 125 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012
Результаты и обсуждение. ДК, пульсиро-ванные конъюгатом синтетических углеводных фрагментов ганглиозида GM3 и KLH, после добавления индуктора созревания фактора некроза опухоли a (TNF) приобретали фенотип ДК с высоким уровнем экспрессии костимулирующих молекул (CD80, CD86, CD40) и маркера терминальной дифференцировки (CD83) (рис. 1). Как следует из приведенных гистограмм ДК, пуль-сированные конъюгатом, экспрессируют на мембране 94 ± 1,73% CD40, 86 ± 2,33% CD80, 81 ± 3,55% CD86 и 83 ± 3,21% CD83. Эти данные позволяют классифицировать рассматриваемую популяцию как зрелые ДК.
Рис. 1. Фенотип ДК, пульсированных конъюгатом синтетических углеводных фрагментов и KLH.
По оси абсцисс - интенсивность флюоресценции в области FITC-диапазона; по оси ординат - количество клеток, несущих анализируемый маркер. Неокрашенный пик - аутофлюоресценция неокрашенных клеток, окрашенный - флюоресценция клеток, окрашенных FITC; M1 - область определения ДК.
ДК —ДК, пульсированные —а— Конъюгат конъюгатом
Рис. 2. Кривые титрования сывороточных IgM-AT, специфичных к углеводному фрагменту конъюганта.
1 - 1:100; 2 - 1:200; 3 - 1:400; 4 - 1:800; 5 - 1:1600; 6 - 1:3200; 7 - 1:6400; 8 - 1:12 800.
Зрелые ДК, пульсированные конъюгатом, дважды с интервалом 2 нед вводили мышам линии C57B1/6 и спустя 7 сут после второй иммунизации определяли титры IgM- и IgG-AT к углеводному и белковому фрагментам. На рис. 2 представлены результаты титрования антисывороток против синтетического углеводного фрагмента, которые получены у экспериментальных животных, иммунизированных ДК, пуль-сированными конъюгатом, или самим конъюгатом. Контролем служили сыворотки животных, иммунизированных интактными ДК. Представленные результаты свидетельствуют о том, что введение экспериментальным животным ДК, пульсированных конъюгатом, приводит к индукции более выраженного иммунного ответа, чем введение самого конъюгата.
На 7-е сутки после 2-кратного введения ДК, пульси-рованных конъюгатом, в сыворотке иммунизированных животных также были обнаружены и IgG-AT, специфичные для углеводного фрагмента, но их титры были невысоки - 1:800-1:400. При этом следует отметить, что после введения самого конъюгата IgG-AT, специфичных для углеводного фрагмента, не обнаружили.
В сыворотках животных, которые иммунизированы ДК, пульсированными конъюгатом синтетических аналогов углеводных цепей ганглиозида GM3 и белка гемоцианина, присутствовали как IgM-, так IgG-AT, специфически взаимодействующие со вторым компонентом конъюгата, а именно с белком гемоцианином (рис. 3).
Таким образом, введение экспериментальным животным ДК, пульсированных конъюгатом синтетических углеводных цепей опухольассоциированного ганглиозида GM3 и белка гемоцианина, приводит к индукции синтеза АТ, специфичных как к углеводной, так и к белковой части конъюгата. При этом ДК, пульсированные конъюгатом, вызывают более сильный иммунный ответ на углеводный фрагмент, чем сам конъюгат.
ДК, пульсированные —ДК (контроль, IgM) конъюгатом (1дМ)
ДК, пульсированные —ДК (контроль, IgG) конъюгатом (IgG)
Рис. 3. Кривые титрования сывороточных IgM- и IgG-AT, специфичных для KLH.
1 - 1:100; 2 - 1:200; 3 - 1:400; 4 - 1:800; 5 - 1:1600; 6 - 1:3200.
- 126 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Цитотоксическая активность клеток селезенки мышей, иммунизированных пульсированными ДК или конъюгатом
Опухо- левые клетки- мишени Соотношение эффекторных и опухолевых клеток Индекс цитотоксической активности, %
мыши, иммунизированные конъюгатом мыши, иммунизированные ДК-вакциной контроль(не-иммунизированные мыши)
К562 10:1 64,8 ± 23,4 64 ± 12,4 65 ± 11,0
5:1 65,0 ± 8,6 77 ± 15,6 65 ± 10,2
2:1 45,0 ± 7,3 38 ± 7,6 45 ± 8,4
В16 F0 10:1 50,0 ± 26,2 77 ± 15,3* 31 ± 5,2
5:1 47,0 ± 24,0 98 ± 19,6* 24 ± 4,3
2:1 36,6 ± 18,5 86 ± 17,3* 10 ± 2,1
Примечание.* - p < 0,05 по сравнению с показателями в контроле.
—♦— IgM-AT после иммунизации пульсированными ДК —■— IgG-AT после иммунизации пульсированными ДК —л— 1дМ-АТ после иммунизации конъюгатом х IgG-AT после иммунизации конъюгатом
Рис. 4. Кривые титрования сывороточных IgM- и IgG мышей, иммунизированных пульсированными ДК или конъюгантом.
1 - 1:100; 2 - 1:200; 2 - 1:400; 4 - 1:800; 5 - 1:1600; 6- 1:3200; 7 - 1:6400; 8 - 1:12 800; 9 - 1:25 600; 10 - 1:51 200.
Известно, что ДК способны инициировать специфический противоопухолевый иммунный ответ, опосредованный цитотоксическими лимфоцитами. Для ответа на вопрос, обладают ли такими свойствами ДК, пульсированные синтетическим конъюгантом углеводных фрагментов и белка, мышам линии C57B1/6 дважды с интервалом 2 нед вводили после инкубации с конъюгатом зрелые ДК. Через 8 дней животным прививали клетки меланомы В16. На 21-е сутки после трансплантации меланомы животных забивали и определяли уровень цитотоксической активности мононуклеарных клеток селезенки. В качестве группы сравнения использовали мышей, которым 3-кратно (1-я и 2-я иммунизации с интервалом 2 нед, 3-я - спустя 2 мес) вводили конъюгат с адъювантом сапонином и в аналогичные сроки перевивали клетки меланомы В16, а также оценивали цитотоксическую активность клеток селезенки. Контролем к обеим группам животных служили клетки селезенки мышей, которым были привиты опухолевые клетки.
Как следует из данных, представленных в таблице, вакцинация мышей ДК, пульсирован-ных конъюгатом, не приводит к стимуляции НК-активности МЛ, однако в этих условиях отмечается достоверное повышение цитотоксической активности МЛ против опухолевых клеток меланомы В16. При этом иммунизация самим конъюгантом не приводит к индукции цитотоксической активности ни к клеткам К562, ни к клеткам меланомы В16. Следует отметить, что в экспериментах по оценке цитотоксической активности была использована схема введения конъюгата, позволяющая получать максимальный гуморальный иммунный ответ на его синтетический углеводный фрагмент. Для этого конъюгат вводят совместно с адъювантом сапонином («Sigma», США) и 1-ю и 2-ю иммунизации проводят с интервалом 2 нед, а 3-ю, бустерную, - спустя 2 мес [12].
При забое животных для постановки цитотоксического теста у них брали кровь, получали сыворотки и определяли титры IgM- и IgG-AT, специфичных к синтетическому аналогу углеводного фрагмента ган-глиозида GM3. Из представленных на рис. 4 результатов следует, что титры АТ, специфичных к синтетическому углеводному фрагменту, иммунизированных конъюгатом мышей, значительно превосходят титры аналогичных АТ в сыворотках животных, вакцинированных пульсированными ДК.
Резюмируя полученные данные, можно утверждать, что вакцинация мышей зрелыми ДК, нагруженными конъюгатом, приводит к формированию клона лимфоцитов, обладающих цитотоксической активностью по отношению к клеткам меланомы В16. При этом максимальный эффект (близкий к 100%) наблюдался даже при минимальном соотношении, равным 2:1. Эти результаты могут свидетельствовать о формировании специфического иммунного ответа против меланомы В16.
Таким образом, использование ДК в качестве адъюванта для индукции иммунных реакций на конъюгат синтетических аналогов углеводных фрагментов опухольассоциированного антигена - ганглиозида GM3 и белка гемоцианина - приводит к развитию как гуморального, так и клеточного иммунного ответа.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (госконтракт № 16.512.11.2089) и программы «Фундаментальные науки - медицине» Президиума РАН.
литература
1. Барышников А. Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма // Практ. онкол. - 2003. - № 3. - С. 127-130.
2. Гриневич Ю. А., Храновская Н. Н. Вакцины на основе анти-генпрезентирующих дендритных клеток в иммунотерапии больных со злокачественными опухолями // Онкология. -2007. - Т. 9, № 4. - С. 365-371.
3. Дятловицкая Э. В., Текиева Е. А., Леменовская А. Ф. и др. Ган-глиозиды GM и GD3 в опухолях желудка и молочной железы человека // Биохимия. - 1991. - Т. 56. - С. 560-564.
4. Дятловицкая Э. В., Кандыба А. Г. Сфинголипиды в метаста-зировании и ангиогенезе опухолей // Биохимия. - 2006. - Т. 71, вып. 4. - С. 437-444.
5. Кандыба А. А., Козлов А. М., Сомова О. Г., Дятловицкая Э.
- 127
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2012
В. Биологически активные сфинголипиды в перевиваемых опухолях различного гистогенеза // Биоорган. химия. - 2006.
- № 1. - С. 98-102.
6. Кандыба А. А., Козлов А. М., Сомова О. Г., Дятловицкая Э. В. Сравнительное исследование сфинголипидов в перевиваемых меланомах с высокой и низкой метастатической активностью // Биоорган. химия. - 2008. - № 2. - С. 252-255.
7. Коростелев С. А. Противоопухолевые вакцины // Соврем. онкол. - 2003. - № 4. - С. 15-19.
8. Моисеенко В. М. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи // Практ. онкол. - 2001. - № 4. - С. 58-64.
9. Москалева Е. Ю., Северин С. Е. Перспективы создания противоопухолевых вакцин с использованием дендритных клеток человека // Иммунология. - 2002. - Т. 23, № 4. - С. 8-15.
10. Пащенков М. В., Пинегин Б. В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: Дендритные клетки // Иммунология. - 2006. - № 6. - С. 368-377.
11. Степаненко Р. Н., Власенко Р. Я., Львов В. Л. и др. Конъюгат олигосахаридного фрагмента опухольассоциированного антигена ганглиозидной природы с гемоцианином - прототип противоопухолевой вакцины // Докл. РАН. - 2007. - Т. 415. - С. 425-429.
12. Степаненко Р. Н., Власенко Р. Я., Цветков Ю. Е. и др. Гуморальный иммунный ответ мышей на конъюгат синтетических углеводных фрагментов опухольассоциированного антигена ганглиозидной природы с белком гемоцианином - прототипа противоопухолевой вакцины // Иммунология. - 2010. - № 2.
- С. 86-92.
13. Хатунцева Е. А., Юдина О. Н., Цветков Ю. Е. и др. Синтез Р_3-аминопропилгликозида сиалил-3’-лактозы и неогликоконъюгатов на его основе - прототипа онковакцины и искусственных антигенов для контроля иммунного ответа // Изв. РАН. Сер. хим. - 2006. - № 11. - С. 2016-2023.
14. Шпакова А. П., Павлова К. С., Булычева Т. И. МТТ-колори-метрический метод определения цитотоксической активно-
сти естественных киллерных клеток // Клин. лаб. диагн. -2000. - № 2. - С. 20-23.
15. Berzofsky J. A., Terabe M., Oh S. K. et al. Progress on new vaccine strategies for the immunotherapy and prevention of cancer // J. Clin. Invest. - 2004. - Vol. 113. - P. 1515-1525.
16. Bitton R. J., GuthmannM. D., GabryM. R. et al. Cancer vaccine: An update with special focus on ganglioside antigens // Oncol. Rep. - 2002. - Vol. 9. - P 267-276.
17. Carr A., Mazorra Z., Alonso D. F. et al. A purified GM3 ganglioside conjugated vaccine induces specific, adjuvant-dependent and non-transient antitumour activity against B16 mouse melanoma in vitro and in vivo // Melanoma Res. - 2001. - Vol. 11.
- P 219-227.
18. Carr A., Rodrigues E., Arango M. C. et al. Immunotherapy of advanced breast cancer with a heterophilic ganglioside (NeuGcGM3) cancer vaccine // J. Clin. Oncol. - 2003. - Vol. 21, N 6. - P. 1015-1021.
19. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L. et al. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells // Annu. Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 20. - P. 621-667.
20. Hammerstrom A. E., Cauley D. H., Atkinson B. J., Sharma
P.Cancer immunotherapy: sipuleucel-T and beyond //
Pharmacotherapy. - 2011. - Vol. 31, N 8. - P. 813-828.
21. Joyce S., Van KaerL. CD1-restricted antigen presentation: an oily matter // Curr. Opin. Immunol. - 2003. - Vol. 15. - P. 95-104.
22. Moody D. B., Porcelli S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation // Nature Rev. Immunol. - 2003. - Vol. 3. - P. 11-22.
23. Novellino L., Castelli C., Parmiani G. A listing of human tumor antigens recognized by T cells // Cancer Immunol. Immunother.
- 2005. - Vol. 54, N 3. - P. 187-207.
24. Slingluff C. L. Jr., Speiser D. E. Progress and controversies in developing cancer vaccines // J. Translat. Med. - 2005. - Vol. 3. - P. 1-9.
Поступила 30.09.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.017.1.014.08
В. В. Муругин, М. В. Пащенков, Б. В. Пинегин
применение мультипараметрической проточной цитометрии для одновременной оценки функции и фенотипа nk-клеток
Лаборатория клинической иммунологии ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России (115478, г Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2)
NK-клетки (естественные киллеры) вносят весомый вклад в уничтожение вирусинфицированных и опухолевых клеток. Замечено, что лишь небольшая часть субпопуляции cD56dim NK-клеток дегранулирует при взаимодействии с клетками-мишенями, например с клетками К562. Используя цитометрический тест на дегрануляцию NK-клеток, мы показали, что cD56dim NK-клетки, не дегранулирующие при взаимодействии с К562, тем не менее отвечают на клетки-мишени, что выражается в падении поверхностной экспрессии активационных рецепторов cD16 и cD314. доля NK-клеток, дегранулирующих при инкубации с клетками К562, была выше в субпопуляциях cD94brighl, cD159a+ и cD335dim, чем соответственно в субпопуляциях cD94dim, cD159a- и cD335high. Наиболее высокий дегрануляционный ответ наблюдали в субпопуляции cD94highcD335dim. Эти данные показывают, что среди cD56dim NK-клеток присутствуют субпопуляции клеток с разной цитотоксической активностью; необходим дальнейший поиск поверхностных маркеров этих субпопуляций.
Ключевые слова: NK-клетки, дегрануляция, проточная цитометрия, CD107a, CD94, CD335
Пинегин Борис Владимирович - д-р мед. наук, проф., зав. лаб. клинической иммунологии, тел. (499)617-76-49, факс (499)617-10-27; e-mail:bvpinegin@yandex.ru
- 128 -
