CC BY
62
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (49)/2009
Антигенные и иммуногенные свойства множественных антигенных пептидов, включающих пептид слияния флавивирусов
О.В. Морозова1 (mov@niboch.nsc.ru), В.Н. Бахвалова2 (bvntbe@yandex.ru),
Л.Э. Матвеев1 (vam@niboch.nsc.ru), А.С. Шевцова3 (nastia-jenny@mail.ru),
Е.И. Исаева4 (immunol.lab@mail.ru), В.И. Злобин4, 5 (vizlobin@mail.ru),
Е.В. Протопопова6 (eprotopopova@ngs.ru), S. Seligman7 (stephen_seligman@nymc.edu)
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск
2 Институт систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск
3 Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, Московская область
4 Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва
5 Иркутский государственный медицинский университет Росздрава
6 ФГУН «ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, пос. Кольцово Новосибирской области
7 New York Medical College, Valhalla, NY, USA
Резюме
Пептиды, содержащие консервативный «пептид слияния» (98 - 113 аминокислотный остаток (а.о.)) белка оболочки вирионов Е флавивирусов, переносимых клещами, спей-серы и гетерологичные Т-клеточные эпитопы флавивирусов, были синтезированы и присоединены к трипептиду из остатков лизина как тетравалентные множественные антигенные пептиды (МАП). Оптимальная схема иммунизации мышей состояла во внутрибрюшинном введении четыре раза по 100 мкг каждого МАП с полным или неполным адъювантом Фрейнда с интервалами в один месяц. Иммуноферментный анализ сывороток крови через 10 дней после последней иммунизации и асцитных жидкостей иммунизированных мышей показал наличие антител к белку Е флавивирусов с титрами от 1:1000 до 1:500 000. При уменьшении количеств МАП до 50 мкг для иммунизации одного животного или сокращении промежутков времени между повторными иммунизациями до 10 дней титры антител снижались до 1:1000. Антитела, ингибирующие гемагглютинацию эритроцитов гуся, с титрами в диапазоне от 1:20 до 1:80 были обнаружены только после иммунизации одним из МАП - FA4T5, содержащим четыре линейных пептида DRGWGNHCGLFGKGSIFTSLGKAVHQVFVKK (98 - 113 а.о. белка Е ВКЭ, ГТ, 431 - 440 а.о. белка Е вируса Денге-4, VKK), присоединенных к аминогруппам остатков лизина матрикса. Вируснейтрализующие свойства поликлональных антител мышей после иммунизации МАП и моноклональных антител мышей, способных связываться с МАП, показаны методом титрования вируса клещевого энцефалита и флавивируса Повассан по бляшкам на культуре пермиссив-ных клеток почки эмбриона свиньи (титры от 1:32 до 1:64) и методом биологической нейтрализации на мышах-сосунках
Antigenic and Immunogenic Properties of Multiple Antigenic Peptides (MAP) Including Flavivirus Fusion Peptide
O.V. Morozova1 (mov@niboch.nsc.ru),
V.N. Bakhvalova2 (bvntbe@yandex.ru),
L.E. Matveev1 (vam@niboch.nsc.ru),
AS. Shevtsova3 (nastia-jenny@mail.ru),
E.I. Isaeva4 (immunol.lab@mail.ru), V.I. Zlobin45 (vizlobin@mail.ru), E.V. Protopopova6 (eprotopopova@ngs.ru),
S. Seligman7 (stephen_seligman@nymc.edu)
1 Istitute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk
2 Institute of Systematics and Ecology of Animals of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk
3 Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitis of the Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
4 Ivanovskyi Institute of Virology of the Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
5 Irkutsk State Medical University of Russian Ministry of Health
6 Federal State Research Institution «State Research Center of Virology and Biotechnology«Vector»of Rospotrebnadzor,
Koltsovo, Novosibirsk region, Russia
7 New York Medical College, Valhalla, NY, USA Abstraot
Peptides containing highly conserved «fusion peptide» (98 - 113 amino acids (aa)) of tick-borne flavivirus surface glycoprotein E, spacers and heterologous T-cell epitopes have been synthesized and attached to lysines as tetravalent multiple antigenic peptides. Optimal scheme of immunization of BALB/c mice included 4 intraperitoneal injections with 100 yg of each MAP with complete for first or incomplete Freund’s adjuvant for subsequent immunizations with intervals 1 month
для вируса клещевого энцефалита и вируса омской геморрагической лихорадки (титры 1:2 - 1:4).
Ключевые слова: тетравалентные множественные антигенные пептиды (МАП), вирус клещевого энцефалита, оптимизация схем иммунизации, иммуноферментный анализ (ИФА), реакция гемагглютинации (РГА), реакция биологической нейтрализации
between MAP administrations. ELISA of mouse sera in 10 days after the last immunization and ascitic fluids of immunized mice revealed antibodies against full-length glycoprotein E and MAPs with titers 1:1,000 - 1:500,000. Decreased amounts of MAPs to 50 yg per immunization of a mouse or shorter periods of time between subsequent injections (10 days) resulted in lower ELISA titers near 1:1,000. Hemagglutination inhibition (HI) (titers 1:20 - 1:80) and neutralizing antibodies were found after immunization with the MAP-FA4T5 including 4 linear peptides DRGWGNHCGLFGKGSIFTSLGKAVHQVFVKK (98 - 113 aa tick-borne flavivirus E protein, spacer FT, T-cell epitope 431 - 440 aa of Dengue 4 glycoprotein E, VKK) attached to lysine core only. Neutralization of flaviviruses with polyclonal antibodies of the mice after immunization with MAP FA4T5 and with monoclonal antibodies capable to bind with MAPs and linear «fusion peptide» was shown by means of plaque reduction neutralization test (PRNT) using porcine embryo kidney (PS) cells for the tick-borne encephalitis virus and Powas-san virus (titers 1:8 - 1:128) and by intracerebral infection of suckling mice with the tick-borne encephalitis virus or Omsk hemorrhagic fever virus (titers 1:2 - 1:4).
Key words: tetravalent multiple antigenic peptides (MAP), the tick-borne encephalitis virus, optimization of immunization schemes, ELISA, hemagglutination inhibition test, flavivirus neutralization, plaque reduction neutralization test (PRNT)
Введение
Множественные антигенные пептиды (multiple antigenic peptides), или мультипептидные антигены, - это синтетические макромолекулы, состоящие из матрикса на основе коротких пептидов из трифункциональных аминокислотных остатков (обычно от трех до семи аминокислотных остатков лизина), соединенных пептидными связями, и ковалентно присоединенных к аминогруппам остатков лизина линейных пептидных антигенов с образованием пространственных макромолекул с молекулярной массой до 10 кДа (рис. 1). Принцип создания конформационных синтетических вакцин на основе МАП и прямой синтез пептидно-антигенного матрикса твердофазным методом были предложены J.P. Tam в 1988 году [15]. Несомненными достоинствами МАП являются высокое молярное соот-
Рисунок 1.
Схема присоединения линейных пептидов FA4T4 и FA4T5 к аминогруппам остатков лизина в составе МАП
ношение и плотная упаковка множественных копий антигенных эпитопов, а также отсутствие эффекта экранирования эпитопов близрасположенными доменами высокомолекулярных белков. Обычно ли-зиновое ядро («core») составляет менее 10% молекулярной массы МАП. Несмотря на малые размеры и молекулярные массы, инъекции МАП оказываются достаточными для индукции сильного иммунного ответа без конъюгирования синтетических пептидов с белком-носителем. В последние годы МАП, содержащие В- и/или T-клеточные эпитопы одного или нескольких антигенов различных возбудителей инфекционных заболеваний, использовали как для индукции специфического иммунного ответа, так и для диагностических целей [3, 11]. При этом токсичные свойства, развитие аллергических реакций и другие неспецифические эффекты для МАП пока неизвестны.
Для РНК-содержащих флавивирусов характерны генетическая изменчивость и вариабельность вирусных белков, что затрудняет создание вакцин нового поколения. На территории России в природных популяциях среди флавивирусов, переносимых клещами, доминирует вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), но также обнаружены вирусы омской геморрагической лихорадки (ОГЛ), Западного Нила (ВЗН) и Повассан (ВП). Вирионы флавивирусов окружены мембраной, на поверхности которой располагаются 90 димеров гликопротеина Е. Рентгеноструктурный анализ гликопротеина Е выявил три домена: I, II и III, а также наличие cd-петли на вершине домена II, которая представляет собой наиболее консерва-
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (49)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (49)/2009
тивный фрагмент белка оболочки вирионов Е -«пептид слияния» (98 - 113 а.о.), ответственный за проникновение флавивирусов в клетки [14]. В зрелых вирионах часть пептида слияния одного из мономеров находится под доменами I и III соседнего мономера и таким образом экранирована от связывания с антителами к белку Е. После рецептор-опосредованного проникновения флави-вирусов в эндосомы клетки хозяина происходит высвобождение частично скрытого пептида слияния и мономеры белка Е образуют тримеры [14]. Частично поверхностная локализация и высокая консервативность пептида слияния обуславливают его перспективность для разработки новых вакцин против флавивирусов, переносимых клещами.
Для индукции сбалансированного гуморального и клеточного ответа в состав синтетических пептидных вакцин необходимо включать В- и Т-клеточные эпитопы. В-клеточные эпитопы белка оболочки вирионов флавивирусов хорошо известны [16]. Эпитопное картирование моноклональных антител (МКА) к белку Е ВКЭ показало, что за редким исключением вируснейтрализующие МКА имеют сайты связывания преимущественно в С-концевой части белка Е [8, 16]. Однако первые попытки иммунизации синтетическими пептидами показали, что линейный пептид, соответствующий консервативному пептиду слияния 98 - 113 а.о. белка Е ВКЭ и конъюгированный с гемоцианином улитки (KLH), способен индуцировать вируснейтрализую-щие антитела [1].
Иммунизация мышей синтетическими пептидами, соответствующими структурному белку prM флавивируса Денге-2 и конъюгированными с бычьим сывороточным альбумином (БСА), приводила к образованию антител, способных нейтрализовать все четыре типа флавивирусов Денге, переносимых комарами [17].
До настоящего времени не удалось выявить ни одного Т-клеточного эпитопа поверхностных белков вирионов, консервативного для всех флавивирусов. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей гликопротеина Е шести флавивирусов, переносимых комарами (ВЗН, вируса японского энцефалита и вирусов Денге всех четырех типов), позволил теоретически предсказать участки связывания Т-хелперов на основании совпадения амфифильных сегментов, пептида Rothbard-Taylor и преимущественно альфа-спиральной вторичной структуры этого фрагмента белка [10]. Единственный перекрестно реагирующий Т-клеточный эпитоп был предсказан в С-концевой части (приблизительно 420
- 455 а.о.) белка Е всех флавивирусов. В результате иммунизации мышей синтетическими пептидами, соответствующими С-концевой области флавивирусов, показана специфическая пролиферация Т-клеток [10]. Анализ Т-клеточных эпитопов для флавивирусов Денге-2 и вируса Долины Мюррея показал наибольшие эффективность пролиферации клеток in vitro и синтез цитокинов для синте-
тического консервативного пептида, соответствующего 352 - 368 а.о. вируса Денге-2 [12]. Индукция антител синтетическими пептидами, включающими В-клеточные эпитопы, стимулируется при добавлении Т-клеточных эпитопов в смесь для иммунизации. При этом наиболее эффективный иммунный ответ наблюдали в результате введения ковалентно связанных между собой В- и Т-клеточных эпитопов в составе линейных пептидов [12].
цель данной работы состояла в анализе иммунного ответа после введения мышам МАП, содержащих консервативный пептид слияния флавивирусов, переносимых клещами, и различные Т-клеточные эпитопы.
Материалы и методы
MA^ Пептиды FA4T5 DRGWGNHCGLFGKGSIFTSLGKAV HQVFVKK (98 - 113 а.о. белка Е ВКЭ, FT, 431
- 440 а.о. белка E вируса Денге-4 [10], VKK) и FA4T4 DRGWGNHCGLFGKGSIGITVNPIVTEKDSPVNIE KK (98 - 113 а.о. белка Е ВКЭ, G, 352 - 368 а.о. белка Е вируса Денге-2 [12]) были синтезированы в Keck Biotechnology Resource Center (New Haven, СТ, США) и присоединены к трипептиду, состоящему из остатков лизина, как тетравалентные МАП в соответствии со схемой, изображенной на рисунке 1. Биотинилированный линейный пептид BFA biotin-TYSDRGWHNGCGLFGKGSI был синтезирован там же. Пептиды растворяли в стерильной деионизованной воде до концентрации 50 мг/мл и хранили при -20 °С.
Иммунизация мышей. Мыши линии BALB/c (самки, возраст три недели) были иммунизированы внутрибрюшинно четыре раза с интервалом один месяц по 50 или 100 мкг пептида с полным для первой иммунизации и неполным для трех последующих введений адъювантом Фрейнда. Вторая схема иммунизации состояла в сокращении до 10 дней интервала между второй и третьей иммунизациями.
Иммуноферментный анализ (ИфА). Пятенный иммуноферментный анализ (ПИФА) с очищенным гликопротеином Е или рекомбинантным белком Е ВКЭ, любезно предоставленным П.А. Белавиным (ФГУН «ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, пос. Кольцово, Новосибирская область), и антителами кролика к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (ЗАО «БиоСан», г. Новосибирск), с последующим окрашиванием 4-хлор-1-нафтолом с 0,03% перекисью водорода проводили, как описано ранее [4].
Для ИФА по 200 нг МАП FA4T4 или FA4T5, а также линейного биотинилированного пептида BFA в 100 мкл фосфатного буфера рН 8,0 сорбировали на полистероловые планшеты в течение ночи при +4 °C. Места неспецифического связывания насыщали 0,5% раствором казеина в буфере для связывания 0,15М NaCl, 0,02М трис-HCl, рН 7,4, содержащем 0,1% Tween-20 (Serva, Германия), при 37 °С в течение часа. Затем инкубировали
с поли- или моноклональными антителами к белку Е флавивирусов [4, 8] в течение часа при 37 °С. Специфическое связывание анализируемых антител с иммобилизованными МАП выявляли при помощи антител кролика к иммуноглобулинам класса IgG мыши, конъюгированным с пероксидазой хрена, с окрашиванием иммунных комплексов раствором ортофенилендиамина. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1М HCl на лунку и измеряли оптическую плотность образцов на спектрофотометре Uniscan (Финляндия) при длине волны 450 нм. Положительными результатами считали показатели оптической плотности, в три раза превышающие уровни отрицательного контроля.
реакция торможения гемагглютинации (рТГА). РТГА проводили в соответствии с [9] с 0,4% суспензией нативных эритроцитов гуся и восемью агглютинирующими единицами антигена ВКЭ из тест-системы «Диагностикум клещевого энцефалита сухой для РТГА, РСК, РРГ» производства НПО «Микроген», г. Томск.
Вирусы. В работе использовали два штамма ВКЭ, относящихся к сибирскому генетическому типу: штамм 2421 (номер доступа в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) - GQ423572), выделенный от имаго Ixodes persulcatus Schulze в Новосибирской области в 2008 году [7], и штамм ЭК-328, выделенный от имаго I. persulcatus в Эстонии в 1972 году (DQ486861). Среди флавивирусов, переносимых клещами, применяли штамм П-24 ВП, выделенный из пула 50 самок I. persulcatus в 1975 году, собранных в Уссурийском районе Приморского края, и любезно предоставленный Г.П. Пивановой (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН), и штамм 186 (DQ473405) вируса ОГЛ, выделенный Н.Н. Харитоновой (Институт систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск) из головного мозга ондатры в Новосибирской области в 1964 году.
реакция нейтрализации флавивирусов методом бляшек. Реакцию нейтрализации ВКЭ, штамм ЭК-328, и ВП, штамм П-24, проводили методом бляшек под агаровым покрытием в культуре клеток СПЭВ в шестилуночных пластиковых планшетах производства Costar, как описано ранее [13]. Приблизительно 20 - 30 бляшкообразующих единиц (БОЕ) предварительно титрованных флавиви-русов инкубировали с поликлональными и моноклональными антителами мышей, специфичными к пептиду слияния, в различных разведениях от 1:8 до 1:128 в среде 199 с 5% сывороткой крови плодов коровы («ФУРО», Москва) при 37 °С в течение часа. К полным монослоям клеток СПЭВ добавляли суспензии вирусов с антителами в среде 199 на растворе Эрла и проводили адсорбцию в 200 мкл на одну лунку шестилуночного планшета в течение часа при 37 °С. Затем добавляли поддерживающую среду, содержащую 1% агар Difco, 5% сыворотку
новорожденных телят, 0,01% раствор нейтрального красного и смесь антибиотиков пенициллина и стрептомицина до концентраций 300 ЕД/мл и 0,2 г/мл соответственно. Изначально учет бляшек проводили через пять дней после инфекции, затем дополнительные бляшки подсчитывали в течение двух-трех суток, после чего клетки фиксировали раствором 5% трихлоруксусной кислоты в течение 20 минут при комнатной температуре и окрашивали 0,4% раствором генцианфиоле-тового красителя. За титр вируснейтрализующих антител принимали максимальное разведение сывороток или асцитных жидкостей мышей, нейтрализующее 50% бляшек.
реакция нейтрализации флавивирусов на мышах. Реакцию нейтрализации ВКЭ (штамм 2421) и ОГЛ (штамм 186) проводили, как описано ранее [2]. Вирусы предварительно титровали посредством внутримозгового заражения мышей линии ICR весом 7 - 9 г. Поликлональные и моноклональные антитела мышей, иммунизированных пептидами, в различных разведениях средой 199 (производства НПО «Вектор», Новосибирская область) инкубировали при 37 °С в течение часа с 5, 10 и 50 ЛД50 штаммов ВКЭ и ОГЛ. Вирусные суспензии разводили в среде 199 с 5% сывороткой КРС. После инкубации проводили внутримозговое заражение мышей ICR весом 7 - 9 г. Для исключения неспецифической гибели отдельной группе мышей вводили сыворотки интактных мышей, смешанные в соотношении 1:1 со средой, использованной для разведения вирусов (среда 199, содержащая 5% сыворотки КРС). Срок наблюдения составлял 21 день. За титр вируснейтрализующих антител принимали наибольшее разведение сывороток или асцитных жидкостей мышей, которое вызывало нейтрализацию флавивирусов у 50% мышей.
результаты и обсуждение
Анализ вариабельности белков флавивирусов показал, что одним из наиболее консервативных участков белков, расположенных на поверхности вирионов, является пептид слияния (fusion peptide). Так, среди депонированных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) аминокислотных последовательностей белка Е или его фрагментов обнаружен один штамм Семекс ВКЭ (номер доступа нуклеотидной последовательности - AF224665, аминокислотной последовательности - AAF63729), выделенный от клеща в Житомирской области (Украина) в 1988 году, с единственной аминокислотной заменой в пептиде слияния. Одно отличие в пептиде слияния обнаружено и у переносимого клещами вируса киасанурской лесной болезни (номер доступа нуклеотидной последовательности - X74111, аминокислотной последовательности - CAA52211). Исключение составляют переносимые клещами флавивирусы Повассан и вирус оленей, распространенные в Северной Америке, для которых характерен вариант пептида слияния
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (49)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (49)/2009
с аминокислотным остатком фенилаланина в позиции 107 белка Е [14].
С учетом данных о консервативной структуре пептида слияния флавивирусов, переносимых клещами, были синтезированы тетравалентные множественные антигенные пептиды, содержащие пептиды слияния и Т-клеточные эпитопы, окруженные короткими спейсерами и присоединенные к трипептиду из остатков лизина (см. рис. 1). Иммунизацию мышей линии BALB/c проводили внутрибрюшинно четыре раза по 50 - 100 мкг МАП. Спустя 7 - 10 дней после последней иммунизации в сыворотках крови иммунизированных мышей посредством ИФА обнаружены суммарные антитела к белку Е ВКЭ с титрами 1:10 000 -1:500 000 после иммунизации FA4T5 и 1:1000 -1:100 000 - после иммунизации FA4T4. При снижении дозы МАП до 50 мкг наблюдали уменьшение титров в ИФА до 1:1000. Сокращение промежутков времени между повторными иммунизациями до 10 дней также приводило к уменьшению титров антител до 1:1000. Полученные сыворотки и асцитные жидкости мышей содержали специфичные поликлональные антитела, способные связываться с полноразмерным гликопротеином Е и рекомбинантным укороченным белком Е, а также с МАП FA4T4, FA4T5 и линейным пептидом BFA, при этом титры антител в ПИФА и ИФА с иммобилизованными синтетическими пептидами оказались выше таковых для иммобилизованных полноразмерных белков.
Антитела, ингибирующие гемагглютинацию эритроцитов гуся, и вируснейтрализующие антитела были выявлены только после иммунизации МАП FA4T5, содержащим четыре линейных пептида DRGWGNHCGLFGKGSIFTSLGKAVHQVFVKK (98 -
113 а.о. белка Е ВКЭ, FT, 431 - 440 а.о. белка Е
вируса Денге-4, VKK), присоединенных к аминогруппам остатков лизина матрикса (табл. 1). Титры в РТГА для поликлональных антител после иммунизации мышей МАП FA4T5 варьировали в диапазоне от 1:20 до 1:80 у разных особей в зависимости от времени взятия проб крови. Поликлональные антитела из сывороток крови и асцитной жидкости мышей, иммунизированных МАП FA4T5, нейтрализовали 5 и 10 ЛД50 флавивирусов, переносимых клещами (ВКЭ и ОГЛ), при разведении 1:2 (см. табл. 1), но не 50 ЛД50 разных флавивирусов. Результаты нейтрализации флавивирусов ВКЭ и ВП поликлональными антителами из асцитной жидкости мыши, иммунизированной МАП FA4T5, приведены на рисунке 2.
Лунка 6 планшета соответствует контролю вируса Повассан (штамм П-24). Лунки 1 - 5 содержали последовательные двухкратные разведения поликлональных антител от 1:8 до 1:128.
Для оценки вируснейтрализующих и ингибирующих гемагглютинацию свойств были дополнительно проанализированы не только поликлональные антитела после иммунизации мышей МАП, но и моноклональные антитела (МКА), полученные ранее [4, 8] и способные связываться с МАП FA4T4 и FA4T5, а также с линейным синтетическим пептидом BFA, содержащим только пептид слияния флавивирусов, что показано посредством ПИФА и ИФА. Всего было исследовано шесть МКА - 1В1, 10С2, 10Н10, 7F10, Fvn31 и Fvn32. Вируснейтрализующие свойства были обнаружены для МКА 1В1 и 10Н10 (см. табл. 1, рис. 3).
Лунка 6 каждого планшета А и В соответствует контролю вирусов (А - вирус Повассан (штамм П-24); В - вирус клещевого энцефалита (штамм ЭК-328). Лунки 1 - 5 содержали последо-
Таблица 1.
Анализ поликлональных антител после иммунизации мышей МАП и моноклональных антител, связывающихся с пептидом слияния флавивирусов
Тип антител Титры антител по связыванию с белком Е в ИФА Титры антител по связыванию с МАП в ИФА 3 <г ас Титры в реакции нейтрализации по бляшкам на культуре клеток СПЭВ Титры в реакции биологической нейтрализации на мышах ICR
ВКЭ Повассан ВКЭ ОГЛ
Поликлональные антитела мышей после иммунизации МАП FA4T4 1:1000 - 1:100 000 1:1000 - 1:100 000 - - - - -
Поликлональные антитела мышей после иммунизации МАП FA4T5 1:10 000 - 1:500 000 1:10 000 - 1:500 000 1:20 -1:80 1:8 1:64 1:2 1:2
МКА 10Н10 1:50 000 1:100 000 1:640 - 1:64 - -
МКА 1В1 1:10 000 - 1:320 1:128 - 1:4 1:4
МКА 10С2 1:100 000 1:50 1:40 - - - -
Примечания:
Знак «-» соответствует отрицательным результатам реакции.
Результаты биологической нейтрализации приведены для 10 Ш50 ВКЭ и ОГЛ.
Рисунок 2.
Результаты нейтрализации вируса Повассан поликлональными антителами из асцитной жидкости мыши, иммунизированной МАП FA4T5
Рисунок 3.
Результаты нейтрализации флавивирусов моноклональными антителами 10Н10 (А) и 1В1 (В)
вательные двухкратные разведения поликлональных антител от 1:8 до 1:128.
Для специфической профилактики флавивирус-ных инфекций в настоящее время в мире используют преимущественно инактивированные вакцины, за исключением живых аттенуированных вакцин против вирусов желтой лихорадки и японского энцефалита. Для иммунизации населения на эндемичных территориях применяют шесть типов вакцин против ВКЭ, инактивированных формалином. При производстве инактивированных вакцин российские производители (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Московская область, и «Микроген» - НПО «Вирион», г. Томск) традиционно используют штаммы ВКЭ дальневосточного генетического типа (штаммы «Софьин» и 205 соответственно), а зарубежные фирмы Baxter (Австрия) и Novartis (Германия) - западно-европейские штаммы «Найдорф» и К23 соответственно. Экзогенная презентация вирусных антигенов в составе инактивированных вакцин приводит к индукции преимущественного гуморального иммунного ответа по Т-хелперному пути второго типа. Длительная схема трехразовой иммунизации и необходимость ревакцинации каждые три года обуславливают поиск новых способов профилактики не только клещевого энцефалита, но и других флавивирусных инфекций, экологически связанных с клещами.
Сравнение результатов генной иммунизации плазмидными ДНК с клонированными генами prM,
Е и NS1 ВКЭ показало защитный эффект только от гомологичного штамма вируса при отсутствии вируснейтрализующих антител [5]. В результате иммунизации рекомбинантными РНК протектив-ный эффект был обнаружен лишь после введения полноразмерных геномных РНК, но не фрагментов генома (генов Е и NS1). Мукозальная иммунизация рекомбинантными грамотрицательными бактериями, экспрессирующими на поверхности неструктурный гликопротеин NS1 ВКЭ, приводила к индукции антител с высокими титрами, которые не обеспечивали защиты от заражения даже гомологичными штаммами вируса [6]. Конструирование рекомбинантных и химерных флавивирусов не обеспечивает гомогенности геномных РНК квазивидов из-за ошибок репликазы в процессе быстрой репродукции вирусов и отсутствия систем репарации РНК в клетках хозяина, а также не исключает рекомбинации с эндогенными флави-вирусами и возможности селекции патогенных вариантов. Относительную безопасность могут обеспечить только рекомбинантные аттенуированные флавивирусы, полученные при совместной трансфекции культур клеток несколькими плазмидными ДНК с клонированными фрагментами генома. В настоящее время такие подходы к созданию вакцин уже используются.
Для защиты от заражения различными штаммами ВКЭ из природных популяций и другими флавивирусами, переносимыми клещами, необ-
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (49)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 6 (49)/2009
ходимо введение относительно консервативного фрагмента белка с преимущественно поверхностной локализацией. Этим критериям консервативности и поверхностной локализации удовлетворяет «пептид слияния» флавивирусов [14]. Изначально линейный синтетический пептид, соответствующий консервативным 98 - 113 а.о. белка Е ВКЭ, был конъюгирован с гемоцианином улитки ^Н, и в результате иммунизации крыс обнаружены вирус-нейтрализующие антитела [1]. В свободном виде линейные пептиды были неиммуногенны, а после ковалентного присоединения к ^Н индуцировали образование антител с высокими титрами [1]. Антитела, полученные в результате иммунизации крыс конъюгатом пептида слияния 98 - 113 а.о. белка Е ВКЭ с ^Н, были способны нейтрализовать ВКЭ (штамм «Софьин» дальневосточного генетического типа) с индексом 3,0, в то время как индекс нейтрализации гликопротеина Е составлял 4,4 [1].
В нашей работе пептид слияния флавивиру-сов, переносимых клещами, был включен в состав МАП, моделирующих пространственные структуры антигенов и конформационные эпитопы. Помимо В-клеточного эпитопа - пептида слияния в состав МАП были введены Т-клеточные эпитопы для возможности сбалансированного иммунного ответа. Оба МАП оказались иммуногенны в свободном виде, без конъюгирования с высокомолекулярными антигенами. Однако антигемагглютинины и вируснейтрализующие антитела были обнаружены только после иммунизации мышей МАП FA4T5. Поскольку 16 ^концевых аминокислотных остатков были одинаковы в МАП FA4T4 и FA4T5, а индук-
ция вируснейтрализующих и ингибирующих гемаг-глютинацию антител обнаружена только после иммунизации мышей FA4T5, то С-концевые аминокислотные остатки FA4T5 оказались более эффективными по сравнению с FA4T4 за счет Т-клеточного эпитопа или спейсеров. Включение в состав МАП FA4T5 Т-клеточного эпитопа SLGKAVHQVF приводило к индукции антител, нейтрализующих фла-вивирусы и ингибирующих гемагглютинацию. Оптимальной дозой были 100 мкг МАП для иммунизации одной мыши, в то время как ранее для иммунизации крыс использовали 200 мкг (в пересчете на пептид) конъюгата пептида слияния с ^Н [1], а для эффективной иммунизации мышей - 50 мкг линейных пептидов из белка ргМ в составе конъюгата с БСА [17].
Безопасность, низкая стоимость, химическая стабильность, возможность выбора консервативных фрагментов белков с поверхностной локализацией, высокая плотность расположения эпитопов, антигенность и иммуногенность МАП позволяют разрабатывать подходы к профилактике, медицинской диагностике и мониторингу природных популяций не только различных переносимых клещами РНК-содержащих флавивирусов, но бактерий и простейших. ■
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке междисциплинарного гранта № 83 Сибирского отделения Российской академии наук.
Литература
1. Волкова Т.Д., Вольпина О.М., Иванов В.Т. и др. Изучение антигенной структуры вируса клещевого энцефалита с использованием синтетических пептидов // Биоорганическая химия. 1998. Т. 24. № 2. С. 100 - 111.
2. Гайдамович С.Я. Арбовирусы (методы лабораторных и полевых исследований) / Под ред. С.Я. Гайдамович. - М.: Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР, 1986. - 181 с.
3. Круглов И.В., Симонова Т.В., Perez J.A., Haro I. Особенности взаимодействия антиген - антитело при использовании линейных синтетических пептидов и мультипептидного антигена, моделирующих антигенные детерминанты вируса гепатита А // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2009. № 2. C. 31 - 34.
4. Матвеев Л.Э., Караванов А.С., Рубин С.Г. и др. Сравнительная оценка двух иммуноферментных тест-систем для выявления антител к вирусу клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 1989. № 4. C. 488 - 491.
5. Морозова О.В. Свойства некоторых белков вируса клещевого энцефалита: Автореф. дис. ... д.б.н. - Новосибирск, 2001. - 24 с.
6. Морозова О.В., Максимова Т.Г., Попова Р.В. и др. Экспрессия гена NS1 вируса клещевого энцефалита в грамотрицательных бактериях - обитателях носоглотки мышей // Молекулярная биология. 2001. Т. 35. № 1. C. 157 - 162.
7. Морозова О.В., Бахвалова В.Н., Панов В.В. Сравнение методов детекции вируса клещевого энцефалита / Фундаментальные науки - медицине. - Новосибирск: Арта, 2008. C. 171 - 177.
8. Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Получение и изучение свойств антиидиотипических антител, не-
сущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. 1996. № 2. C. 50 - 53.
9. Clarke D.H., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemag-glutination-inhibition with arthropod-borne viruses // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1958. V. 7. P 561 - 573.
10. Kutubuddin M., Kolaskar A.S., Galande S. et al. // Mol. Immunol. 1991. V. 28. № 1 - 2. P. 149 - 154.
11. Nardin E.H., Oliveira G.A., Calvo-Calle J.M. et al. The use of MAPs in the analysis and induction of protective immune responses against infectious diseases // Adv. Immunol. 1995. V. 60. V. 105 - 149.
12. Roehrig J.T., Johnson A.J., Hunt A.R. et al. // J. Virol. 1992. V. 66. №
6. P. 3385 - 3390.
13. Romanova L.Iu., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation // Virology. 2007. V. 362. P. 75 - 84.
14. Seligman S.J. Constancy and diversity in the flavivirus fusion peptide // Virol. J. 2008. V. 5. P. 27 - 37.
15. Tam J.P. Synthetic peptide vaccine design: synthesis and properties of high-density MAP system // PNAS USA. 1988. V. 85. P. 5409 -5411.
16. Tsekhanovskaya N.A., Matveev L.E., Rubin S.G. et al. Epitope analysis of tick-borne encephalitis (TBE) complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype) // Virus Research. 1993. V. 30. P. 1 - 16.
17. Vazquez S., Guzman M.G., Guillen G. et al. Immune response to synthetic peptides of dengue prM protein // Vaccine. 2002. V. 20. № 13 - 14. P. 1823 - 1830.
