CC BY
62CRISPR/CAS9 TEXNOLOGIYASI YORDAMIDA SOYA GENOMINI
TAHRIRLASH
Abdurahmon Mirzakamol Bexzod Orifjon Lola
Nodirjon o'g'li Sobitjonovich o'g'li Mamajonov Xayriddinovna
Yusupov Ayubov Pazlieva
O'zRFA Genomika va bioinformatika markazi
ANNOTATSIYA
CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) — guruhlangan muntazam qisqa palindromli takrorlanishlar texnologiyasining paydo bo'lishi, genomni tahrir qilish va gen transkripsiyasini o'zgartirish orqali organizmlar genomini maqsadli o'zgartirishga imkon berdi. So'ya (Glycine max (L.) Merr.) kabi qimmatbaho qishloq xo'jaligi ekinlarining xo'jalik belgilarini sifat va miqdoriy jihatdan yaxshilashda CRISPR an'anaviy seleksiya va boshqa transgen o'simlik olish usullariga qaraganda maqsadli genom modifikatsiyasini tezroq va yuqori aniqlik bilan amalga oshirish imkoniyatiga ega.
Shuni ta'kidlash kerakki, CRISPR/Cas asosida hosil qilingan genomdagi o'zgarishlar aynan nishon qilingan genni o'chirishga qaratilgan va bunda genetik vektordagi antibiotikka chidamlilik geni genomdan chiqib ketadi. Natijada, faqatgina nishon geni mutasiyaga uchragan, ammo antibiotik sintez qilmaydigan yangi o'simlik olishga erishiladi.
Ushbu tadqiqotda soyada soyani qurg'oqchilikka chidamliligini oshirish masadida qurg'oqchilikka aloqdor E-1 genini nishon sifatida tanlab olindi. Maqsadga muvofiq mutagenez hosil qilish uchun sintetik E-1 genining 1,3 va 4 ekzonlariga mos sgRNAlar tuzildi. Soyaning U6-10 va Arabidopsis thaliananing U6-26 promotorlari yordamida sgRNAlar bilan vector konstruksiya yaratildi.
Kalit so'zlar: CRISPR/Cas9, soya, genomni tahrirlash, TALEN, crRNK, tracrRNA, vector konstruksiya.
CRISPR/CAS9-BASED GENE EDITING IN SOYBEAN
ABSTRACT
The appearance of the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) technology has been opened the way to purposefully modify the organisms by modifying genome and gene transcription. By improving the qualitative and quantitative characteristics of valuable crops such as soybeans (Glycine max (L.) Merr.), CRISPR provides faster and more accurate modification of the target genome than traditional selection and other methods for growing transgenic plants. The advantage of this
technology is making mutations in only targeted genes and removing of the antibiotic resistance gene, the part of the genetic construction from the genome.
In this study, the drought-related E-1 gene was selected among many stress related genes as a target in order to increase the resistance of soybeans to drought. Artificial sgRNAs corresponding to exons 1,3 and 4 of the E-1 gene were created to generate targeted mutagenesis. The vector conctruction was developed along with the U6-10 (soybean) and the U6-26 promoters of the Arabidopsis thaliana.
Keywords: CRISPR/Cas9, soybean, genome editing, TALEN, crRNA, tracrRNA, vector construction.
Kirish
Soya (Glycine max L.) - dukkakli ekin bo'lib, urug'i tarkibida ko'p miqdorda oqsil va yog' saqlaydi. Shu sababli oziq-ovqat, yem-xashak va sanoat maqsadlarida keng yetishtiriladi [1]. Soya katta iqtisodiy ahamiyatga ega bo'lganligi bois dunyo olimlari yillar davomida genlar funktsiyasini tahlil qilish hamda genomni o'zgartirish texnologiyalaridan foydalangan holda, uning xo'jalik belgi va xususiyatlarini yaxshilashga intilmoqda.
Paleopoliploid tur sifatida, soya genlari funktsiyasini o'rganish genetik o'zgarishlarning past chastotaliligiga qo'shimcha ravishda, genetik xilma-xillikning ko'pligi bilan ham murakkabdir [2]. An'anaviy gen muhandisligi texnologiyalari ekzogen DNKni o'simlik genomiga integratsiyalashuvi orqali gen ekspressiyasini modulyatsiya qilishi mumkin. Natijada gen ekspressiyasi susayadi yoki haddan tashqari ortadi [3, 4]. Biroq, ular ba'zi texnik kamchiliklarni, masalan, gen nokautning noaniqligi hamda to'liq bo'lmasligi, begona genlarini nazorat qilib bo'lmaydigan ekspressiyalanish darajasi va genomga birikish joylarining tasodifiyligi kabilarni bartaraf eta olmaydi [5].
Soya genomi murakkab bo'lib, tarkibidagi genlar juda ko'p takrorlanadi. Shu sababli soya genomini tahrirlashda aniq va sodda usullar talab qilinadi. So'nggi vaqtlarda CRISPR/Cas tizimi asosidagi genlarni tahrir qilish texnologiyasi soddaligi, yuqori samaradorligi va aniqligi kabi qator afzalliklarga egaligi tufayli turli o'simliklarda keng qo'llanilmoqda [2]. Ushbu texnologiya genomni tahrir qilishda maqsadli loyihalashtirish va klonlashni osonlashtirish uchun keng ko'lamli platformalarga ega [6].
CRISPR/Cas tizimi genomni tahrirlash platformalaridan eng so'ngisi hisoblanadi. Bu tizim Streptococcus pyogenes bakteriyasida immun tizimining tarkibiy qismi sifatida kashf etilgan. CRISPR/Cas tizimi bakteriyalar va arxeyalarda keng tarqalgan bo'lib, xo'jayin organizmini virusli (fag) va plazmidli DNKning kirib kelishidan himoya qilish uchun adaptiv immun javob reaksiyasi sifatida xizmat qiladi [7,12]. Virus hujum qilganda, bakteriyalar kiruvchi DNK yoki RNKning tegishli ketma-ketligini CRISPR lokusida hujayra genomiga qisqa bo'laklar/ketma-ketliklar sifatida birlashtiradi.
CRISPR lokusidagi DNK ketma-ketligi bir xil uzunlikdagi ajratuvchi intervallar bilan "DNK-ketma-ketliklari" -interval- "DNK-ketma-ketliklari" tarzida ajratilganligi sababli, ushbu takrorlanishlar "CRISPR—Clustered regularly interspaced short palindromic repeats'" ya'ni guruhlangan muntazam qisqapalindromli takrorlanishlar nomini olgan [13].
CRISPR/Cas tizimi Cas effektor modulining arxitekturasiga ko'ra ikki sinfga bo'linadi. Birinchi sinfga bir nechta subbirliklardan iborat Cas oqsil komplekslari bilan tavsiflanadigan I, III va IV tiplar kiradi. Ikkinchi sinf esa II, V va VI turlarini o'z ichiga oladi va u faqat bitta katta Cas oqsilidan iborat [14]. CRSPR / Cas9 tizimi ikkinchi sinfga mansub bo'lib, uchta komponentdan Cas9, crRNA va tracrRNA (transaktiv crRNK) iborat. crRNA nishonlangan DNK fragmentining nukleotid ketma-ketliklari bilan komplimentarlik asosida bog'langan qisqa intervalli ketma -ketliklarni o'z ichiga oladi va trakrRNK bilan aynan shu nukleotid juftliklarini takrorlaydi. crRNA va tracrRNA Cas9 bilan kompleks hosil qilganda, Cas9 faollashadi [15].
CRSPR / Cas9 tizimi ilk bor 2013-yilda sichqon va inson hujayralari genomini tahrirlashda muvaffaqiyatli qo'llanilganidan buyon, butun dunyo miqyosida arabidopsis, tamaki, guruch, zig'ir, bug'doy, makkajo'xori, pomidor, kartoshka, bodring kabi ko'plab o'simliklarga keng tadbiq qilinmoqda [16].
CRISPR/Cas9 texnologiyasini soya o'simligida ilk bor 2015-yil beshta jamoa ishida o'simlikning ildiz tizimida hamda somatik embrionlarida maqsadli mu tatsiyalarni hosil qilish uchun Agrobacterium rhizogenes vositasida qo'llanilgan. Natijada tukli ildiz tizimiga ega o'simliklar olingan [2,8,18,19,20]. Li va uning jamoasi soya genomini tahrirlash uchun mos bo'lgan Cas9-gRNA tizimini qo'llab, NHEJ (non-homologous end joining) orqali qariyb 76% maqsadli mutagenezga erishdi. Shu bilan birga HDR (homologous directed repair) orqali genomni tanlangan qismida genlar maqsadli integratsiyalashgan mutant o'simliklarni hamda asetolaktat sintaza1 (ALS1) geni mutatsiyaga uchragan xlorsulfuronga chidamli soya oldi [8]. Keyinchalik, soya genomini tahrirlash bo'yicha tadqiqotlar asosan Cas9/sgRNK transgenlarini o'z ichiga olgan eksplantlardan qayta tiklangan mutant o'simliklar yordamida olib borildi [9,10]. Jumladan, CRISPR/Cas9 tizimi va Agrobacterium rhizogenes vositasida transformatsiya qilish texnolgiyasidan foydalangan holda, Cai o'z laboratoriyasida gullashga javob beruvchi GmFT2a genini funksiyasini yo'qolishi gullash vaqtini kechiktirishi mumkinligini aniqladi. Shuningdek, ular soya genomidagi katta fragmentlarni olib tashlash uchun ikkita sgRNA/Cas9 tizimini ishlab chiqdilar va bu mutatsiyalar avlodlarga o'tishi mumkinligini tasdiqladilar [19].
2016-yilda Du TALENs va CRISPR/Cas9 tizimini tahrir qilish samaradorligini fitoen desaturaza sinteziga aloqador ikkita GmPDS11 va GmPDS18 genilari asosida tukli ildizga ega soya o'simliklarida solishtirdi [20]. Natijalar GmU6-16g-1 promotridan foydalangan holda CRISPR/Cas9 tizimini qo'llash bir vaqtning o'zida ikkita allelni
nishonga olishda TALEN texnologiyasiga qaraganda yuqori samaradorlikka ega ekanligini ko'rsatdi. Di shuningdek, bir nechta GmU6 promotrlarini soya va Arabidopsis thaliana o'simliklari tukli ildizlarida sgRNK ekspressiyasini boshqarish uchun mos bo'lganlarni topish maqsadida qo'shimcha tadqiqot o'tkazdi. Tadqiqot natijasida GmU6-8 va GmU6-10 promotrlarini gen tahrirlash samaradorligini oshirish uchun yuqori faollikka ega ekanligini aniqlandi [21]. Bundan tashqari, soya zaxira oqsili genlari Li tomonidan va nodulyatsiyaning o'ziga xosligini nazorat qiluvchi nomzod genlari Tang tomonidan CRISPR / Cas9 tizimi hamda hairy-root transformatsiya tizimi bilan birgalikda o'tkazilgan tadqiqotlarda tahrirlangan va yaxshi o'rganilgan.
Cai va Do tomonidan olib borilgan tadqiqotlar soyadagi bir xil xromosomada ikkita qo'shni lokusni ajratish uchun dual-sgRNK yordamida katta genom o'chirish hosil bo'lishi mumkinligini ko'rsatdi [24,25]. Bu orqali Dual-sgRNA dizayni nafaqat ikki tomonlama tahrir qilish qobiliyati tufayli gen mutatsiyalari chastotasini oshirishi, balki nishonlangan genni to'liq ochirilishini ta'minlash uchun katta fragmentlar deletsiyasini ham hosil qilishi mumkin ekanligi ochib berildi. So'ngi yillardagi tadqiqotlar natijasi o'laroq Mengyan tomidan optimallashtirilgan ko'p bosqichli jarayonlar bilan birlashtirilgan CRISPR-Cas9 platformasi ishlab chiqildi. Ushbu platformadan foydalangan holda, 100 dan ortiq nomzod genlarga mo'ljallangan multipleks mutagenezli soya populyatsiyasi yaratildi [26].
Yuqoridagi tadqiqotlarning ahamiyati shundaki, har bir tadqiqot soya o'simligini tadqiq qilishda CRISPR/Cas texnologiyasiga asoslangan samarali tizimni yaratish uchun muhim manba bo'lib xizamat qiladi. Soya genomini maqsadli tahrirlashdagi bunday muvaffaqiyatli dasturlar uni sanoat miqyosida yetishtirishda CRISPR / Cas9 tizimining o'rni muhimligini ko'rsatadi.
O'zbekiston Respublikasi Fanlar Akademiyasi Genomika va bioinformatika markazida olib borayotgan tadqiqotlarda ham aynan CRISPR/Cas tizimi orqali soya o'simligini qurg'oqchilikka chidamliligini oshirishga e'tibor qartilgan. Adabiyotlar asosida soya o'simligida qurg'oqchilikka aloqador genlar har tomonlama chuqur o'rganildi. Qurg'oqchilikka chidamli bo'lgan soya liniyalarini olish borasidagi taqdiqotlar uchun nisbatan kam o'rganilgan, qurg'oqchilikka aloqador bo'gan E-1 geni tanlab olindi va ushbu gen asosida CRISPR/Cas9li genetic vector konstruksiya hosil qilindi. Ushbu genetik konstruksiya bir nechta bosqichli reaksiyalar asosida E.Coli bakteriyasining maxsus shtamlariga transformasiya qilindi. Bakteriya genomida ushbu konstruksiyaning ekspressiyasini tekshirish maqsadida maxsus praymerlar yordamida sekvens qilindi. Shuningdek, o'simlikka transformasiya qilish uchun Agrobakterium tumifaciens bakteriya shtammlaridan foydalanildi.
Materiallar va usullar.
Bakteriya shtamplari: XL1-Blue Escherichia coli kompetent hujayralar, TOP10 bir martalik kompetent hujayralar.
Fermentlar va PCR to'plamlari: XbaI (NEB), Hind III (NEB, R3535s), 10x CutSmart buffer (NEB, R3535s), XhoI (NEB), EcoRI, Dream Taq Hot Start Green PCR Master Mix, T4 DNK ligazasi, 10xT4 DNA ligase buffer containing10 mM ATP (NEB, M0202s), T4 DNA ligase (NEB,M0202s), Monarch DNA Gel Extraction Kit (NEB T1020L).
LB suyuq ozuqa muhiti: 5 g/L achitqi ekstrakti, 10 g/L tripton, 5 g/L NaCl, (pH 7.0). 20 daqiqa avtoklavda sterillanadi. Ishlatishdan oldin tegishli antibiotik qo'shiladi. LB agar qattiq ozuqa muhiti: agar-agarni o'z ichiga olgan LB suyuq ozuqa muhiti. 20 daqiqa avtoklavda sterillanadi. Zarur bo'lganda, petri plastinkalariga quyishdan oldin ozuqa muhitga tegishli antibiotik qo'shiladi. Antibiotiklar: ampetsilin va spektinomitsin.
Boshqa zarur laboratoriya asbob-uskunalari: PZR termosikler, suv hammomi, inkubator, nanofotometr, sentrifuga, elektroforez uskunalari, 0,2 ml PCR probirkalari, 1,5 ml va 2- ml probirkalar.
Dastlab, o'simlikka transformatsiya qilish va E-1 genini tahrirlash uchun maqsad qilingan vektor konstruksiyaning dizayni in-slico shaklida SnapGene 5.2.5.1 dasturi yordamida tuzildi.
Soyaning qurg'oqchilikka aloqador E-1 genini CRISPR/Cas9 vektor tizimi yordamida ko'p tomonlama tahrir qilishda Ma tomonidan taqdim qilinga usuldan foydalanildi [27]. Chopchop veb dasturi (http ://chopchop.cbu.uib. no/) tanlab olingan genning ekzon qismi uchun ixtiyoriy sgRNA ketma-ketliklarini va mos ravishda PAMni ajratib ko'rsatish imkoniyatiga ega. Yuqoridagi qulayliklarni hisobga olgan holda ushbu veb dastur vositasida soyaning E-1 genining 3 ta ekzon qismi uchun maqsadga muvofiq sgRNA ketma-ketliklari tanlab olindi. Tanlangan sgRNAlardan Integrated DNA Technologies (https://www.idtdna.com) tomonidan taqdim qilingan protokol asosida dupleks hosil qilindi [28].
Har bir sgRNA ekspressiyalanuvchi kassetasi quyidagi 10 mL hajmdagi restriksiya-ligaza reaksiyasi aralashmasida alohida hosil qilindi: 1 mkl oraliq vektor (15 ng/mkL), 1 mL 10x CutSmart bufferi (NEB), 0,5 mkl 10x T4 DNK ligaza buferi (NEB, tarkibida ATP saqlovchi), 5 mkl BsaI-HF (NEB), 20 mkl T4 DNK ligazasi (NEB), 0,5 mkl dupleks (2-qadam) va reaksiya aralashmasi suv bilan 10 mklga steril yetkazildi.
Restriksiya-ligaza reaksiyasi termosiklerda 37°C haroratda 30 daqiqa olib borildi.
Barcha oraliq vektorlar assembl hosil qiluvchi vektorga Golden Gate reaksiyasi orqali kiritildi.
Natijalar va uni muhokama qilish.
CRISPR/Cas9 tizimi hozirga qadar qishloq xo'jaligining ko'plab muhim ekin turlarida genom muhandisligi uchun muvaffaqiyatli qo'llanilib kelinmoqda. Bu tizimni soya kabi murakkab genomga ega o'simliklarda genomni tahrirlashga taqbiq qilinishi esa xo'jalik belgilari yaxshilangan liniya va navlarni yaratishda muhim ahamiyatga ega.
Yuqorida biz soya o'simligining qurg'oqchilikka aloqador E-1 genini CRISPR/Cas9 tizimi vositasida tahrirlash usulini tasvirlab berdik.
Tadqiqotlarimiz natijasida transformatsiyaning samaradorligini oshirish uchun sgRNA va Cas9 kassetlari bitta vektorga yig'ildi. Hozirda soyaning E-1 geni CRISPR/Cas9 tizimi vositasida tahrirlash uchun tuzilgan konstryksiyani o'simlikka transformatsiya qilish ishlari olib borilmoqda.
REFERENCES
1. Hartman GL, West ED, Herman TK. Crops that feed the world 2. Soybean-worldwide production, use, and constraints caused by pathogens and pests. Food Security 2011 March 3(1):5—17. DOI:10.1007/s12571-010-0108-x
2. Jacobs TB, LaFayette PR, Schmitz RJ, Parrott WA. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnol. 2015 Mar 12;15:16. doi: 10.1186/s 12896-015-0131-2.
3. Prelich G. Gene overexpression: uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 2012 Mar;190(3):841-54. doi: 10.1534/genetics.111.136911.
4. Kusaba M. RNA interference in crop plants. Curr Opin Biotechnol. 2004 Apr;15(2):139-43. doi: 10.1016/j.copbio.2004.02.004.
5. Ma X, Zhu Q, Chen Y, Liu YG. CRISPR/Cas9 Platforms for Genome Editing in Plants: Developments and Applications. Mol Plant. 2016 Jul 6;9(7):961-74. doi: 10.1016/j.molp.2016.04.009.
6. Liu J, Gunapati S, Mihelich NT, Stec AO, Michno JM, Stupar RM. Genome Editing in Soybean with CRISPR/Cas9. Methods Mol Biol. 2019;1917:217-234. doi: 10.1007/978-1-4939-8991-1_16.
7. Bhaya D, Davison M, Barrangou R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annu Rev Genet. 2011;45:273-97. doi: 10.1146/annurev-genet-110410-132430.
8. Li Z, Liu ZB, Xing A, Moon BP, Koellhoffer JP, Huang L, Ward RT, Clifton E, Falco SC, Cigan AM. Cas9-Guide RNA Directed Genome Editing in Soybean. Plant Physiol. 2015 0ct;169(2):960-70. doi: 10.1104/pp.15.00783.
9. Du H, Zeng X, Zhao M, Cui X, Wang Q, Yang H, Cheng H, Yu D. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. J Biotechnol. 2016 Jan 10;217:90-7. doi: 10.1016/j.jbiotec.2015.11.005.
10. Cai Y, Chen L, Sun S, Wu C, Yao W, Jiang B, Han T, Hou W (2018) CRISPR/Cas9- mediated deletion of large genomic fragments in soybean. Int J Mol Sci 19:3835. https://doi. org/10.3390/ijms19123835.
11. Cai Y, Chen L, Liu X, Guo C, Sun S, Wu C, Jiang B, Han T, Hou W. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of GmFT2a delays flowering time in soya bean. Plant Biotechnol J. 2018a Jan;16(1):176-185. doi: 10.1111/pbi.12758.
12. Sorek R, Lawrence CM, Wiedenheft B. CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea. Annu Rev Biochem. 2013;82:237-66. doi: 10.1146/annurev-biochem-072911-172315.
13. Kunin, V., Sorek, R. and Hugenholtz, P. (2007) Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. Genome Biol. 8. doi: 10.1186/gb-2007-8-4- r61
14. Koonin, E.V., Makarova, K.S., Zhang, F., 2017. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems. Curr. Opin. Microbiol. 37, 67-78. https://doi.org/10.1016/i.mib.2017.05.008.
15. Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C.M., Gonzales, K., Chao, Y.J., Pirzada, Z.A., Eckert, M.R., Vogel, J., Charpentier, E., 2011. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607. https://doi.org/ 10.1038/nature09886.
16. Bao, A.L., Burritt, D.J., Chen, H.F., Zhou, X.N., Cao, D., Tran, L.S.Phan, 2019a. The CRISPR/Cas9 system and its applications in crop genome editing. Crit. Rev. Biotechnol. 39, 321-336. https://doi.org/10.1080/07388551.2018.1554621.
17. Michno, J.M., Wang, X.B., Liu, J.Q., Curtin, S.J., Kono, T.J., Stupar, R.M., 2015. CRISPR/ Cas mutagenesis of soybean and Medicago truncatula using a new web-tool and a modified Cas9 enzyme. GM Crops Food 6, 243-252. https://doi.org/10.1080/ 21645698.2015.1106063.
18. Sun, X.J., Hu, Z., Chen, R., Jiang, Q.Y., Song, G.H., Zhang, H., Xi, Y.J., 2015. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci. Rep. 5, 10342. https:// doi.org/10.1038/srep10342.
19. Cai, Y.P., Chen, L., Liu, X.J., Sun, S., Wu, C.X., Jiang, B.J., Han, T.F., Hou, W.S., 2015. CRISPR/Cas9-mediated genome editing in soybean hairy roots. PLoS One 10, e0136064. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0136064.
20. Du, H.Y., Zeng, X.R., Zhao, M., Cui, X.P., Wang, Q., Yang, H., Cheng, H., Yu, D.Y., 2016. Efficient targeted mutagenesis in soybean by TALENs and CRISPR/Cas9. J. Biotechnol. 217, 90-97. doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.11.005.
21. Di, Y.H., Sun, X.J., Hu, Z., Jiang, Q.Y., Song, G.H., Zhang, B., Zhao, S.S., Zhang, H., 2019. Enhancing the CRISPR/Cas9 system based on multiple GmU6 promoters in soybean. Biochem. Biophys. Res. Commun. 519, 819-823. https://doi.org/10.1016/ j.bbrc.2019.09.074.
22. Li, C.L., Nguyen, V., Liu, J., Fu, W.Q., Chen K.F., Yu, Cui, Y.H., 2019. Mutagenesis of seed storage protein genes in Soybean using CRISPR/Cas9. BMC Res. Notes 12, 176. https://doi.org/10.1186/s13104-019-4207-2.
23. Tang, F., Yang, S.M., Liu, J.G., Zhu, H.Y., 2016. Rj4, a gene controlling nodulation specificity in soybeans, encodes a thaumatin-like protein but not the one previously reported. Plant Physiol. 170, 26-32. https://doi.org/10.1104/pp.15.01661.
24. Cai, Y.P., Chen, L., Sun, S., Wu, C.X., Yao, W.W., Jiang, B.J., Han, T.F., Hou, W.S., 2018b. CRISPR/Cas9-mediated deletion of large genomic fragments in soybean. Int. J. Mol. Sci. 19, 3835. https://doi.org/10.3390/ijms19123835.
25. Do, P.T., Nguyen, C.X., Bui, H.T., Tran, L.T.N., Stacey, G., Gillman, J.D., Zhang, Z.J., Stacey, M.G., 2019. Demonstration of highly efficient dual gRNA CRISPR/Cas9 editing of the homeologous GmFAD2-1A and GmFAD2-1B genes to yield a high oleic, low linoleic and a-linolenic acid phenotype in soybean. BMC Plant Biol. 19, 311. https://doi.org/10.1186/s12870-019-1906-8.
26. Bai, M.Y., Yuan, J.H., Kuang, H.Q., Gong, P.P., Li, S.N., Zhang, Z.H., Liu, B., Sun, J.F., Yang, M.X., Yang, L., et al., 2019. Generation of a multiplex mutagenesis population via pooled CRISPR -Cas9 in soya bean. Plant Biotechnol. J. e13239 https://doi.org/ 10.1111/pbi.13239.
27. Ma X, Liu YG. CRISPR/Cas9-Based Multiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants. Curr Protoc Mol Biol. 2016 Jul 1;115:31.6.1-31.6.21. doi: 10.1002/cpmb.10.
28. https://www.idtdna.com/pages/education/decoded/article/annealing-oligonucleotides
