CC BY
42
Вакцина против вируса клещевого энцефалита на основе европейского прототипного штамма индуцирует у человека продукцию широкого спектра нейтрализующих антител с перекрестной реактивностью
К.К. Орлингер, И. Хофмейстер, Р. Фритц, Г.У. Холцер, Ф.Г. Фолкнер, Б. Унгер, А. Лоуи-Базелли, Е.-М. Поллабауэр, Х.Дж. Эрлих, П.Н. Барретт, Т.Р. Крейл (thomas_kreil@baxter.com)
Baxter Bioscience, Австрия
Резюме
Установлена перекрестная вируснейтрализующая активность антител в сыворотках крови здоровых добровольцев, вакцинированных против клещевого энцефалита, к вирусам клещевого энцефалита (ВКЭ) европейского, дальневосточного и сибирского подтипов и к вирусу омской геморрагической лихорадки (ВОГЛ). Получены гибридные вирусы, несущие характерные поверхностные белки вышеуказанных подтипов ВКЭ и ВОГЛ, с применением капсида вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) в качестве вектора. Показано, что полученные гибридные вирусы позволяют провести точную и прямую сравнительную оценку эффективности реакции нейтрализации, так как обладают антигенными свойствами тех штаммов ВКЭ, из которых были получены поверхностные белки, и проявляют эквивалентные биологические свойства в клеточной культуре. При исследовании образцов сыворотки крови участников испытаний австрийской вакцины против ВКЭ были установлены сопоставимые титры вируснейтрализующих антител против европейского, дальневосточного и сибирского подтипов ВКЭ, что свидетельствует о равной эффективности перекрестной защиты вакцинных антител против различных подтипов ВКЭ. При этом обнаружена также несколько сниженная, но сохраняющаяся нейтрализующая активность этих антител в отношении менее родственных вирусов, таких как ВОГЛ. Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита; европейский, дальневосточный и сибирский подтипы вируса клещевого энцефалита; вакцина
A Tick-born Encephalitis Virus Vaccine Based
on the European Prototype Strain Induces Broadly Reactive
Cross-neutralizing Antibodies in Humans
K.K. Orlinger, Y. Hofmeister, R. Fritz, G.W. Holzer, F.G. Falkner,
B. Unger, A. Loew-Baselli, E.-M. Poellabauer, H.J. Ehrlich,
P.N. Barrett, Th.R. Kreil (thomas_kreil@baxter.com)
Baxter BioScience, Austria
Abstract
After vaccination of humans with tick-borne encephalitis virus (TBEV) vaccine, the extent of cross-neutralization between viruses of the European, Far Eastern, and Siberian subtypes of TBEV and Omsk hemorrhagic fever virus (OHFV) was analyzed. Hybrid viruses that encode the TBEV surface proteins for representative viruses within all subtypes, and OHFV, were constructed using the West Nile virus (WNV) backbone as vector. These viruses allow for unbiased head-to-head comparison in neutralization assays because they exhibit the antigenic characteristics of the TBEV strains from which the surface proteins were derived and showed equivalent biologic properties in cell culture. Human serum samples derived from a TBEV vaccine trial were analyzed and revealed comparable neutralizing antibody titers against European, Far Eastern, and Siberian subtype viruses, indicating equally potent cross-protection against these TBEV strains and a somewhat reduced but still protective neutralization capacity against more distantly related viruses, such as OHFV. Key words: tick-borne encephalitis virus; European, Far Eastern, and Siberian subtypes of tick-borne encephalitis virus; vaccine
Введение
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является патогенным для человека членом семейства Flaviviridae. ВКЭ распространен на обширной площади Евразийского континента, от Западной Европы до Японии [1 - 3]. Вакцинация против клещевого энцефалита (КЭ) приобретает все большее значение, так как в течение последних 30 лет география этого вируса непрерывно расширяется, ежегодно в странах Европы и Азии регистрируют несколько тысяч случаев заболевания кле-
щевым энцефалитом. На основании географического распространения и антигенно-генетических свойств группа вирусов клещевого энцефалита рода Flavivirus подразделена на европейский, дальневосточный и сибирский подтипы ВКЭ, которые имеют перекрывающиеся ареалы, например в странах Балтии [6]. Более того, обнаружение видов клещей, которые служат переносчиками дальневосточного и сибирского подтипов ВКЭ, в регионах, ранее считавшихся неэндемичными, например в Финляндии, указывает на расширение аре-
ала этих подтипов [5, 7, 8]. Род Flavivirus включает также несколько других патогенных для человека вирусов, в частности омской геморрагической лихорадки (ВОГЛ), Повассан, болезни Кьясанурско-го леса и Алкхурма.
Две вакцины против КЭ, основанные на европейском подтипе, зарегистрированы и широко используются в Европе. Свойства антител, образующихся после их введения, были подробно изучены в экспериментах на животных и в клинических испытаниях. Эти исследования показали, что образующиеся после вакцинации антитела обладают определенной перекрестной вируснейтрализую-щей активностью по отношению к отдельным подтипам ВКЭ [9 - 12], однако эти эксперименты не позволили однозначно определить, насколько эквивалентна нейтрализующая способность в отношении подтипов, различающихся по антигенному составу. Например, после иммунизации с использованием вакцины на основе штамма K23 европейского подтипа ВКЭ были обнаружены значимые количественные различия в образовании нейтрализующих антител к вирусам гомологичных и гетерологичных подтипов [11, 12], тогда как в исследованиях с использованием вакцины на основе штамма Neudoerfl, близкого к штамму K23, выявились лишь незначительные различия [10] и даже эквивалентные титры нейтрализующих антител с перекрестной реактивностью [9]. В связи с тем что нейтрализующие антитела, образующиеся после вакцинации, формируют основу для защиты от инфекции, подобные расхождения обусловливают необходимость повторной оценки перекрестной реактивности нейтрализующих антител по отношению к разным подтипам ВКЭ.
В настоящее время нами разработана модель для исследования антител, позволяющая анализировать нейтрализацию вирусов в условиях, когда сбалансированы их репликативная и инфекционная активность и одновременно сохранены индивидуальные особенности поверхностных антигенов различных штаммов ВКЭ, которые и определяют возможность их нейтрализации. Были сконструированы гибридные вирусы, содержащие кон-сенсусную последовательность капсида вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) и кодирующие поверхностные белки prM и E различных штаммов ВКЭ. Такие гибриды ВЛЗН/ВКЭ использовались для оценки нейтрализующей активности образцов сывороток, полученных в ходе клинического испытания вакцины на основе штамма Neudoerfl. Соответствующие последовательности поверхностных белков для создания этих гибридов были выделены из прототипных штаммов разных подтипов ВКЭ и более отдаленной последовательности prME из ВОГЛ.
Цель данного исследования - количественная оценка уровня нейтрализующих антител против прототипных штаммов ВКЭ всех подтипов и близкородственного ВОГЛ у людей, привитых против КЭ.
Материалы и методы
Вирусы и клеточные линии
1. Прототипный штамм Neudoerfl европейского подтипа В^, применяемый для производства вакцины ФСМЕ-Иммун (FSME-Immun, Baxter), и штамм NY99-фламинго 3B2-99 ВЛЗН «дикого» типа, полученный из Центра по контролю и профилактике заболеваний CHIA (CDC), выращивание в соответствии с правилами надлежащей производственной практики.
2. ^е^нные линии A549 Американская коллекция клеточных культур [ATCC] CCL-1B5), C6/36 (Европейская коллекция клеточных культур [ECACC] B9051105) и Vero (ATCC CCL-B1) получали из ATCC и ECACC и культивировали, как описано ранее [13].
Процедуры клонирования и конструирование гибридных вирусов
Последовательности структурных белков prM и E штаммов Neudoerfl (GenBank TEU21495) и K23 (GenBank AM600965) европейского подтипа ВЮ, штаммов Sofjin-HO (GenBank AB062064) и Oshima 5-10 (GenBank AB062063) дальневосточного подтипа В^, штамма Vasilchenko (GenBank AF069066) сибирского подтипа В^ и ВОГЛ (GenBank NC_005062.1), фланкированные кодирующими областями ВЛЗН NY99 (GenBank AF196B35), соответствующими нуклеотидам 269 - 411 на б'-конце и нуклеотидам 2410 - 2563 на 3'-конце, получали путем химического синтеза (GE-NEART), а затем клонировали в систему комплементарной ДНK (кДН^ ВЛЗН [13].
Для построения индивидуальных гибридных кДНK MunI- и BshTI-рестриктированные фрагменты синтезированных кодирующих кассет prM и E ВЮ лигировали с MunI- и BshTI-рестриктированной основой плазмиды pWNVsyn-5'TL [13].
Для лигирования использовали ДН^лигазу Т4 (New England Biolabs).
Плазмиды размножали в бактериальном штамме HB101 (Promega) и очищали с применением наборов Qiagen. Для электропорации использовали установку Escherichia coli Pulser (BTX Harvard Apparatus; настройки: 1,B кВ, 25 мкФ, 150 Q), для секвенирования применяли прибор Genetic Analyzer 3130x1 (ABI) и набор для циклического секвенирования BigDye Terminator (версия 3.1; ABI).
Для получения полноразмерной кДНK матриц гибридных вирусов плазмиду pWNVsyn-3'TL [13] линеаризовали путем последовательного переваривания рестриктазой XbaI и нуклеазой золотистой фасоли.
Индивидуальные 5'-фланкирующие частичные плазмиды, кодирующие поверхностные белки ВЮ, и переваренную рестриктазой XbaI основу плазмиды pWNVsyn-3'TL обрабатывали рестриктазой SphI и лигировали ДН^лигазой T4 (New England Biolabs). Продукты лигирования дважды экстра-
гировали фенол-хлороформом, осаждали этанолом и ресуспендировали в безнуклеазной воде (Ambion).
Методы транскрипции РНК in vitro, трансфекции клеток Vero и иммуноблоттинга были описаны ранее [13].
Титрование вирусов и кривые роста
Клетки Vero, A549 и C6/36, выращенные во флаконах площадью 175 см2, инфицировали ВЛЗН дикого типа, штаммом ВКЭ Neudoerfl или гибридами ВКЭ с множественностью заражения (МЗ) 0,0001. После инкубации в течение одного часа вирусный инокулят удаляли, клетки промывали 10 мл среды DMEM и добавляли 75 мл свежей среды. Через 1, 6, 24, 48, 54, 72 и 96 часов после заражения из культуры отбирали по 1 мл среды. Титр вируса определяли с помощью методики оценки медианы инфекционной дозы для культуры ткани (TCID50), как описано ранее [13].
Синтез кДНК и количественная полимеразная цепная реакция
Вирусные РНК выделяли путем экстракции в реагенте TRIzol, осаждали этанолом и ресуспендировали в безнуклеазной воде. Для синтеза кДНК брали 1 мкл РНК; использовали набор Superscript III (Invitrogen) и праймеры, связывающиеся с З'-участ-ком неструктурного белка генома ВЛЗН. Для проведения количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) РНК гибридных ВКЭ экстрагировали через 24, 48, 54 и 72 часа после заражения с помощью набора QIAamp (Qiagen) в соответствии с инструкцией изготовителя. Для синтеза кДНК использовали набор iScript cDNA Synthesis Kit (BioRad). КПЦР проводили с праймерами qPCR-WNV-FWD (3 '-CAGAG CTTGACATTGACTCCAT- 5') и qPCR-WNV-RWD (5'-CAGAAATCACGAAAGCAGCAAA-3') и зондом qPCR-WNV (6FAM-CATTC-CAATGACTATCGCG); они связывались с одинаковой для всех гибридов последовательностью капсида ВЛЗН. КПЦР проводили в общем объеме 20 мкл, содержащем полиме-разный реагент TaqMan Gene Expression MasterMix (ABI), набор из двух праймеров, меченый зонд и кДНК, с использованием системы для ПЦР в реальном времени StepOnePlus (ABI). Для построения калибровочной кривой с целью определения геномных эквивалентов транскрибированную in vitro РНК генома репликона ВЛЗН (диапазон разведений от 1 х 102 до 1 х 109 копий РНК) обрабатывали так же, как образец.
Микрометод оценки реакции нейтрализации
В качестве контрольных препаратов использовали партии нормального иммуноглобулина для внутривенного введения (НИГ), произведенные по одной и той же технологии из донорской плазмы, собранной в США или Европе (KIOVIG или Gammagard liquid, Baxter). Препараты НИГ и образцы сывороток, полученных в клиническом испыта-
нии, предварительно разводили средой DMEM в соотношении 1:10 или 1:20 и затем последовательно разводили той же средой с шагом «два». ВЛЗН, штамм Neudoerfl ВКЭ или гибриды ВКЭ в дозе 2 х 103 TCID^/мл добавляли к каждой пробе и инкубировали в течение 60 ± 10 минут при комнатной температуре. Затем пробы переносили в 96-лу-ночные культуральные планшеты с однослойными культурами клеток A549. Цитопатический эффект (ЦПЭ) оценивали после инкубации культур в течение шести - восьми дней при температуре 37 °С в газовой смеси с 5%-ным СО2, а затем рассчитывали титр нейтрализации, как описано ранее [14].
Клиническое исследование
В исходном исследовании (ClinicalTrials. gov. № NCT00161954) участвовали 60 здоровых взрослых добровольцев (возраст 16 - 65 лет). Всем участникам дважды ввели вакцину против КЭ ФСМЕ-Иммун в соответствии со схемой ускоренной иммунизации [15]. Примерно через 12 месяцев после второй дозы 44 участника получили третью дозу вакцины в рамках дальнейшего исследования (ClinicalTrials. gov. № NCT00163540; последующее исследование № NCT00161954). Для оценки реакции нейтрализации использовали образцы сывороток крови 41 участника, полученные на 21-й день после третьей вакцинации. Троих участников, которые перед третьей вакцинацией были серопозитивными на антитела к ВКЭ, исключили из исследования. Реакцию нейтрализации оценивали, как описано выше.
Статистический анализ
Статистический анализ проводили с помощью пакета программ GraphPad Prism, версия 5.0. Результаты оценки реакции нейтрализации в отношении гибридных вирусов анализировали с применением одностороннего дисперсионного анализа, и достоверно значимую разность определяли с помощью критерия Тьюки.
Результаты и обсуждение
Конструирование гибридных вирусов «прототип ВКЭ/ВЛЗН»
Для конструирования гибридных вирусов использовали недавно полученный двухкомпонент-ный инфекционный клон штамма NY99 ВЛЗН [13] и прототипные штаммы ВКЭ европейского подтипа (Neudoerfl и K23), дальневосточного подтипа (Sofjin-HO и Oshima 5-10), сибирского подтипа (штамм Vasilchenko), а также отдаленно родственный штамм ВОГЛ (табл. 1). В гибридах последовательности prM и E ВЛЗН были заменены на соответствующие последовательности ВКЭ, которые были встроены в капсид ВЛЗН, начиная с участка расщепления NS2B3 белков капсида и заканчивая участком NS1 сигналазного отщепления сигнальной последовательности (рис. 1). Таким образом были сохранены полная последователь-
Таблица 1. Созданные гибриды
Конструкция Гибрид Подтип ВКЭ Инвентарный номер GenBank9 Полученный титр, log10 ТСЮ^/мл Гомологич-ность белка E, n/N (%)»
ВКЭ-№1/ВЛЗН Neudoerfl Европейский TEU27495 9,29 496/496 (100)
ВКЭ-К23/ВЛЗН К23 Европейский AM600965 8,64 492/496(99)
КВЭ-Sofjin НО/ВЛЗН Sofjin НО Дальневосточный AB062064 8,26 475/496 (96)
ВКЭ-Oshima 5-10/ВЛЗН Oshima 5-10 Дальневосточный AB062063 8,38 475/496 (96)
B^-Vasilchenko^3H Vasilchenko Сибирский AF069066 7,11 477/496 (96)
ВКЭ-Omsk HF/ВЛЗН Omsk HF Н/п NC_005062.1 7,23 462/496(93)
Примечание: н/п - неприменимо; ТСЮ0 - медиана инфекционной дозы культуры ткани. а Инвентарные номера ОепБапк соответствующих штаммов ВКЭ «дикого» типа.
б Идентичность аминокислотной последовательности белка Е по сравнению с аминокислотной последовательностью белка Е штамма Ыеис1оегА ВКЭ, п (идентичные) / N (всего).
Рисунок 1.
Конструирование гибридных вирусов
А
5' NCR
BshTI SphHI
C prM NS1 - NS5
3' NCR
SSHCKKRGGKT ...NVHADTGCA ВЛЗН NY99
SATD... ...GVGA ВКЭ^С/ВЛЗН
SATD... ...GVGA ВКЭ-К23/ВЛЗН
SAVV... ...GVGA ВКЭ-Sofjin НО/ВЛЗН
SAVV... ...GVGA ВКЭ-Oshima 5-10/ВЛЗН
STTT... ...GVGA Bra-Vasilchenko^3H
STTT... ...GVGA ВКЭ-Omsk HF/ВЛЗН
Примечание: А. Схематическое изображение генома вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) N¥99 (масштаб не соблюден). Темно-серыми прямоугольниками обозначены части структурных вирусных белков, светло-серыми прямоугольниками -части неструктурных белков; черные линии на 5'- и З'-концах обозначают некодирующие области (НКО). Уникальный сайт рестрикции ЭрЫ указывает на место соединения последовательности ВЛЗН, встроенной в 5'- и З'-фланкирующие плазмиды соответственно. Показано положение сайтов рестрикции Мип1 и БэЫТ!, использующихся для замены кодирующей области поверхностных белков ргМ и Е.
Б. Последовательности ВЛЗН между сайтами рестрикции Мип1 и БэЫТ! были заменены на фрагменты гена, кодирующего отдельные области ргМЕ вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), окруженные последовательностями ВЛЗН; указаны точные места соединения между последовательностями ВЛЗН и ВКЭ.
ность prM и E ВКЭ и соответствующие сигнальные последовательности, что обеспечило возможность эффективной сборки вирусных частиц, которая зависит от согласованности процессов расщепления связи между C- и ргМ-кодирующими областями вирусной протеазой и сигналазой хозяина [16 - 18]. После трансфекции клеток Vero in vitro РНК-транскриптами, считанными с индивидуальных матриц кДНК, уже на пятый день после заражения обнаруживались высокие титры вирусных штаммов (см. табл. 1). Структуру генома гибридов подтверждали секвенированием гетерологичных последовательностей prME и фланкирующих областей. Для подтверждения ожидаемого фенотипа выявляли гетерологичный белок E ВКЭ на частицах гибридного вируса. С этой целью гибрид ВКЭ-Nd/ ВЛЗН, штамм Neudoerfl ВКЭ и ВЛЗН NY99 анализи-
ровали иммуноблоттингом с использованием поли-клональных антител против ВКЭ Ие^оегА и ВЛЗН ИУ99 (рис. 2). Как у ВЛЗН, так и у ВКЭ белки Е появлялись в виде одиночной полосы в диапазоне 50 - 60 кДа. Перекрестной реактивности антител в этом анализе не было обнаружено. Белки Е гибридных вирусов обнаруживались только при обработке сыворотками, содержащими антитела против ВКЭ, что указывало на наличие белка Е ВКЭ в собранном вирусном материале.
Кинетика роста гибрида Ие^оегА в различных клеточных линиях
Для сравнения репликативной способности гибридных вирусов и соответствующих штаммов «дикого» типа анализировали индивидуальную кинетику роста. Прототипным штаммом в этом анализе
Mun I
B
Mun I
Рисунок 2.
Фенотипический анализ прототипа гибридного штамма Neudoerfl ВКЭ
Анти-ВКЭ Анти-ВЛЗН
Примечание: ВКЭ-Nd/ВЛЗН сравнивали со штаммами «дикого» типа ВЛЗН NY99 и Neudoerfl ВКЭ с помощью иммуноблоттинга. Использовали поликлональные мышиные сыворотки, содержащие антитела против ВЛЗН NY99 или штамма Neudoerfl ВКЭ соответственно.
послужил гибрид ВКЭ-И0/ВЛЗН, несущий оба родительских вируса. Клетки млекопитающих (Vero, A549) и комаров (C6/36) инфицировали с МЗ 0,0001, после чего определяли вирусные титры в сроки, указанные на рисунке 3. Для титрования надосадочной жидкости были выбраны клетки Vero (платформа титрования ВЛЗН) и A549 (платформа титрования ВКЭ). Анализ кинетики роста штамма Neudoerfl ВКЭ с помощью платформы титрования A549 показал умеренную репликацию в клетках Vero, достаточный рост в клетках A549 и отсутствие роста в клетках C6/36 (см. рис. 3, правую колонку). В связи с тем что штамм Neudoerfl ВКЭ не вызывал ЦПЭ в клетках Vero, титры штамма Neudoerfl ВКЭ не могли быть определены с использованием клеток Vero в качестве детектора (см. рис. 3, левую колонку). ВЛЗН NY99 активно размножался во всех клеточных линиях, с более высокими абсолютными титрами в клетках Vero в сравнении с клетками A549. В отличие от обоих вирусов «дикого» типа, при титровании гибридных штаммов ВКЭ-Nd/ВЛЗН были обнаружены сходные титры независимо от платформы титрования. Скорость роста этого гибрида в сравнении с ВЛЗН NY99 в клетках млекопитающих была медленнее на ранних сроках (1 - 56 часов), но максимальные титры были сходными. Интересно, что в клетках C6/36 рост гибридных штаммов ВКЭ^/ВЛЗН замедлялся, что указывает на вероятное нарушение функции поверхностных белков ВКЭ в отношении захвата вирусов клетками комаров. Напротив, в клетках Vero гибридный штамм реплицировался гораздо активней, чем штамм «дикого» типа Neudoerfl ВКЭ, что указывает на полное сохранение функций поверхностных белков ВКЭ и ограниченную способность к репликации неструктурных белков в данной клеточной системе. Можно заключить, что клеточная линия A549 представляет собой наиболее подходящую си-
стему для анализа роста и титрования гибридных вирусов in vitro, так как кинетика репликации и титры гибридных штаммов ВКЭ-Nd/ВЛЗН (с замененными поверхностными белками) существенно не отличались от соответствующих показателей для штаммов «дикого» типа Neudoerfl ВКЭ и ВЛЗН NY99.
Серологические свойства прототипа гибридного штамма Neudoerfl
Для сравнения серологических свойств про-тотипного гибридного штамма ВКЭ^/ВЛЗН и штаммов Neudoerfl ВКЭ и ВЛЗН NY99 анализировали нейтрализацию этих вирусов в присутствии препаратов НИГ, полученных из плазмы крови в США или в странах Европейского союза (ЕС). Как было показано ранее [19, 20], препараты НИГ из США содержат высокие титры ВЛЗН-нейтрализующих антител. Напротив, препараты НИГ из ЕС содержат высокие титры ВКЭ-нейтрализующих антител, что обусловлено вакцинацией населения против ВКЭ и контактами с вирусом в эндемичных районах [21].
Для этого анализа использовали по три препарата НИГ из ЕС и США с высоким, средним и низким титрами нейтрализующих антител против ВКЭ или ВЛЗН (НИГ из ЕС или США соответственно). Тестирование трех препаратов НИГ из США на клетках A549 показало, что нейтрализации подвергается только вирус ВЛЗН, тогда как нейтрализующая активность в отношении любого штамма Neudoerfl ВКЭ или ВКЭ^/ВЛЗН отсутствует (рис. 4). Из этого следует, что неструктурные и нуклеокапсидные белки ВЛЗН, кодируемые гибридным штаммом Neudoerfl, не являются мишенями в реакции нейтрализации штамма Neudoerfl ВКЭ «дикого» типа и его гибрида ВКЭ-Nd/ВЛЗН. Напротив, при анализе трех препаратов НИГ из ЕС уровень нейтрализации ВЛЗН оказался очень низким (что может быть объяснено
Рисунок 3.
Кинетика репликации прототипного гибридного штамма Neudoerfl
Примечание: Сравнивали размножение штаммов: гибридного ВКЭ-NC/ВЛЗН, ВЛЗН N¥99 и NeuCoeгfl ВКЭ в клетках Уего, А549 и С6/36. Все типы клеток инфицировали с МЗ 0,0001. Титры вирусов в пробах культуральной среды, взятых, на разных сроках после заражения, определяли с помощью методики оценки медианы инфекционной дозы для культуры ткани (ТСЮ0 в культурах, клеток Уего (левая колонка) или клеток А549 (правая колонка). Пунктирные линии обозначают пределы чувствительности методики. Результаты представлены в виде средних значений, полученных в двух независимых экспериментах, и стандартных отклонений (планки погрешностей).
Рисунок 4.
Серологический анализ прототипа гибридного штамма Neudoerfl
НИГ из США
НИГ из ЕС
х
CL
О
64-1
о 32-
< |
о
£ 16-
8-
_ 4096
— 2048
— 1024
— 512
— 256
— 128 64
— 32 16
X
CL
Ü
О
m ü
O i
ш ^
со <B
S о.
т
х о
ВЛЗН
ВКЭ
ВКЭ-Ш/ВЛЗН ВЛЗН
ВКЭ
ВКЭ-Ш/ВЛЗН
Примечание: В микрометоде оценки реакции нейтрализации (ММОРН) прототипного гибридного штамма ВКЭ-NC/ВЛЗН и двух исходных вирусов, ВЛЗН N¥99 и штамма ШиСоегА, использовали три препарата НИГ из США с высоким, средним и низким титрами ВЛЗН-нейтрализующих антител (светло-серые прямоугольники) и три препарата НИГ из ЕС (темно-серые прямоугольники). На левой и правой осях ординат отложены титры нейтрализующих антител для НИГ из США и ЕС соответственно. Результаты представлены в виде средних значений, полученных в двух независимых экспериментах, и стандартных отклонений (планки погрешностей).
4
2
повышением распространенности ВЛЗН в Европе [22, 23]), тогда как титры нейтрализации штамма Ие^оегА ВКЭ и ВКЭ-Nd/ВЛЗН были одинаково высокими. Эти результаты подтверждают серологическую эквивалентность штамма «дикого» типа Иеи^оегА ВКЭ и гибридного штамма ВКЭ^/ВЛЗН.
Характеристики роста гибридов, представляющих все подтипы ВКЭ и ВОГЛ
Сохраняя последовательности, кодирующие белки вирусного каркаса, и заменяя только поверхностные белки, мы стремились добиться сходной репликационной и инфекционной активности разных гибридных вирусов в культурах клеток, что является необходимым условием для стандартизованных тестов на нейтрализующие антитела. Чтобы доказать это сходство, мы сравнили характеристики роста всех гибридов в детекторной клеточной линии А549. Кривые роста (рис. 5, А) оказались одинаковыми для всех гибридов, за исключением ВКЭ-УавИоИепко/ВЛЗН (титры этого гибрида были значительно снижены на всех сроках после заражения).
Чтобы оценить соотношение между инфекци-онностью гибридных вирусов и количеством ге-номсодержащих вирусных частиц, выходящих из инфицированных клеток, через 24, 48, 54 и 72 часа после заражения с постоянной МЗ в пробах культуральной жидкости измеряли содержание вирусной РНК методом КПЦР и титры вирусов (ТОЮ50) и рассчитывали соотношение частиц и ин-фекционности. Это соотношение оказалось одинаковым у всех гибридных вирусов (см. рис. 5, Б).
Анализ образцов сыворотки, полученных в клинических испытаниях, с использованием гибридов ВКЭ
Для анализа уровней антител с перекрестной нейтрализующей активностью у людей, вакцинированных против КЭ, мы провели реакцию нейтрализации в 41 образце сывороток, полученных в нерандомизированном открытом исследовании безопасности и эффективности вакцины против КЭ ФСМЕ-Иммун, созданной на базе штамма Ие^оегИ ВКЭ. При нейтрализационном анализе с использованием разных гибридных вирусов во всех исследованных образцах сыворотки обнаружились высокие титры нейтрализующих антител ко всем подтипам вирусов (рис. 6). Серо-позитивность в отношении штаммов Ие^оегИ, К23, БоЦт НО, ОвМта 5-10 и УавИоИепко составляла 100%, а в отношении гибридного штамма ВОГЛ - 98%. Статистический анализ результатов нейтрализационного анализа не выявил достоверных различий между гибридами ВКЭ/ВЛЗН, тогда как для гибридного ВОГЛ средние титры были достоверно ниже, что в значительной степени согласуется с его филогенетической отдаленностью от штамма Ие^оегИ ВКЭ.
В ходе клинического исследования были проведены сравнительные исследования титров нейтрализации в отношении гибридного штамма Ие^оегП и определение титров с помощью иммунофермент-ного анализа. В этих исследованиях обнаружилась достоверная корреляция между двумя видами анализа (коэффициент корреляции Пирсона г = 0,785, Р < 0,0001). Эти данные подтверждают, что вак-
Рисунок 5.
Кинетика роста и инфекционность гибридных ВКЭ
ВКЭ-Sofjin НО/ВЛЗН д - ВКЭ-Ш/ВЛЗН
ВКЭ-Oshima 5-10/ВЛЗН .
ВКЭ-Omsk HF/ВЛЗН
ВКЭ-К23/ВЛЗН
B^-Vasilchenko^3H
Р
5-,
10987610 5 43210
0 12 24 36 48 60 72 84 96 Время после заражения, часы
IIIIII
О
\Д \А \А \А \А \А
J^
/ / ^ У? £ ^ Jt
# J> f «
.¿г
Примечание: A. Кинетику роста гибридных вирусов ВКЭ-Ш/ВЛЗН, ВКЭ-К23/ВЛЗН, ВКЭ-Бо^/п НО/ВЛЗН, ВКЭ-ОвЫта 5-10/ВЛЗН, ВКЭ-УавНоЫепко/ВЛЗН и ВКЭ-Отвк НР/ВЛЗН анализировали в культурах клеток А549, инфицированных с МЗ 0,0001. В пробах куль-туральной жидкости, взятых в указанные сроки после заражения, определяли титры вирусов с помощью методики оценки медианы инфекционной дозы для культуры ткани (ТС1Ю50) для клеток А549.
Б. Для оценки соотношения между количеством частиц гибридных вирусов и их инфекционностью в пробах культуральной жидкости измеряли содержание вирусных РНК (детектируемых, при КПЦР) и ТСЮ50. Клетки А549 инфицировали гибридными вирусами с МЗ 0,0001. Отношение «вирусная РНК/ТСЮ50» в пробах культуральной жидкости измеряли через 24, 48, 56 и 72 часа после заражения. Результаты представлены в виде средних значений, полученных в двух независимых экспериментах, и стандартных отклонений (планки погрешностей).
Б
цина на основе европейского прототипного штамма Neudoerfl ВКЭ вызывает продукцию нейтрализующих антител против штаммов европейского, дальневосточного и сибирского подтипов ВКЭ с одинаковыми титрами. Кроме того, появляются высокие титры нейтрализующих антител против менее родственного изолята группы клещевых инфекций млекопитающих - ВОГЛ.
За последние 30 лет заболеваемость КЭ в Европе увеличилась на 400% [5], и к настоящему времени описаны случаи КЭ в таких регионах, как южная часть Норвегии, где эта инфекция ранее не регистрировалась [24]. Кроме того, обнаружение в Финляндии клещей вида Ixodes persulcatus, которые служат переносчиками дальневосточных и сибирских штаммов ВКЭ, предполагает дальнейшее расширение ареала распространения этого вида клещей [5, 7, 8]. Несмотря на то что популя-ционные испытания вакцин против КЭ на основе штаммов европейского подтипа показали высокую степень защиты (примерно 99% в случае эндемичных штаммов ВКЭ) [25], необходимо дополнительно подтверждать защитные свойства имеющихся вакцин в отношении штаммов ВКЭ, находящихся в более отдаленном родстве. При том, что в отношении флавивирусов существует множество доказательств того, что вируснейтрализующие антитела, образующиеся в ответ на введенную вакцину, обеспечивают защиту от вызываемых ими заболеваний [26 - 32], демонстрируя надежную перекрестную защиту.
В более ранних исследованиях перекрестную нейтрализующую реактивность антител против
разных подтипов ВКЭ в образцах сыворотки крови людей, вакцинированных против КЭ, анализировали с использованием изолятов вируса, относящихся к разным подтипам [9 - 12]. Было установлено, что образцы сыворотки содержат антитела, способные нейтрализовать эти изоляты, что указывает на способность вакцины на основе европейского штамма ВКЭ обеспечивать защиту и от дальневосточного и сибирского подтипов ВКЭ. Однако при оценке перекрестной реактивности антител после вакцинации результаты сильно расходились. Эти расхождения объясняли прежде всего достоверными различиями в репликационной способности изолятов вируса, отобранных для анализов [12], а также относили на счет методологических различий или чувствительности тестов, использовавшихся для анализов [9]. Понимание этих технических сложностей имеет решающее значение, так как сохранение антител и, следовательно, защиты от ВКЭ спустя несколько лет после вакцинации напрямую связано с количеством нейтрализующих антител, образовавшихся в результате вакцинации. Поэтому была необходимость в разработке тест-системы, позволяющей проводить объективный прямой сравнительный анализ нейтрализующих антител с перекрестной реактивностью против разных подтипов ВКЭ у человека. С помощью гибридных вирусов, имеющих каркас ВЛЗН и кодирующих отдельные белки ргМЕ ВКЭ, мы минимизировали ошибки, вызванные различиями в репликационной и инфекционной активности разных вирусов, так как инфек-ционность для всех созданных гибридных виру-
Рисунок 6.
Титры нейтрализующих антител с перекрестной реактивностью в образцах сыворотки крови вакцинированных людей
Нд
х со J со со ср ю о
m
ф
со о.
4096- 1 1
20481024* ° 512£ g 256-о. ^ 128-g § 643 Ф 3216- • • • —— • • • • • •• •••
•• • • • •!i¡! ••••• •• • • • • • • • • • • •
8
4
2
Гибриды: Neudoerfl K23 Sofjin-HO Oshima 5-10 Vasilchenko Omsk HF
Среднее: 360 338 319 409 224 133
СОС: 58,7 50,5 37,8 54,1 31,0 15,3
N: 41 41 41 41 41 41
Примечание: образцы сыворотки, взятые у 41 добровольца, вакцинированного против ВКЭ, исследованы с применением микрометода оценки реакции нейтрализации с использованием всех гибридных вирусов. Показаны индивидуальные титры и средние титры (горизонтальные линии) нейтрализующих антител со стандартной ошибкой среднего (СОС, планки погрешностей). Для оценки достоверности различий с гибридным штаммом ЫеиСоегЛ (ВКЭ-ЫС/ВЛЗН) применили односторонний дисперсионный анализ и критерий Тьюки. Нд - недостоверно; * Р < 0,05.
*
сов в использованной клеточной линии была одинаковой. В то же время такая стратегия позволила сохранить антигенные характеристики отдельных изолятов «дикого» типа ВКЭ, о чем свидетельствуют результаты исследования свойств гибридного ВКЭ-И0/ВЛЗН. Возможность использования такого подхода была продемонстрирована и другими исследователями при создании гибридных вакцин [33 - 35] или суррогатных вирусов для серологических исследований [36 - 38].
Следует отметить, что встраивание поверхностных белков штамма Neudoerfl ВКЭ в структуру ВЛЗН привело к эффективному росту гибридов в клетках Vero, тогда как рост «дикого» штамма Neudoerfl ВКЭ в этой во всех отношениях хорошо изученной клеточной системе для производства вакцин был значимо ниже [39 - 41].
Таким образом, вероятной причиной снижения скорости роста штамма Neudoerfl в клетках Vero является не неэффективное прикрепление вирусной частицы к клеткам-хозяевам или нарушение слияния с ними, а скорее субоптимальное взаимодействие неструктурных компонентов вируса и факторов хозяина. Кроме того, мы обнаружили слабую репликацию прототипного гибридного штамма ВКЭ^/ВЛЗН в клетках комаров C6/36, что указывает на нарушение функции поверхностных белков ВКЭ в этой клеточной системе. Аналогичные феномены наблюдались и в другой работе при анализе роста химер ВКЭ-DEN4 в клетках комаров: эффективность внедрения вируса в клетки и репликация вирусной РНК были снижены по сравнению с соответствующими показателями для «дикого» типа вируса DEN4 [35].
Несмотря на то что инфекционный титр гибридного штамма ВКЭ-Vasilchenko/ВЛЗН в клетках A549 был ниже по сравнению с инфекционными титрами всех других гибридов, соотношение вирусных частиц и инфекционности этого штамма было полностью сопоставимо с таковым для других штаммов. Поскольку от этого соотношения за-
висит «поведение» вирусов в реакциях нейтрализации, все гибриды одинаково хорошо подходят для сравнения нейтрализующих антител против ВКЭ.
Выводы
1. Вакцина против ВКЭ ФСМЕ-Иммун (FSME-Immun) на основе штамма Neudoerfl европейского подтипа ВКЭ вызывает продукцию одинаковых количеств нейтрализующих антител с перекрестной реактивностью против штаммов европейского, дальневосточного и сибирского подтипов ВКЭ. Это было подтверждено при использовании гибридных вирусов, кодирующих соответствующие поверхностные белки.
2. Титры нейтрализующих антител против гибрида ВОГЛ оказались более низкими, что соответствует более разнообразным поверхностным белкам этого штамма. Поэтому предполает-ся, что вакцина против ВКЭ ФСМЕ-Иммун будет обеспечивать полную защиту не только от европейского подтипа ВКЭ, но и от дальневосточного и сибирского, а также, но в меньшей степени, от менее родственного ВОГЛ. ■
Финансирование
Исследование проводилось при финансовой поддержке компании Baxter BioScience.
Благодарности
Мы благодарим Катрин Янеки (Kathrin Janecki), Мари-Луизу Зипс (Marie-Louise Zips) и Еву Махер-хаммер (Eva Macherhammer), а также их команду за ценную техническую помощь.
Данная статья опубликована при финансовой поддержке компании Baxter. Мнение автора может не совпадать с мнением компании. Baxter не несет ответственности за любые возможные нарушения авторских прав и иных прав третьими лицами в результате опубликования и распространения данной информации.
Литература
1. Lindquist L., Vapalahti O. Tick-borne encephalitis // Lancet. 2008. V. 371. P. 1861 - 1871.
2. Suss J. Epidemiology and ecology of TBE relevant to the production of effective vaccines // Vaccine. 2003. V. 21 (Suppl. 1). P. 19 - 35.
3. Barrett P.N., Plotkin S.A., Ehrlich H.J. Tick-borne encephalitis virus vaccines / In: Plotkin S.A., Orenstein W.A., Offit P.A., eds. Vaccines, 5th ed. - Philadelphia, PA: Saunders Elsevier, 2008. P. 841 - 856.
4. Mansfield K.L., Johnson N., Phipps L.P. et al. Tick-borne encephalitis virus: a review of an emerging zoonosis // J. Gen. Virol. 2009. V. 90. P. 1781 - 1794.
5. Suss J. Tick-borne encephalitis in Europe and beyond: the epidemiological situation as of 2007 // Euro. Surveill. 2008. V. 13 (26). Pi i = 18916.
6. Gubler D.J., Kuno G., Markoff L. Flaviviruses / In: Knipe D.M., Howley P.M. (eds.). Fields Virology, 5th ed. - Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2007. P. 1153 - 1252.
7. Jaaskelainen A.E., Sironen T., Murueva G.B. et al. Tick-borne encephalitis virus in ticks in Finland, Russian Karelia, and Buryatia // J. Gen. Virol. 2010. V. 91. P. 2706 - 2712.
8. Jaaskelainen A.E., Tikkakoski T., Uzcategui N.Y. et al. Siberian subtype tickborne encephalitis virus, Finland // Emerg. Infect. Dis. 2006. V. 12. P. 1568 - 1571.
9. Chiba N., Osada M., Komoro K. et al. Protection against tick-borne encephalitis virus isolated in Japan by active and passive immunization // Vaccine. 1999. V. 17. P. 1532 - 1539.
10.Hayasaka D., Goto A., Yoshli K. et al. Evaluation of European tickborne encephalitis virus vaccine against recent Siberian and Far-Eastern subtype strains // Vaccine. 2001 V. 19. P. 4774 - 4779.
11.Klockmann U., Krivanec K., Stephenson J.R., Hilfenhaus J. Protection against European isolates of tick-borne encephalitis virus after vaccination with a new tick-borne encephalitis vaccine // Vaccine. 1991. V. 9. P. 210 - 212.
12.Leonova G.N., Ternovoi V.A., Pavlenko E.V. et al. Evaluation of vaccine Encepur Adult for induction of human neutralizing antibodies against recent Far-Eastern subtype strains of tick-borne encephalitis virus // Vaccine. 2007. V. 25. P. 895 - 901.
13.Orlinger K.K., Holzer G.W., Schwaiger J. et al. An inactivated West Nile Virus vaccine derived from a chemically synthesized cDNA system // Vaccine. 2010. V. 28. P. 3318 - 3324.
14.Ehrlich H.J., Muller M., Oh H.M. et al. A clinical trial of a whole-virus H5N1 vaccine derived from cell culture // N. Engl. J. Med. 2008. V. 358. P. 2573 - 2584.
15.Loew-Baselli A. Immunogenicity and safety of FSME-Immun 0.5 ml using a rapid immunization schedule // Int. J. Med. Microbiol. 2006. V. 296. P. 213, 214.
16.Lee E., Stocks C.E., Amberg S.M. et al. Mutagenesis of the signal sequence of yellow fever virus prM protein: enhancement of sig-nalase cleavage in vitro is lethal for virus production // J. Virol. 2000. V. 74. P. 24 - 32.
17.Lobigs M., Lee E. Inefficient signalase cleavage promotes efficient nucleocapsld incorporation into budding flavivirus membranes // J. Virol. 2004. V. 78. P. 178 - 186.
18. Stocks C.E., Lobigs M. Signal peptidase cleavage at the flavivirus C-prM junction: dependence on the viral NS2B-3 protease for efficient processing requires determinants in C, the signal peptide, and prM // J. Virol. 1998. V. 72. P. 2141 - 2149.
19. Planitzer C.R., Modrof J., Kreil T.R. West Nile virus neutralization by US plasma-derived immunoglobulin products // J. Infect. Dis. 2007. V. 196. P 435 -440.
20. Planitzer C.B., Modrof J., Yu M.Y., Kreil T.R. West Nile virus infection in plasma of blood and plasma donors, United States // Emerg. Infect. Dis. 2009. V. 15. P. 1668 - 1670.
21. Seidel M.G., Grohmann E., Sadeghi K. et al. Vaccination against tickborne encephalitis virus tests specific IgG production ability in patients under immunoglobulin substitution therapy // Vaccine. 2010. V. 28. P. 6621 - 6626.
22. Calistri P, Giovannini A., Hubalek Z. et al. Epidemiology of West Nile in Europe and in the Mediterranean basin // Open Virol. J. 2010. V. 4. P. 29 - 37.
23. Rabel P.O., Planitzer C.B., Farcet M.R. et al. Increasing West Nile Virus antibody titres in central European plasma donors from 2006 to 2010 // Euro. Surveil. 2011. V. 16 (10):Pii = 19812.
24. Csango P.A., Blakstad E., Kirtz G.C. et al. Tick-borne encephalitis in southern Norway // Emerg. Infect. Dis. 2004. V. 10. P. 533, 534.
25. Heinz F.X., Holzmann H., Essl A., Kundi M. Field effectiveness of vaccination against tick-borne encephalitis // Vaccine. 2007. V. 25. P. 7559 - 7567.
26. Ben-Nathan D., Lustig S., Tam G. et al. Prophylactic and therapeutic efficacy of human intravenous immunoglobulin in treating West Nile virus infection in mice // J. Infect. Dis. 2003. V. 188. P. 5 - 12.
27. Diamond M.S., Shrestha B., Marri A. et al. B cells and antibody play critical roles in the immediate defense of disseminated infection by West Nile encephalitis virus // J. Virol. 2003. V. 77. P. 2578 - 2586.
28. Engle M.J., Diamond M.S. Antibody prophylaxis and therapy against West Nile virus infection in wild-type and immunodeficient mice // J. Virol. 2003. V. 77. P. 12941 - 12949.
29. Kreil T.R., Burger I., Bachmann M. et al. Antibodies protect mice against challenge with tick-borne encephalitis virus (TBEV)-infected macrophages // Clin. Exp. Immunol. 1997. V. 110. P. 358 - 361.
30. Kreil T.R., Elbl M.M. Pre- and postexposure protection by passive immunoglobulin but no enhancement of infection with a flavivirus in a mouse model // J. Virol. 1997. V. 71. P. 2921 - 2927.
31. Kreil T.R., Maier E., Fraiss S., Eibl M.M. Neutralizing antibodies protect against lethal flavivirus challenge but allow for the development of active humoral immunity to a nonstructural virus protein // J. Virol. 1998. V. 72. P 3076 - 3081.
32. Tesh R.B., Arroyo J., Travassos da Rosa A.P et al. Efficacy of killed virus vaccine, live attenuated chimeric virus vaccine, and passive immunization for prevention of West Nile virus encephalitis in hamster model // Emerg. Infect. Dis. 2002. V. 8. P. 1392 - 1397.
33. Chambers T.J., Nestorowicz A., Mason P.W., Rice C.M. Yellow fever / Japanese encephalitis chimeric viruses: construction and biological properties // J. Virol. 1999. V. 73. P. 3095 - 3101.
34. Lai C.I., Monath T.P. Chimeric flaviviruses: novel vaccines against dengue fever, tick-borne encephalitis, and Japanese encephalitis // Adv. Virus Res. 2003. V. 61. P 469 - 509.
35. Pletnev A.G., Bray M., Huggins J., Lai C.J. Construction and characterization of chimeric tick-borne encephalitis/dengue type 4 viruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 10532 - 10536.
36. Johnson B.W., Kosoy O., Hunsperger E. et al. Evaluation of chimeric Japanese encephalitis and dengue viruses for use in diagnostic plaque reduction neutralization tests // Clin. Vaccine Immunol. 2009. V. 16. P 1052 - 1059.
37. Komar N., Langevin S., Monath T.P. Use of a surrogate chimeric virus to detect West Nile virus-neutralizing antibodies in avian and equine sera // Clin. Vaccine Immunol. 2009. V. 16. P. 134, 135.
38. Pugachev K.V., Guirakhoo F., Mitchell F. et al. Construction of yellow fever / St. Louis encephalitis chimeric virus and the use of chimeras as a diagnostic tool // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2004. V. 71. P 639 - 645.
39. Barrett PN., Mundt W., Kistner O., Howard M.K. Vero cell platform in vaccine production: moving towards cell culture-based viral vaccines. Expert Rev. // Vaccines. 2009. V. 8. P. 607 - 618.
40. Kistner O., Barrett PN., Mundt W. et al. Development of a mammalian cell (Vero) derived candidate influenza virus vaccine // Vaccine. 1998. V. 16. P. 960 - 968.
41. Montagnon B.J., Fanget B., Nicolas A.J. The large-scale cultivation of Vero cells in micro-carrier culture for virus vaccine production. Preliminary results for killed poliovirus vaccine // Dev. Biol. Stand. 1981. V. 47. P. 55 - 64.
информация воз
Цель Европейского региона ВОЗ - полное освобождение от малярии через четыре года: партнерство «Обратим малярию вспять» стремится к уничтожению последних очагов заболевания
(Копенгаген, 21 октября 2011 г.)
Элиминация малярии к концу 2015 года по меньшей мере еще в 8 - 10 странах мира и соответственно - во всем Европейском регионе ВОЗ является одной из задач партнерства «Обратим малярию вспять». В новом докладе ВОЗ «Eliminating malaria: learning from the past, looking ahead» («Элиминация малярии: уроки прошлого и взгляд в будущее») четко указано на то, что 53 страны, входящие в Европейский регион ВОЗ, очень близки к достижению этой цели.
Перспектива освобождения Региона от этой болезни становилась все более реальной по мере того, как ВОЗ объявила Туркменистан, а затем на прошлой неделе и Армению странами, свободными от малярии.
Страна может обратиться к ВОЗ с запросом о сертификации элиминации малярии, если ее система эпидемического надзора не зарегистрировала ни одного случая заболевания по меньшей мере в течение трех лет подряд. Кроме того, с 2010 года случаи местной передачи малярии, вызванной Plasmodium vivax, были зарегистрированы только в пяти европейских странах: Азербайджане, Кыргызстане, Таджикистане, Турции и Узбекистане. В Грузии последний случай местной передачи малярии был зарегистрирован в 2009 году. За последние годы была поставлена под контроль временно возобновившаяся передача малярии в Казахстане и Российской Федерации.
«Мы уничтожаем последние очаги малярии, - заявила Zsuzsanna Jakab, директор Европейского регионального бюро ВОЗ. - С имеющимся у нас мощным человеческим потенциа-
лом, программами, основанными на научных данных, и благодаря тесному партнерству и постоянным инвестициям мы очень близки к достижению амбициозных целей, установленных на 2015 год партнерством «Обратим малярию вспять», включая элиминацию этой болезни в Европейском регионе ВОЗ».
Программа ликвидации малярии начала проводиться ВОЗ в 1955 году. Благодаря этой кампании удалось достичь элиминации малярии в некоторых странах, но ее конечная цель выполнена не была. В итоге менее чем через два десятилетия после начала программы от цели ликвидации малярии пришлось отказаться в пользу менее амбициозной программы по контролю этого заболевания.
Беспрецедентное увеличение финансирования привело к значительному расширению масштаба применения новых инструментов борьбы с малярией.
В Европейском регионе ВОЗ результатом усилий, направленных на борьбу с малярией, стало подписание Ташкентской декларации, в которой все страны, где актуальна проблема малярии, входящие в Европейский регион и соседние с ним регионы ВОЗ, взяли на себя обязательства по элиминации этого заболевания в течение десятилетия.
В новом докладе также представлена наиболее точная информация о бремени малярии, работе партнерства «Обратим малярию вспять» и прогрессе, достигнутом во всех регионах ВОЗ.
http://www.euro.who.int/
