CC BY
57
частности метод последовательного вычитания масс-спектров от небольших масс. Примеры применения этого метода при анализе сложных смесей, возникающих при загрязнении воздуха продуктами жизнедеятельности человека, отработавшими газами автомобилей, продуктами горения природного газа или в производстве тетрациклина, приведены ранее (Ю. В. Новиков и соавт.). Э. С. Лахно и соавт. применили масс-спектрометрию для определения химического состава летучих выделений растительности. Вместе с тем проведенные ранее исследования показывают, что применение автоматики и вычислительной техники для эффективного масс-спектромет-рического анализа воздушной среды, включая и хромато-масс-спектромет-рию, обеспечивают экспрессность, точность и надежность получаемых результатов.
ЛИТЕРАТУРА. Бейнон Дж. Масс-спектрометрия и ее применение в органической химии. М., 1964. — Д м и т р и е в М. Т., Кнтросский Н. А. — «Гиг. и сан.». 1966, № 7, с. 54. — Дмитриев М. Т., Пшежецкий С. Я.—В кн.: Действие ионизирующих излучений на неорганические и органические системы. М., 1958, с. 145. —Д и и т р и е в M. Т., Р а с т я н н и к о в Е. Г., Губернский Ю. Д.— В кн.: Гигиена жилых и лечебно-профилактических зданий. М., 1976, с. 60.—Дмитриев М. Т., Шевколович Ю. В. Применение масс-спектрометоического анализа к определению загрязнения воздуха и воды, М., 1967.—Л а х н о Э. С., К. о з л о в а Н. В., Выхрестюк Т. А. — «Гиг. и сан.», 1976, № 7, с. 72. — H о в и к о в Ю. В., Дмитриев М. Т., Хрусталева В. А. — Там же, 1973, № 6, с. 70. — П о -лякова А. А., Хмельницкий Р. А. Масс-спектрометрия в органической химии. Л., 1972.— Cornu A., Massot R. Compilation of Mass Spectral Data. New York, 1975.
Поступала 4/1 1977 p.
УДК 015.9.076.7
Канд. биол. наук Е. М. Юровская
ДЕГИДРОГЕНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ КАК ТЕСТ ДЛЯ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Киевский научно-исследовательский институт общей и коммунальной гигиены
им. А. Н. Марзеева
С точки зрения гигиены представляет интерес выяснение характера воздействия химического загрязнения на ту часть микробиального ценоза, которая является показателем ее санитарного состояния. Для этой цели широко используют метод, известный под названием «проба на развитие» (М. М. Калабина). Недостатками его являются длительность проведения наблюдений (10 сут) и способность многих веществ за указанный срок значительно изменять первоначальную концентрацию вследствие гидролитического распада или микробной деструкции. В последние годы уделяется внимание исследованию активности ферментов бактериальных клеток как теста для определения токсического действия химических веществ(В. М. Зотов; Ц. И. Роговская).
Задачей нашей работы было изучение дегидрогеназной активности эшерихий для оценки токсичности для них хлорофоса-пестицида, широко используемого в сельском хозяйстве и быту. В основу определения дегид-. рогеназной активности тест-бактерий положена методика, предложенная Кип и АЬоос! (А. Ф. Мороз). Это потребовало дополнительных исследований для отработки параметров опыта применительно к изученным тест-бактериям. При этом оказалось необходимым установить: 1) время и скорость центрифугирования, позволяющие проводить полное отделение бактериальной биомассы, 2) оптимальный объем бактериального инокулянта, образующего формазан в наиболее короткие сроки наблюдения, 3) концентрацию трифенилтетразолий хлорида, не токсичную для тест-бактерий и в то же
время обеспечивающую образование формазана в течение первых часов опыта.
Скорость центрифугирования 4000 об/мин при времени, равном 20 мин, обеспечивала полное отделение клеток эшерихий от культуральной жидкости и при отмывке их биомассы водой или физиологическим раствором. С целью определения наиболее оптимального объема тест-бактерий для реакции дегидрирования исследования проведены с 1,0 и 0,5 мл суспензии эшерихий с концентрацией 1 млрд/мл. При этом испытаны растворы три-фенилтетразолий хлорида (ТТХ) различной концентрации — от 0,01 до 0,5%. Результаты оценивались в баллах — от 0 до 5.
Оказалось, что при концентрациях раствора ТТХ от 0,01 до 0,1% выход формазана при дегидрировании бактериями глюкозы, независимо от объема инокулянта был очень низкий — от 0 до 2 баллов через 3 ч инкубации и от 2 до 4 — при 24-часовой инкубации. Наиболее оптимальной оказалась концентрация раствора 0,5%, она не ингибировала рост эшерихий и обеспечивала образование значительного количества формалина. В этом случае при объеме инокулянта 1 мл уже через 2 ч образование формазана оценивалось 4 баллами, при объеме 0,5 мл — 3, а через 24 ч инкубации показатели были соответственно^ и 3 балла. Таким образом, для постановки реакции дегидрирования глюкозы наиболее оптимальным являлся объем инокулянта, равный 1 мл, и 0,5% концентрация раствора ТТХ. При этих параметрах учет дегидрогеназной активности эшерихий мог быть осуществлен через 2 ч после^опыта.
Существенным явилось также и то, что тест-бактерии при изученных условиях не образовывали эндогенных дегидрогенез, при наличии которых затрудняется или даже полностью исключается определение субстратных дегидрогеназ, активность которых служила предметом исследования.
Работа была начата со сравнительного определения количества образуемого бактериями формазана в зависимости от времени дегидрирования субстрата. Полученные данные позволили заключить, что же через 2 ч в результате дегидрирования эшерихиями глюкозы образуется значительное количество формазана. Это дало возможность ограничить время учета реакции дегидрирования двумя часами.
В ходе дальнейших исследований выявлено, что для получения сравнимых данных по дегидрированию субстрата весьма существенным является применение в опытах не только постоянного объема инокулянта тест-бактерий, но и инокулянта, имеющего постоянную плотность бактериальных клеток. При использовании для этой цели стандарта мутности плотность бактериальной суспензии не всегда одинакова, поэтому для создания постоянной плотности мы выравнивали ее на электрофотоколориметре с помощью зеленого светофильтра в кювете 5 мм. Оптимальной для опытов оказалась бактериальная суспензия с показателем светорассеивания 0,32— 0,34.
На основании проведенных наблюдений определение дегидрогеназной активности эшерихий представляется в следующем виде. Готовят густую суспензию тест-микроба на физиологическом растворе из суточной культуры на скошенном мясо-пептонном агаре. Микробные клетки из суспензии осаждают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин, а надоса-дочную жидкость сливают. Клетки отмывают 3—4 раза водопроводной водой или физиологическим раствором при той же скорости и времени центрифугирования. Из отмытых клеток готовят суспензию тест-бактерии в физиологическом растворе с постоянной плотностью, соответствующей показанию ФЭК 0,32—0,34. Плотность суспензии определяют в кюветах 5 мм при зеленом светофильтре.
В химически чистые сухие пробирки вносят в указанной последовательности следующие растворы: 1,2 мл Х/15М Ыа2НР04, 0,5 мл 0,1 М глюкозы (субстрат для дегидрирования), 0,1 мл 0,1|М А^вО«, 0,2 мл 0,5%
трифенилтетразолий хлорида, 1 мл микробной суспензии и исследуемое вещество в количестве, создающем необходимую его концентрацию в пересчете на 1 л. Общий объем реакционной смеси должен быть равен 3 мл. Смесь инкубируют в термостате при 37° в течение 2 ч до появления окраски формазана. Для освобождения формазана клетки разрушают ледяной уксусной кислотой, которую добавляют по 3 мл в каждую пробирку. Из реакционной смеси формазан извлекают толуолом (3 мл на каждую пробирку). Пробирки несколько раз встряхивают и отстаивают до полного извлечения формазана. На полноту его извлечения указывает обесцвечивание реакционной смеси. Формазан очень осторожно с помощью пастеровской пипетки переносят в кюветы для колориметрирования. Колориметри-руют в кюветах 3 мм при сине-зеленом светофильтре (с фильтром 490 нм). Количество образованного бактериями формазана рассчитывают по калибровочной кривой.
Исследования проводят не менее чем пятикратно для возможности статистической обработки полученных результатов. При этом определяют значение доверительного коэффициента, в зависимости от этого показателя оценивают действие испытанной концентрации токсиканта 1.
Для построения калибровочной кривой готовят растворы формазана различной концентрации. Для приготовления основного раствора к 10 мг трифенилтетразолий хлорида добавляют 100 мг гидросульфита натрия и 2—5 мл фосфатного буфера с рН 7,4. Образовавшийся осадок формазана доводят толуолом до объема 20 мл. Основной раствор содержит 1000 мкг формазана в 2 мл. Из основного раствора путем сочетания его различных объемов с толуолом готовят стандартные растворы с концентрацией формазана от 5 до 500 мкг. Светопоглощаемость стандартных растворов измеряют на ФЭК и по полученным данным строят калибровочную кривую.
Экспериментально отработанные условия исследования по определению дегидрогеназной активности эшерихий позволили начать изучение активности этой ферментативной реакции в присутствии различных концентраций хлорофоса. Опыты проведены с концентрациями пестицида 0,5; 1,0; 2,0 и 5,0 г/'л. Все эти концентрации ингибировали дегидрогеназную активность эшерихий. В зависимости от концентрации хлорофоса дефицит в образовании бактериями формазана по сравнению с контролем составлял 15—38%. Статистическая обработка полученных данных показала достоверное снижение дегидрогеназной активности эшерихий в присутствии каждой из испытанных концентраций хлорофоса по сравнению с контролем.
Таким образом, при установлении токсичности хлорофоса для эшерихий методом определения дегидрогеназной активности статистически достоверное изменение этого показателя обнаружено при концентрации пестицида 0,5 г/л.
В то же время, как было показано нами ранее, при определении влияния хлорофоса на эшерихии, по данным роста и развития популяции (спро-ба на развитие»), токсичность этого вещества проявлялась при более высоких его концентрациях. Так, при выращивании эшерихий на мясо-пеп-тонном агаре задержка роста обнаружена при содержании в среде хлорофоса 10 г/л; в мясо-пептонном бульоне эшерихии погибали при этой концентрации пестицида через 48 ч, но практически сохраняли одинаковую о контролем численность при концентрации 1 г/л (С. Я. Найштейн, Е. М. Юровская). В речной воде по сравнению с мясо-пептонным бульоном токсическое влияние хлорофоса усиливалось и проявлялось в ускорении гибели микроорганизмов при концентрации пестицида 1 г/л (Е. М. Юровская). В черноземной почве ускорение гибели эшерихий наблюдалось при количестве хлорофоса 10 г/л (Е. М. Юровская).
Полученные в работе результаты и их сравнение с данными выполненных нами ранее экспериментальных исследований позволяют заключить
1 Это обстоятельство делает метод малоприменимым в практических лабораториях.— Ред.
следующее. При исследовании токсичности некоторых пестицидов определение дегидрогеназной активности бактерий — более чувствительный показатель по сравнению с учетом количества микроорганизмов и их выживаемостью. Существенно также и то, что вычисление дегидрогеназной активности проводится в строго унифицированных условиях, что позволяет осуществлять сравнение результатов исследований, проведенных с различными микроорганизмами и химическими веществами. К преимуществам этого метода относится также его экспрессность, сохранение заданной концентрации изучаемого вещества в течение опыта, осуществление наблюдений в большей повторности (что существенно при статистической обработке результатов), инструментальное проведение анализа.
ЛИТЕРАТУРА. Зотов В. М. — «Водоснабжение и сан. техн.», 1972, № 3, с. 16. — К а л а б и и а М. М. — «Гиг. и сан.», 1945, № 4—5, с. 1—6. — Мороз А. Ф. — В кн.: Мицерин, 1961, с. 165—172. — Н а й ш т е й н С. Я., Юровская Е. М. — В кн.: Экспериментальная водная токсикология. Вып. 3. Рига, 1972, с. 119—130. — Роговская П. И., Оршанская Ф. Б. — В кн.: Предельно допустимые концентрации вредных веществ в воздухе и воде. Л., 1975, с. 316—320. — Юровская Е. М. — «Гиг. и сан.», 1975, № 9, с. 102—103.
Поступил» 26/У1 1976 р.
УДК 613.263:683.9161-074:646.49.66
Л. Р. Полищук, И. 3. Зисерман ОПРЕДЕЛЕНИЕ РТУТИ В ШОКОЛАДНЫХ ИЗДЕЛИЯХ
Киевский научно-исследовательский институт гигиены питания
Метод основан на кислотном озолении пробы, выделении ртути из минерал изата раствором дитизона в четыреххлор истом углероде, последующей реэкстракции ртути в раствор йода в йодистом калии и колориметрическом определении по реакции образования окрашенного в розовый цвет осадка ртутно-медно-йодистого комплекса.
Раствор дитизона готовят следующим образом: в 100 мл четыреххло-ристого углерода растворяют 50 мг дитизона и отфильтровывают раствор через бумажный фильтр в делительную воронку емкостью 500 мл. Реэкст-рагируют 100 мл разбавленного раствора аммиака (1 : 50). Коричневый слой растворителя отбрасывают, а оранжевый аммиачный раствор дитизона подкисляют 1 н. соляной кислотой и встряхивают с 200 мл четыреххлори-стого углерода до обесцвечивания водного раствора. Полученный зеленый раствор дитизона разбавляют растворителем до 500 мл и хранят в пробирке из темного стекла под слоем 2 н. серной кислоты. Рабочие растворы дитизона (0,001%) получают по мере необходимости путем соответствующего разбавления основного раствора.
Раствор йода в йодистом калии: 2,5 г кристаллического йода и 30 г йодистого калия растворяют в небольшом количестве воды и доводят до 1 л дистиллированной водой.
Составной раствор готовят перед употреблением, смешивая одну часть 10% раствора сернокислой меди, с пятью частями 2,5—3 н. раствора сернокислого натрия (32 г кристаллического или 16 г безводного сульфита натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды).
Приготовление стандартного раствора ртути: 0,0135 г хлорной ртути (сулема) растворяют в воде в мерной колбе на 100 мл, прибавляют 1—2 капли концентрированной азотной кислоты и доводят водой до метки. В 1 мл полученного исходного раствора содержится 100 мкг ртути. Раствор годен к употреблению в течение 6 мес. Для получения рабочего раствора с содержанием ртути 1 мкг/мл исходный раствор разбавляют водой в 100 раз, и такой раствор годен к использованию только в течение недели.
