CC BY
44
йО! 10.29254/2077-4214-2019-1-2-149-46-51 УДК 577.21: 579.25: 571.27
Сорока Д. С., Соколова I. €., Гаврилюк В. Г., Скляр Т. В.
CRISPR/CAS - АДАПТИВНА 1МУННА СИСТЕМА У БАКТЕР1Й ТА ПЕРСПЕКТИВИ И ЗАСТОСУВАННЯ У РЕДАГУВАНН1 ГЕНОМ1В Днiпровський нацюнальний унiверситет iм. Олеся Гончара (м. Днiпро)
diana40adp@gmail.com 2434868@ukr.net
Зв'язок публшацп з плановими науково-дослщ-ними роботами. Дана робота виконана у рамках науково-дослщноТ теми «Бюлопчш основи функци онування мiкробiоценозiв навколишнього серед-овища та органiзму людини (№ державноТ реестрацп 0119U100097), що виконуеться на кафедрi мтробюло-гп, вiрусологiT та бютехнологп Днiпровського ушверси-тету iменi Олеся Гончара.
Вступ. Вперше технолопя CRISPR виникла в рамках проекту фундаментальних дослщжень, метою яких було вивчення того, як бактерп захищаються вiд проникнення вiрусiв. Було встановлено, що в ^тинах багатьох бактерш iснуе адаптивна iмунна система -CRISPR, що дозволяе Тм виявляти та знищувати чужо-рщну i, перш за все, вiрусну ДНК.
На сьогоднi технологiю CRISPR/Cas9 вважають зна-чним проривом в бюлоги, оскiльки вона дозволяе ви-соко точно, економiчно та швидко редагувати, нокау-тувати та вирiзати дiлянки генiв i навiть цш гени, що несуть злоякiснi мутацп або ознаки генетичних хвороб, а також замшювати Тх на нормальш або корисн1 для оргашзму.
CRISPR/Cas дозволяе модифiкувати метаболiч-ш шляхи еукарiот i прокарiот, створювати штами технологiчно важливих бактерiй, стшких до рiзних фагiв. CRISPR/Cas вже устшно застосовуеться в ген-нш шженерп багатоклiтинних органiзмiв. CRISPR/ Cas-технолопя може бути застосована для отримання модифтованих тварин i культур рослин. Це дае мож-ливiсть ученим вщкривати новi бiотехнологiчнi стратеги.
Мета роботи: аналiз лiтературних джерел стосов-но CRISPR/Cas9-системи, механiзмiв ТТ функцiонування у бактерiй, перспектив та можливостей застосування у редагуваннi геномiв.
Вперше локус CRISPR, який являе собою повто-рюванi генетичнi елементи роздшеш варiабельними спейсерами, був винайдений у геномi Escherichia coli в 1987 р. групою японських вчених на чолi з Йосщзу-мi lсiно в унiверситетi Осаки. Перше наукове повщо-млення про CRISPR було зроблено ними в 1989 р. у журналi «Journal of bacteriology» [1]. В^м, вчеш не надали даному явищу великого значення. Масштабне вивчення CRISPR почав юпанський дослiдник Фран-циско Мохiка, який у 1993 р. також виявив повторюва-ш послiдовностi, роздiленi промiжками, в геномi археТ Haloferax mediterranei. Вчений назвав новий клас послщовностей ДНК «коротк палiндромнi повтори регулярно розташоваш групами» (вiд англ. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Мохи ка продовжив пошуки CRISPR у геномах шших мтро-бiв i до 2000 р. виявив Тх у 20 мiкроорганiзмiв, в тому числ^ у чумноТ палички (Yersinia pestis) та ш. [2]. Було зроблено припущення, що подiбнi за структурою по-
втори, наявш навiть у вiддалених груп мiкробiв, мають виконувати якусь дуже важливу функцiю [3].
Отриманi рiзними групами вчених даш дозволили встановити, що локус CRISPR - частина раш невщомо-го механiзму, який спрямований на захист бактерiй i архей вщ чужорщноТ ДНК i е проявом адаптивного iмунiтету мiкроорганiзмiв проти ураження вiрусами [4].
Типовi локуси CRISPR складаються з декшькох не-сумiжних прямих повторiв, роздiлених спейсерами - дшянками варiабельних послiдовностей ДНК. Ц1 спейсери представляють собою сегменти захоплених вiрусних або плазмiдних послщовностей i мають ви-соку швидтсть еволюцГТ [5].
CRISPR-повтор, зазвичай, м^ить 23-47 пар основ, а спейсер - 21-72 пари. Число груп «повтор/спейсер» може сягати 375, але зазвичай менше 50 [6]. Бактерп можуть м^ити бшьше одного локусу CRISPR. Очевидно, кожний локус забезпечуе захист вщ одного певно-го вiрусу. У архей Methanocaldococcus jannaschii було щентифтовано 18 локуав, ят складають бiльш, нiж 1% генома. Зазвичай CRISPR знаходяться в бам^аль-нш хромосомi, але можуть бути розташоваш i в плаз-мiднiй ДНК [7].
У 2002 р. були вщкрил також сas-гени локусiв CRISPR, якi зiбранi в оперони, що за складом та функ-^ями мають вiдмiнностi у рiзних бактерiй. Вони коду-ють синтез Cas-бттв - ферментiв, що беруть участь у розщепленнi чужорщних вiрусних ДНК. Кодованi сas-генами ферменти формують велику та неоднорщну родину бштв. Серед них видшяють 2 класи, 5 типiв i 16 пiдтипiв [8,9]. Системи I класу представлеш муль-тибiлковими ефекторними комплексами (Cascade, Cmr, Csm) i включають системи тишв I (найбшьш по-ширенi), III i IV. Системи II класу мають единий ефек-торний бшок i представлеш типом II - Csn1 (або Cas9), Csn2 i типом V - Cpf. Системи типу II активно викорис-товують у геннш iнженерiT. Кожний Cas-бiлок несе декшька функцiональних доменiв: типових нуклеаз (розрiзають ДНК), хелiказ (розплiтають ланцюги ДНК), полiмераз (нарощують ланцюг ДНК при ТТ подвоеннi) i ДНК-зв'язуючих бiлкiв. Тобто бiлки, якi кодуються зга-даними сas-генами, е полiфункцiональними i здатнi виконувати функцГТ всiх перелiчених вище ферментiв [10]. На рис. 1 зображена молекулярна структура бшка Cas9, видiленого iз клiтин Streptococcus pyogenes. Вш складаеться iз 5 домешв (REC I, REC II, HNH, RuvC, РАМ) i з'еднуючоТ мiстковоT спiралi (Bridge Helix) [11,12].
Домен Rec I е найбшьшим i вiдповiдае за зв'язування з керуючою РНК. Роль домена REC II ще недостатньо вивчена. Збагачена арпншом мiсткова спiраль (Bridge Helix) мае виршальне значення для ш^ацп активностi розщеплення при зв'язуванш с ДНК-мiшенню. Домен PAM-interacting забезпечуе специфiчнiсть PAM (вiд англ. protospacer adjacent
motif) i тому вщповщае за зв'язування з певною ДН^ мiшенню. Домени HNH i RuvC е доменами ендонукле-ази, яка розрiзаe ДНK. Вони гомологiчнi доменам HNH i RuvC, винайденим в шших бшках [11-14].
Як видно з рис. 2, у розтзнаванш чужорщно!' ДНK CRISPR-системою важливу роль виграе керуюча РНK (сгРНK, синожми Guide RNA та РНK-гiд). РНK-гiд за-вдяки комплементарностi з цтьовою ДНK-мiшенню (Target DNA) утворюе дуплекс, який розтзнаеться бiлком Cas9 (або шшим Cas-бiлком) i розщеплюеться завдяки його ендонуклеазнм активностi. Cas9 дозво-ляе розщеплювати практично будь-яку нуклеотидну послщовшсть. Вибiрковiсть Cas9 е настдком комп-лементарностi керуючо!' РНK i ДН^мшеш. Для нових ДНK-мiшеней можливе вироблення спеu1ифiчних Cas-бiлкiв [11,13,14,15].
В останш роки робляться спроби розшифрувати складний механiзм знищення чужорщно!' ДНK за учас-тю CRISPR/Cas-системи. На рис. 3 вiдображений ме-ханiзм дй CRISPR/Cas-системи при швазй вiрyсноï або плазмщно!' ДНК в клггину бак-терй Streptococcus thermophilus [16,17]. На першм стадй А (1мутзащя) активуеться Cas2 i розщеплюе чyжорiднy ДНK. Утворюеться новий спейсер -наприклад, фрагмент вiрyсноï ДН^ що вбудовуеться в CRISPR-касету. При повторному попа-данш вiрyсy в клiтинy бактерй' (стадя В, lмyнiтет) вiдбyваeться транскрипuiя на матриц CRISPR-касети з утворенням мРНK, яка несе в собi iнформаuiю про всi спейсери касети. В результат процесингу пiд дieю Cas2 мРНK гiдролiзyeться з утворенням окремих молекул РН^ серед яких вже е РН^пд для виявлен-ня вiрyсy, що проник у клп"ину.
За допомогою спеuифiчного РН^нда вщбуваеть-ся наuiлювання Cas1 на вiрyснy ДНK, у резyльтатi чого вщбуваеться ïï деградаuiя. Таким чином формуеться адаптивний iмyнiтет проти даного вiрyсy. За допомогою специфiчного РНK-гiда вiдбyваeться наuiлювання Cas1 на вiрyснy ДНK, у резyльтатi чого вщбуваеться ïï деградаuiя. Таким чином формуеться адаптивний iмy-нiтет проти даного вiрyсy. Слiд вiдмiтити, що Cas1 ко-дуеться yсiма в^цомими бактерiальними оперонами.
CRISPR/Cas-система не тшьки забезпечуе адаптивний iмyнiтет проти чужорщних генетичних елеметчв, але й дie як обмежувач горизонтального переносу генетично!' iнформаuiï (вiрyсiв, плазмiд, транспозо-нiв) мiж рiзними бактерiальними кл^инами. Система CRISPR може брати активну участь у регуляцй експресй' «своТх» бактерiальних генiв, а також постдовностей профагiв i транспозонiв у складi генома. Не виключе-но, що система CRISPR пригшчуе у бактерш вироблення деяких антигенiв, що допомагае !'м послабити iмyн-ну вщповщь з боку макроорганiзмy господаря [18].
Бшок Cas9 може виявляти та розщеплювати чу-жорiднi ДН^мшеш як в природних, так i в штучно створених системах CRISPR/Cas, тобто його можна розглядати як шструмент редагування генома. Була визначена можливють застосування Cas9 в генночн-
Рис. 1. Схема будови бтка Cas9 у S. pyogenes [11,12].
женернiй технологй, що дозволить вченим видаляти та вставляти фрагменти ДНК всередину клп"ин з не-ймовiрною точнiстю. Для розрiзання ДНК, як in vivo (у бактерм), так i в умовах in vitro з використанням CRISPR/Cas9 необх^цш наступш компоненти: РНКа-
Рис. 2. Кpисталiчна структура Cas9 у комплекс з РНК-пдом та цiльовою ДНК-мишенню у Staphylococcus aureus [15].
за III, бток Cas9, CRISPR-PHK (crRNA) та трансактива-цмна РНК (tracrRNA помiчники для пре-crPHK). Для спрощення використання CRISPR/Cas9 була створена едина химерна керуюча РНК [18,19].
Загальна стратепя редагування генома включае чотири основы етапи:
1) вибiр цшьовоТ послщовносп в геномi; 2) ство-рення нуклеазноТ конструкцй, спрямованоТ на обрану мшень; 3) доставка uiei конструкцй в клiтинне ядро; 4) аналiз отриманих мутаuiй [19].
Один з найважчих еташв у данiй технологи - вибiр сайтiв для специфiчного внесення дволанцюгового розриву. Тут слщ уникати повторюваних сайтiв (щоб розрiзати ДНК тiльки в певному мюцО, а також дшя-нок, ям мають високу гомологiю з шшими дiлянками геному i тому сильно схожих на цтьовий сайт [20].
Вщомо, що ендонуклеаза Cas9 реагуе на присут-нiсть РАМ (protospacer adjacent motif) з мотивом 5'-NGG-3', де N - будь-який з 4 нуклеотидiв. Те, що цей консенсус такий короткий, е, з одного боку, перевагою (його можна використовувати для великоТ кшькосп гешв), а з iншого - недолгом, так як iснуе порiвняно висока ймовiрнiсть неuiльових мутаuiй. CRISPR/Cas у Neisseria meningitidis розтзнае PAM з довгим кон-
Рис. 3. Схема формування iMyHiTeTy за допомогою системи CRISPR у Streptococcus thermophilus при швазп плазмщно!' або вiрyсноí ДНК [16,17].
сенсусом 5'-NNNNGATT-3'. Це обмежуе можливост у виборi мiшенi, проте тдвищуе специфiчнiсть и розтз-навання i знижуе ймовiрнiсть нецiльових мутацiй. Для пошуку потрiбних сайтiв пропонуеться застосування бюшформатики [21].
Варiанти Cas9, ям пов'язують ДНК, але не розще-плюють и (dCas9), можуть бути використаш для доставки активаторiв або репресорiв транскрипцп до специфiчних послiдовностей ДНК з метою регулюван-ня транскрипцшно''' активацп та репресп [17,18,19].
У даний час методи CRISPR/Cas9 використовуеться в геннiй шженерп рiзних органiзмiв, як прокарiот [22], так i одноклiтинних та багатокл!тинних еукарiот. Так, шляхом редагування гену риса, який в^дпов^дае за довжину i колiр проростка, були отримаш карликов! альбiноси [23].
За допомогою CRISPR/Cas9 вже отриманi геномо-дифтоваш рослини: рис, соя, пшениця, кукурудза, то-мати, апельсини. досл!джуються можливост! CRISPR/ Cas9 для створення против!русного iмунiтету рослин [24].
Ведуться роботи з редагування геном!в за допомогою CRISPR/Cas у велико''' рогато''' худоби, свиней та шших тварин, що мають важливе господарське зна-чення, наприклад, 6дж!л [25-27]. У листопад 2015 року було опублшовано результати експерименту, в ход! якого за допомогою технологи CRISPR/Cas в геном! свин! були разом шактивоваш 62 ендогенн! ретро-в!руси. Завдяки цьому в майбутньому стане можли-вою ксенотрансплантац!я орган!в в!д свин! до людини [28]. Розроблено методи редагування геном!в за допомогою CRISPR/Cas для модельних оргашзм!в. Тех-нолог!я CRISPR вже використовуеться для змши ДНК в кл!тинах мишей, мавп та !нших оргашзм!в. Техноло-
г!ю використовують для внесення дуже точних змш ДНК, що дозволяе вивчати 'х вплив на тканину та на весь оргашзм. Так, точкова зам!на д!лянки певного гена призвела до змши кольору шерст! мишей [29].
Методи, заснован на CRISPR/Cas9, можуть знайти застосування i в медицин! для лтування р!зних захворювань: в!русних, !мунолопчних (авто!мунних, алергп, !мунодеф!цит!в), онколог!чних, серцево-судинних захворювань, спад-кових розладв - таких, як синдром Дауна, ß-таласемт, серповиднокл!тин-на анем!я, п!гментний ретин!т тощо [3033]. У 2013 роц! з'явилася публ!кац!я [34] з пов!домленням про редагування аномального гену в стовбурових кланах патента, хворого на муковщидоз.
28 листопада 2018 р. у The New York Times з'явилось пов!домлення про те, що китайським вченим тд кер!вни-цтвом Хе Цзянькуя вдалося за допомогою CRISPR/Cas9 штучно створити стшких до зараження В1Л людей. У 2-х д!вчинок-близнят було проведено редагування генома з метою змши гена б!лку CCR5. Останнш е корецеп-тором ТCR у Т-хелпер!в i в!дпов!дае за зв'язування з капсидним в!русним бт-ком gp120, що забезпечуе проникнен-ня в!русу всередину !мунно' кл!тини i блокуе !мунну в!дпов!дь.
Вчен! прагнуть розширити розумшня того, як можна контролювати споаб в!дновлення ДНК п!сля п розриву, i з'ясувати, як можна контролювати i обмеж-увати нец!льов! впливи, або ненавмисш ефекти при використанш ще' технолог!'' [35]. Можлив!сть здшсню-вати редагування генома викликае i р!зн! етичн! питан-ня, як! потр!бно ретельно розглянути. I це накладае на вах вчених велику в!дпов!дальшсть i необх!дн!сть вра-ховувати як небажаш насл!дки, так i роль навмисного впливу цього наукового прориву [1].
Висновки. CRISPR/Cas система вперше виявлена у бактерш як система адаптивного !муштету проти швазп в!рус!в та !нших генетичних елемент!в. CRISPR складаеться з дек!лькох прямих повтор!в, розд!лених спейсерами - дтянками вар!абельних посл!довнос-тей ДНК. Cas-гени локус!в CRISPR, з!бран! в оперони. Вони кодують синтез Cas-бтшв - фермент!в, що бе-руть участь у розщепленш чужор!дних в!русних ДНК. Кожний Cas-бток е пол!функц!ональним i м!стить де-к!лька домен!в: типових ендонуклеаз, хелшаз, пол!ме-раз, ДНК-зв'язуючих бмшв. Виб!рков!сть д!' Cas-бiлкiв забезпечуеться РНК-пдом, що е комплементарним ДНК-мшеш.
Перспективи подальших досл1джень. На сьогодн! технолопю CRISPR/Cas9 вважають значним проривом в бюлогп, оск!льки вона дозволяе точно та швидко ре-дагувати д!лянки ген!в i нав!ть ц!л! гени, завдяки чому в!дкриваються перспективи для терапп важких спад-кових, онколог!чних, !нфекц!йних (в тому числ! СН1Д), серцево-судинних хвороб, вад розвитку, а також для створення геномодифтованих оргашзм!в з корисни-ми ознаками.
Лтература
1. Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of Bacteriology. 1987;169(12):5429-33. DOI: 0021-9193/87/125429-05$02.00/0
2. Lander ES. The Heroes of CRISPR. Cell. 2016;164(1-2):18-28. DOI: 10.1016/j.cell.2015.12.041
3. Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of Molecular Evolution. 2005;60(2):174-82. DOI: 10.1007/s00239-004-0046-3
4. Datsenko K, Pougach K, Tikhonov A. Molecular memory of prior infections activates the CRISPR. Cas adaptive bacterial immunity system. Nat. Commun. 2012;3:945. DOI: 10.1038/ncomms1937
5. Ki Hyun Nam, Fran Ding, Charles Haitjema, Qjngqiu Huang, Matthew PDe Lisa, Ailong Ke. Double-stranded Endonuclease Activity in Bacillus halodurans Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) - aassociated Cas2 Protein. J. Biol. Chem. 2012;287(43):35943-52. DOI: 10.1074/jbc.M112.382598
6. Horvath Р, Barrangou R. CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea. Science. 2010;327(5962):167-70. DOI: 10.1126/sci-ence.1179555
7. Jinek M, Chyilinski K, Fonfara I, Hauer M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-21. DOI: 10.1126/science.1225829
8. Barrangou R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines. Genome Biology. 2015;16:247-57. DOI: 10.1186/s13059-015-0816-9
9. Makarova KS, Koonin EV. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods in Molecular Biology. 2015;1311:47-75. DOI: 10.1007/978-1-4939-2687-9_4
10. Makarova S. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 2011;9(6):467-77. DOI: 10.1038/nrmicro2577
11. Jinek M,JiangF, Taylor DW. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediatedconformational activation. Science. 2014;343(6176):1247997. DOI: 10.1126/science.1247997
12. Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell. 2014;156(5):935-49. DOI: 10.1016/j. cell.2014.02.001
13. Sternberg SH, Redding S, Jinek M, Greene EC, Doudna JA. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 2014;507(7490):62-7. DOI: 10.1038/nature13011
14. Anders C. Niewoehner O, Duerst A, Martin J. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. 2014;513(7519):569-73. DOI: 10.1038/nature13579
15. Hiroshi Nishimasu, Le Cong, Winston XYan, Ryuichiro Ishitani, Feng Zhang, Osamu Nureki, et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 2015;162(5):1113-26. DOI: 10.1016/j.cell.2015.08.007
16. Garneau JE, Dupuis ME, Villion M, Romero DA, Barrangou R, Boyaval P, et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. 2010;468(7320):67-71. DOI: 10.1038/nature09523
17. Erik J. Sontheimer and Luciano A. Marraffini. MICROBIOLOGY: Slicer for DNA. Nature. 2010;468(7320):45-6. DOI: 10.1038/468045a
18. Sampson TR, Saroj SD, Llewellyn AC, Tzeng YL, Weiss DS. A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence. Nature. 2013;497(7448):254-7. DOI: 10.1038/nature12048
19. Nemudryiy AA, Valetdinova KR, Medvedev SP, Zakiyan SM. Sistemyi redaktirovaniya genomov TALEN i CRISPR/Cas - instrumentyi otkryitiy. Acta naturae. 2014;3(22):20-42. [in Russian].
20. Mali Prashant, Esvelt Kevin M, Church George M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods. 2013;10(10):957-63. DOI: 10.1038/nmeth.2649
21. Doench JG, Hartenian E, Graham DB, Tothova Z, Hegde M, Smith I, et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 2014;32(12):1262-7. DOI: 10.1038/nbt.3026
22. Mojica F, Díez-Villaseñor C, García-Martínez J, Almendros C. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system. Microbiology. 2009;155(3):733-40. DOI: 10.1099/mic.0.023960-0
23. Elizabeth Pennisi. The CRISPR Craze. Science. 2013;341(6148):833-6. DOI: 10.1126/science.341.6148.833
24. Zaidi SS, Tashkandi M, Mansoor S, Mahfouz MM. Engineering Plant Immunity: Using CRISPR/Cas9 to Generate Virus Resistance. Frontiers in plant science. 2016;7:1673. DOI: 10.3389/fpls.2016.01673
25. Wang Zhongde. Genome engineering in cattle: recent technological advancements. Chromosome Research: an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 2015;23(1):17-29. DOI: 10.1007/s10577-014-9452-6
26. Niemann H, Petersen B. The production of multi-transgenic pigs: update and perspectives for xenotransplantation. Transgenic Research. 2016;25(3):361-74. DOI: 10.1007/s11248-016-9934-8
27. Kohno H, Suenami S, Takeuchi H, Sasaki T, Kubo T. Production of Knockout Mutants by CRISPR/Cas9 in the European Honeybee, Apis mellifera L. Zoological science. 2016;33(5):505-12. DOI: 10.2108/zs160043
28. Yang Luhan, Güell M, Niu Dong, George H, Lesha E, Grishin D, et al. Genome-wide inactivation of porcine endogenous retroviruses (PERVs). Science. 2015;350(6264):1101-4. DOI: 10.1126/science.aadll91
29. Yang H, Wang H, Shivalila CS, Cheng AW, Shi L, Jaenisch R. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/ Cas-mediated genome engineering. Cell. 2013;154(6):1370-9. DOI: 10.1016/j.cell.2013.08.022
30. Goodman MA, Moradi Manesh D, Malik P, Rothenberg ME. CRISPR/Cas9 in allergic and immunologic diseases. Expert review of clinical immunology. 2016;13(1):5-9. DOI: 10.1080/174666X.2017.1241711
31. Borges TJ, Murakami N, Riella LV. Current status of alloimmunity. Current opinion in nephrology and hypertension. 2016;25(6):556-62. DOI: 10.1097/MNH.0000000000000267
32. Yin Hao, Xue Wen, Chen Sidi, Bogorad RL, Benedetti E, Grompe M, et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. 2014;32(6):551-3. DOI: 10.1038/nbt.2884
33. Yang Y, Zhang X, Yi L, Hou Z, Chen J, Kou X, et al. Naive induced pluripotent stem cells generated from ß-thalassemia fibroblasts allow efficient gene correction with CRISPR/Cas9. Stem cells translational medicine. 2016;5(1):8-19. DOI: 10.5966/sctm.2015-0157
34. Schwank G, Koo Bon-Kyoung, Sasselli V, Dekkers JF, Heo I, Demircan T, et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 2013;13(6):653-8. DOI: 10.1016/j.stem.2013.11.002
35. Jakociunas T, Jensen MK, Keasling JD. CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories. Metabolic Engineering. 2016;34:44-59. DOI: 10.1016/j.ymben.2015.12.003
CRISPR/CAS - АДАПТИВНА 1МУННА СИСТЕМА У БАКТЕР1Й ТА ПЕРСПЕКТИВИ Tí ЗАСТОСУВАННЯ У РЕДАГУ-ВАНН1 ГЕНОМ1В
Сорока Д. С., Соколова I. €., Гаврилюк В. Г., Скляр Т. В.
Резюме. У даному or^Ai лп"ератури розглянут структурно-функцюнальш особливост та мехажзм дм сис-теми CRISPR/Cas системи у бактерш, яка визнана системою адаптивного ÍMyHÍTeTy бактерш проти швазм Bipy-
ав та iнших генетичних елеменлв. CRISPR/Cas9 складаеться з певного фрагменту ДНК, де повтори чергуються зi спейсерами, в якостi яких виступають ДНК рiзних вiрусiв та плазмщ. З CRISPR-блоком зв'язанi oas-гени. Вони кодують серiю Cas-бiлкiв (в тому чи^ Cas9) - полiфункцiональних ферментiв з декiлькома активностями (нуклеазною, хелтазною, полiмеразною та iн.), що здатш руйнувати чужорiднi ДНК. Природний Cas9 може застосовуватись i в штучних системах, але вимагае участ РНK-гiда, який знаходить чужорiдну ДНК-мшень завдяки комплiментарностi та наuiлюе на неТ Cas9. Останнiй спричиняе деградащю ДНK-мiшенi. Показана можливiсть застосування CRISPR/Cas системи в геннiй шженерп для отримання геномодифтованих рослин рису, соТ, пшениui, кукурудзи, томатiв, цитрусових. Описан спроби застосування CRISPR/Cas для редагування геномiв при генетичних, онкологiчних, серцево-судинних, iнфекuiйних хворобах.
Ключовi слова: CRISPR/Cas9, редагування геномiв, iмунiтет бактерiй проти вiрусiв, РНK-гiд, Cas-гени, Cas9.
CRISPR/CAS - АДАПТИВНАЯ ИММУННАЯ СИСТЕМА У БАКТЕРИЙ И ПЕРСПЕКТИВЫ ЕЁ ПРИМЕНЕНИЯ В РЕДАКТИРОВАНИИ ГЕНОМА
Сорока Д. С., Соколова И. Е., Гаврилюк В. Г., Скляр Т. В.
Резюме. В данном обзоре литературы рассмотрены структурно-функциональные особенности и механизм действия системы CRISPR/Cas у бактерий, которая признана системой адаптивного иммунитета бактерий против инвазии вирусов и других генетических элементов. CRISPR/Cas состоит из определенного фрагмента ДНК, где повторы чередуются со спейсерами, в качестве которых выступают ДНК различных вирусов и плазмид. С CRISPR-блоком связаны CAS-гены. Они кодируют серию Cas-белков (в том числе Cas9) - полифункциональных ферментов с несколькими активностями (нуклеазной, хеликазной, полимеразной и др.), которые способны разрушать чужеродные ДНК. Природный Cas9 может применяться и в искусственных системах, но требует участия РНК-гида, который находит чужеродную ДНК-мишень благодаря комплементарности и нацеливает на нее Cas9. Последний приводит к деградации ДНК-мишени. Показана возможность применения CRISPR/Cas9-технологии в генной инженерии для получения геномодифицированных растений риса, сои, пшеницы, кукурузы, томатов, цитрусовых. Описаны попытки применения CRISPR/Cas для редактирования геномов при генетических, онкологических, сердечно-сосудистых, инфекционных заболеваниях.
Ключевые слова: CRISPR/Cas9, редактирование геномов, иммунитет бактерий против вирусов, РНК-гид, Cas-гены, Cas9.
CRISPR/CAS - ADAPTIVE IMMUNE SYSTEM IN THE BATTERIES AND THE PENOMENES OF ITS APPLICATION IN THE EDITING OF GENES
Soroka D. S., Sokolova I. Y., Gavrilyuk V. G., Sklyar T. V.
Abstract. Today CRISPR / Cas9 technology is considered a significant breakthrough in biology, since it allows high-precision, cost-effective and quick editing, knock-out and cutting of genes and even genes. For the first time, the CRISPR locus, which is a repeat genetic element separated by variable spacers, was invented in the E. coli genome in 1987 by a group of Japanese scientists led by Yoshizuki Isino at the University of Osaka (Journal of bacteriology, 1989). In 1993, the same genetic elements were discovered by the Spanish researcher F. Mojica in the genome of the Archaea Haloferax mediterranei and named their DNA Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats. Until 2000, Mojica found their presence in 20 microorganisms, including Yersiniapestis. It has been found that the CRISPR locus is part of an unknown mechanism that aims to protect against foreign DNA and is an expression of the adaptive immunity of microorganisms against viruses.
Typical CRISPR locus consist of several direct replays separated by spacers - regions of variable DNA sequences. The CRISPR repeat contains 23-47 pairs of bases, and the spacer is 21-72 pairs. The number of "repeat / spacer" groups can reach 375, but often less than 50. The bacteria usually contain several CRISPR loci. Each locus provides protection against a particular virus. In the archaea, Methanocaldococcus jannaschii identified 18 loci (1% genome). CRISPRs are in the chromosome or in the plasmid DNA.
In 2002, the operon with cas-genes in CRISPR locus were also discovered. They encode the synthesis of Cas-proteins - enzymes involved in the splitting of foreign DNA of viruses. Each Cas-protein carries several domains: typical nucleases, helicase, polymerases, DNA-binding proteins. This Cas-proteins are polyfunctional and capable of performing all of these enzymes.
The Cas9 protein isolated from Streptococcus pyogenes cells consists of 5 domains (REC I, REC II, HNH, RuvC, RAM) and the additional Bridge Helix. Rec I is responsible for binding RNA Guide, REC II has not yet been sufficiently studied; Bridge Helix initiates DNA splitting when bound to a target DNA. The PAM-interacting domain provides the specificity of PAM and is responsible for binding to a specific DNA target. HNH and RuvC are endonucleases domains that cut the DNA.
An important role in the recognition of foreign DNA by the CRISPR system is played by the RNA Guide. It, due to complementarity with the Target DNA, forms a duplex, which is recognized by the Cas9 protein and cleaved by its endonuclease activity. Cas9 allows the cleavage of any nucleotide sequence. The selectivity of Cas9 is a consequence of the complementarity of the RNA guide and DNA target.
The mechanism for the formation of adaptive immunity under the action of CRISPR/Cas-system in invasion of viral or plasmid DNA into S. aureus cell involves two main stages - A and B. At stage A (Immunization) Cas2 is activated and splits the foreign DNA. A new spacer is created - a fragment of viral DNA inserted in the CRISPR cassette. When a virus hits the bacterium again (stage B - Immunity), transcription is carried out on the matrix of CRISPR cassettes with formation of mRNA, which carries information about all cassette spacers. As a result of processing under action of Cas2 mRNA is hydrolyzed with formation of individual RNA molecules, among which there is already a RNA-guide
to detect the virus that penetrated the cell. With help of a specific RNA guide, Casl targets the viral DNA, cause it degradation. The CRISPR/Cas not only provides adaptive immunity against alien genetic elements, but also acts as a limiter for the horizontal transfer of viruses, plasmids, transposons between different bacterial cells.
CRISPR/Cas methods are used in genetic engineering of eukaryotes and prokaryotes. Thus a new variety of rice was obtained, whose sprouts look like dwarf albinos. The possibilities of introducing CRISPR/Cas systems into cultivated plants for the creation of antiviral immunity are explored. Also, the attempts to edit genomes of pigs, cattle, monkeys, mice, bees. The results of the experiment, in which 62 endogenous retroviruses were inactivated with the help of CRISPR/Cas technology in the pig genome, were published. Thanks to these results, in the future, xenotransplantation of organs from pig to person will be possible.
Methods based on CRISPR/Cas9 can also be used in medicine for treatment of various diseases: viral, immune, oncological, cardiovascular, hereditary, including Down's syndrome, sickle cell anemia, pigment retinitis, p-thalassemia and others. In 2013 there was a publication about editing an abnormal gene in stem cells of a patient with cystic fibrosis. In 2015, Chinese scientists led by Junjiu Huang have used CRISPR technology to modify human embryonic genes. The ability to edit the genome also causes various ethical issues that need to be carefully considered.
Key words: CRISPR/Cas9, edition of genome, immunity of bacteria against viruses, RNA guide, Cas-genes, Cas9.
Рецензент - проф. БЛаш С. М.
Стаття наджшла 17.03.2019 року
DOI 10.29254/2077-4214-2019-1-2-149-51-55 УДК 614.2.364
1Шевчук В. I., 1Яворовенко О. Б.,1 Беляева Н. М., 1Куриленко I. В.,2Андросова Н. С.
ОРГАН1ЗАЦ1Я МЕДИЧНОТ РЕАБ1ЛПАЦИ В ПРОВ1ДНИХ КРАНАХ СВ1ТУ 1Науково-досл1дний шститут реабкттацп oci6 з швалщшстю Вшницького нацюнального медичного ушверситету iM. М. I. Пирогова (м. Вшниця) 2Центр медико-сощальноТ експертизи ВшницькоТ обласп (м. Вшниця)
reab@ukr.net
Зв'язок публшаци з плановими науково-до-слщними роботами. Стаття е фрагментом науково-дослщноТ роботи «Удосконалити оргашзацшш та методичн аспекти медико-соцГальноТ реабтГтацп ш-вал^в з патолопею внутршшх оргашв», державний реестрацшний номер 0113U000672.
Вступ. В останн десятилггтя у багатьох краТнах свп"у розвиваеться система медичноТ реабЫтаци, спрямована на вщновлення здоров'я, лшвщащю або зменшення обмежень життедГяльносп (спшкування, навчання, пересування, участi у трудовш дГяльнос-тi та iн.) i максимальну iнтеграцiю або реiнтеграцiю громадян у сусшльство.
За визначенням ВООЗ [1], реабтп"а^я - це ком-бiноване та координоване застосування соцГаль-них, медичних, педагогiчних i професшних заходiв з метою пiдготовки та переподготовки iндивiдуума для досягнення оптимально! його працездатностг
Метою дослiдження було вивчення досвщу ор-гашзаци медичноТ реабштаци хворих в провiдних краТнах свiту.
Об'ект i методи дослщження. Проведено аналiз лiтературних джерел по досвiду оргашзаци медичноТ реабЫтацп в Австри, Бельги, ВеликоТ Британи, 1зраТ-лi, Нiдерландах, Франци, 1ндй", Ымеччиш, Польщi, РФ, США, Фшлянди, Чехи та Словаччиш, Швеци, Япони. Використаш методи: монографiчний, структурно-ло-пчний аналГз.
Результати дослiдження та Тх обговорення. Кожна краТна в оргашзаци медико-соцГальноТ реаби лгацп орiентуеться, перш за все, на своТ нацiональнi особливосл. Слщ зазначити декiлька загальних осо-бливостей, притаманних оргашзаци медичноТ реаби лгацп за кордоном:
Формами, ям розповсюдженi в провщних краТнах свп"у, е [2,3,4,5]:
• стацiонарнi установи: клЫки реабЫтацп (розта-шованi здебтьшого в курортних зонах); реабтГтацш-ш центри: спецiалiзованi та комплекснi (переважно за мкцем проживання); центри реаб^таци на базi стацiонарних реабiлiтацiйних установ (у великих мк-тах); стацюнарш реабiлiтацiйнi вiддiлення; вщдшен-ня великих лтарень;
• амбулаторнi установи: денш клшюи, лiкарнi i профшактори для хворих з хрошчними захворюван-нями i iнвалiдiв, що не потребують безперервного добового нагляду; реабшггацмш консультаций центри реабЫтацп на базi полтлшГчних реабiлiтацiйних установ (у великих мГстах); амбулаторнi реабтГтацш-ш вщдтення (в деяких краТнах саме Тм надаеться перевага); санаторно-курортнi оргашзаци; шститути та кафедри реабЫтацп - розвивають i пропагують щеТ реабЫтацп;
• шшГ форми оргашзаци реабтГтацшного проце-су: «станци виновного лтування» при полешках або лтарнях; реабшггацмш групи, як техшчно ви-ршують питання реабтГтацп; спещальш бригади (лтар, шструктор ЛФК тощо) забезпечеш транспортом для реабЫтаци в домашшх умовах (в населених пунктах з певною кшьмстю населення); реабтГтацш-ний сектор максимально наближений до життевого середовища пащетчв.
СпецГалГзацГя центрГв - проводиться в залежност вщ етапу реабЫтацп. 1снують реабшгацшш центри 2-х рГвшв [6,7]:
• центр I етапу - представляе практично реабЫта-цшну клЫку, куди госшталГзуються хвор! в пщгостро-му сташ, i де переважае, в основному, медична реа-бшггащя. Проте водночас тут наявш майстерш, зали для навчання робот! на комп'ютерах, кухш, де хвор! отримують елементи сощально-побутовоТ i профе-сшноТ реабЫтацп;
