CC BY
1368
СМБРК/СаБЭ - система редактирования геномов.
Прорыв в медицине биологии и генной терапии?
Резюме. В статье приведена информация о новой генно-инженерной технологии, уже нашедшей применение в генной терапии наследственных заболеваний человека. Система CRISPR/Cas9, или, как ее еще называют, криспер-система, открывает широкие перспективы использования в области лечения наследственных и приобретенных социально значимых болезней. Несомненно, это один из самых выдающихся прорывов в области современной биологической науки, значимость которого нам предстоит осознать в самые ближайшие годы.
Ключевые слова: редактирование генома, система CRISPR-Cas9, стволовые клетки.
Игорь Волотовский,
завлабораторией молекулярной биологии клетки Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, академик
Анна Полешко,
научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии клетки Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси,
кандидат биологических наук
являемся свидетелями и участниками бурного развития биологической науки. Давно прошли времена, когда биолог мог только наблюдать за объектом и описывать его свойства. В конце прошлого столетия и в наши дни биология изменилась качественно, и в первую очередь благодаря развитию таких наук, как биохимия, биофизика, молекулярная биология
и молекулярная генетика, заложивших основы понимания тонких механизмов функционирования клетки в целом и отдельных ее компонентов. Стало очевидным, что центральное место в клетке занимает генетический аппарат, под контролем которого находятся строение и функции абсолютно всех внутриклеточных молекулярных и надмолекулярных систем. Кажущийся стабильным геном клетки оказался лабильным, подверженным влиянию регу-ляторных эндогенных и экзогенных факторов. Именно поэтому механизмы контроля и регуляции экспрессии отдельных генов стали предметом изучения для многих исследователей. Позднее открылась заманчивая перспектива направленного воздействия на струк туру и функционирование генетического аппарата, в частности редактирования геномов - удаления или введения отдельных, даже чужеродных для данного организма, генов. В результате возникло принципиально новое
Рис. 1. Принципиальное строение С^Р^локуса в геноме бактерий
г» Рис. 2.
СХ Динамика 1200
числа научных
публикаций,
К посвященных 900
редактированию
- геномов
Я1 с использованием 600
< оа О различных
X X генно-инженерных
«С подходов 300
Источник:
по данным поисковой
системы PubMed: 0
60 www.ncbi.nim.nih.gov
Лидерная последовательность
Спейсеры
СаБ-гены
медико-биологическое направление науки -генная терапия заболеваний.
По оценкам ВОЗ, более 10 тыс. заболеваний человека имеют генетическую природу и являются моногенными. Несмотря на редкую встречаемость генетически опосредованных болезней (1-2%), суммарная заболеваемость ими при рождении может составлять в человеческой популяции более сотни тысяч новых случаев ежегодно. А это уже заметное явление, и не учитывать его нельзя. Более того, даже многие «обычные» болезни, после перенесения которых мы выздоравливаем, характеризуются генетической предрасположенностью. Однако исторически сложилось так, что генная терапия сориентировалась на разработку подходов для лечения серьезных наследственных патологий человека, влияющих на трудоспособность, качество и продолжительность жизни пациентов, а также таких социально значимых приобретенных заболеваний, как, например, СПИД.
Первым исследованием, показавшим возможность активного внедрения в генетический аппарат эукариот, стали работы 1987 г., проведенные американским ученым Брайаном Сауэром по Сге-Ьох-опосредованной рекомбинации, в ходе которой удалось разрезать целевые участки ДНК с помощью Сге-реком-биназы. Позднее эта технология была исполь-
////
Палиндромные повторы
зована для сайт-специфической рекомбинации ДНК у мышей [1]. Уже в наши дни были предприняты попытки применить для элиминации мутированных нуклеотидных последовательностей в генах феномен экзон-скиппинга, заключающийся в связывании после транскрипции гена определенных участков целевой пре-мРНК экзогенными (добавляемыми извне) антисмысловыми олигонуклеотидами, малыми синтетическими молекулами РНК, что позволяло исключать из процесса сплайсинга (созревания пре-мРНК, элиминации из нее интронов) конкретные фрагменты, например экзоны с нонсенс-мутациями [2]. К сожалению, в силу различных технических ограничений метод экзон-скиппинга широкого распространения не получил.
Проблема редактирования геномов нашла решение в рамках трех других молекулярно-биологических технологий с использованием нуклеаз с доменом класса «цинковые пальцы» - [3], эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции,-ТЛЬЕМ [4] и системы СШ8РК/Саз9 [5]. -широко применяемые генно-инженерные ферменты. В структуре этих белков два полипептидных домена: ДНК-связывающий (чаще всего Су82-Ы1з2) и БоЫ-домен, типичный для рестрикционных нуклеаз и обеспечивающий
СШБРК-СаБЭ
2РМ | ТАЬЕ№ |
Сге-Ьох
1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998
2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016
разрезание цепочки дезоксирибонуклеиновой кислоты. ДНК-связывающий домен в ферментах TALEN (выделены из фитопатогенных бактерий Xanthomonas) содержит консервативные последовательности из 33-35 аминокислотных остатков, каждый из которых узнает специфические нуклеотидные чередования. При их «компоновке» формируются участки, адресованные к ДНК-специфическим мишеням.
Мы же остановимся на системе CRISPR/ Cas9, в частности на том, как она устроена и работает.
Считалось, что бактерии и археи не имеют, как животные и человек, иммунной защиты. В нашем организме за иммунитет отвечает множество клеток, организованных в чрезвычайно сложную молекулярную структуру. Однако, как выяснилось, и у бактерий есть своя, но гораздо более простая система молекулярного иммунитета, обеспечивающая защиту бактериальной клетки от внешних врагов, фагов и других патогенов. Еще в 1989 г. японские исследователи обнаружили в геноме кишечной палочки участок, содержащий многочисленные повторы. Его назвали CRISPR-локусом, с англ. «clustered regularly interspaced short palindromic repeats» - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (рис. 1). Их структура была идентична по нуклео-тидным последовательностям, а вот у промежутков, или, как их теперь называют, спейсеров (от англ. «spacer» - разделитель, вставка), она оказалась вариабельной и часто была гомологичной последовательностям, обнаруженным в геномах фагов и плазмид. По сути, такой участок - это генетическая память популяции о столкновениях с внешним врагом, в борьбе с которым бактериальной клетке удалось выжить. Другими словами, в этих промежутках (спейсерах) закладывается впрок на хранение информация о бактериофагах, она используется бактериями в уникальной системе защиты от губительного воздействия патогенов. В состав адаптивного молекулярного иммунитета входят палиндромные повторы, спейсеры и гены специализированных нуклеаз Cas (от англ. «CRISPR-associated protein» - CRISPR-ассоциированный белок), в том числе и Cas9.
Возникает вопрос: почему нуклеаза помечена цифрой 9? Действительно, их в бактериальной клетке больше десяти, но наиболее подходящей для функционирования криспер-системы оказалась Cas9. Сама ее макромолекула содержит два критических домена - RuvC
Введенная в бактериальную клетку ДНК фага
Расщепление ДНК
Встраивание в геном бактерии нового спейсера
MMMMI
пре-аРНК
MMMIII
Транскрипция CRISPR-локуса
Процессинг пре-аРНК
аРНК
III III III III
Введенная ДНК
и ИМИ, каждый вносит разрыв только в одну цепочку ДНК. Если в бактериальную клетку проникает фаг, от которого в ее геноме остался след, судьба последнего предрешена: высока вероятность его гибели. Данная система обнаружена в геномах 40% секвенированных бактерий и 95% - архей.
В 2012 г. появились первые публикации, описавшие применение технологии CRISPR/ Саз9 для редактирования геномов животных и человека, и в научном обиходе для его обозначения стали использовать термин «криспер-система». С тех пор число статей по этой теме стало расти лавинообразно (рис. 2). Как оказалось, компоненты криспер-системы можно адаптировать к другим геномам, ввести в эука-риотические клетки, и там она будет работать по «навязанной» ей программе. При этом с высокой точностью отыщется любая нуклеотидная последовательность. Например, в геноме человека насчитывается 3,2 млрд пар нуклеотидов, и вот на этой протяженности возможно разрезать двуспиральную нить ДНК в конкретном месте, удалить или подправить
Cas-белки
Поиск целевой нуклеотидной последовательности и разрезание ДНК
Рис. 3.
Интеграция нового спейсера в геном бактерии и его дальнейшее использование в работе
защитной системы
бактериальной
клетки
Рис. 4.
Схема контролируемого комплексом С1№РИ/СаБ9 целевого разрезания ДНК бактерии
Источник: по данным [4, 5]
Тонкое строение гена белка Cas9
Кассета генов Cas белков
-[| ВиуС
I Н* I
Транскрипция и трансляция гена Cas9
\
CRISPR-локус
■ 'S| 55 S3 J JsM 5tî Т
Транскрипция и биогенез crPHK
Cas9
+ ♦ 1
Sî S4 S12
» SI!
/ ^ Расщепление
введенной ДНК
«испорченный» ген или вставить вместо него другой - «вылеченный».
Как же устроена система СМ8РБ./Са89? В каждом определенном локусе все палин-дромные повторы одинаковы по строению и включают от 24 до 35 пар нуклеотидов. Длина спейсеров составляет 21-72 их пары, они различаются по последовательностям нуклеотидов. К СМБРЯ-локусу примыкают лидерная нуклео-тидная последовательность и гены, кодирующие Саз-нуклеазы (рис. 3).
Лидерная последовательность выполняет роль промотора, запускающего транскрипцию СМБРЯ-локуса, в ходе которой образуется длинная РЫК, получившая название пре-сгРНК (СМ8РБ.-РНК), а после ее разрезания на фрагменты с помощью Саз9-нуклеаз - просто сгРНК. При этом в каждом из участков содержатся часть повтора и спейсер. Разрезание двойной нити ДНК осуществляется Саз9-нуклеазой под контролем сгРНК и ^асгРНК (еще одна небольшая РНК, роль которой сводится к поддержанию белка Саз9 в активной форме и сохранению, тем самым, каталитической
ности комплекса CRISPR-Cas9).
Комплекс сгРНК - tracrPHK - Cas9 и есть основное оружие защитной «иммунной» системы бактерий. Для двуцепочечного разрыва ДНК достаточно активности одного фермента Cas9 и комплекса, состоящего из двух фрагментов РНК: сгРНК и tracrPHK.
Благодаря спейсерным участкам в ДНК бактериофага фиксируются комплементарные им нуклеотидные последовательности сгРНК, после чего активированные Cas9-нуклеазы их расщепляют. По сути, сгРНК и ^скРНК выполняют роль прецизионного путеводителя для Cas9 в «море» нуклеотидных последовательностей ДНК фага, после деградации которой ее фрагмент вставляется в качестве спейсера в CRISPR-систему бактерии, то есть криспер-кассета удлиняется, пополняя бактериальный банк информации. Для успешного действия системы важную роль играет такой генетический компонент, как РАМ (от англ. «protospacer adjacent motif») - короткая, состоящая в среднем из 3 нуклеотидов последовательность, которой фланкирован протоспейсер
(сайт мишени). Он специфичен для конкретного вида бактерий. Только при наличии PAM комплекс сгРНК - tracrPHK - Cas9 распознает мишень и «разрезает» ДНК (рис. 4).
Во взаимоотношениях бактериальной клетки и фага обнаруживается еще одно интересное обстоятельство. В случае инфицирования только 3% выживших бактерий удлиняют свою криспер-кассету на один спейсер. Если бактерия заражается фагом, в ДНК которого есть участки, частично гомологичные с каким-либо спейсером в бактериальной кассете, то ее пополнение идет более эффективно: от 50 до 90% уцелевших клеток популяции пополняют свою кассету, при этом выживаемость бактерий заметно увеличивается.
В 2012 г. американский ученый Мартин Джинек с коллегами сумели объединить сгРНК и tracrPHK в единую молекулу - sgPHK (с англ. «single guide», теперь ее принято называть РНК-гидом или химерной направляющей РНК), они же предложили вектор для ее клонирования [6]. Сродство РНК-гида к нуклеазе Cas9 и его способность направлять фермент к ДНК-мишени оказались такими же высокими, как и у естественных сгРНК и ^сгРНК. На практике комплекс «РНК-гид + Cas9 + вектор» подвергают молекулярному клонированию в E.coli, выделяют из бактерии и транс-фецируют его в клетку, то есть вводят его внутрь клетки, в геноме которой содержатся подлежащие редактированию гены.
Данный модифицированный генно-инженерный подход, разработанный в 2013 г., показал высокую эффективность при редактировании геномов микроорганизмов, животных и человека. И он обладает существенными преимуществами при сравнении с ZFN- и TALEN-технологиями. Главным из них является то, что за определение нуклеотидной последовательности - мишени в криспер-системе - отвечает небольшой участок РНК-гида, комплементарный 20 нуклеиновым основаниям ДНК-мишени, в то время как нуклеазы ZFN и TALEN узнают отдельные нуклеотиды с помощью доменов, представленных в их макромолекулах. Кроме того, ZNF и TALEN функционируют как гетеродимеры и разрезают двунитевую цепочку ДНК только в паре, а Cas9 разрезает сразу или две цепочки ДНК-мишени, или только одну из них. Одиночный разрез осуществляет Cas9, у которой активность одного из критических доменов - RuvC или HNH -подавлена. В этом случае фермент называют
Двухцепочечный разрез геномной ДНК, опосредованный системой CRISPR-Cas9
Негомологичное соединение концов ДНК
Гомологичная рекомбинация
Фрагмент
донорной ДНК +
Малая делеция
Малая инсерция
Исправление или добавление гена
Саз9-никазой. В 2015 г. появилась публикация, описывающая криспер-систему, разрезающую двуцепочечную ДНК с образованием не тупых, а липких концов по краям разрыва, благодаря чему облегчается редактирование геномов с использованием механизмов репарации.
Как же после элиминации дефекта в гене или всего дефектного гена можно восстановить нуклеотидную последовательность участка ДНК уже в правильном, необходимом ученому виде? Здесь может быть несколько вариантов. В случае однонитевого разрыва ДНК (а он при определенных условиях может быть реализован с помощью Саз9-никазы) застройка образовавшейся бреши осуществляется ферментативной системой предрепликативной репарации по принципу комплементарности с использованием в качестве матрицы второй правильной нетронутой цепочки ДНК. В случае же разреза и элиминации двухцепочечного сегмента ДНК для застройки участка генома необходим донорский (искусственно синтезированный) фрагмент ДНК, последовательность которого идентична последовательности интакт-ного гена. Необходимый гомолог участка ДНК вводят в клетку, после чего застройка осуществляется по механизму функционирующей в клетке гомологичной рекомбинации, или HDR (с англ. «homology-directed repair»). Неповрежденный гомолог служит матрицей для восстановления исходной структуры ДНК. Обычно гомологичная рекомбинация в клетке протекает довольно редко. Однако метод CRISPR/Cas9 позволяет увеличить вероятность реализации
Рис. 5.
Разрез геномной ДНК на уровне дефектного гена и восстановление отредактированного участка ДНК
Источник: по данным [10]
гомологичной рекомбинации на несколько порядков. Вместе с тем в клетках существует другая система репараций повреждения ДНК, получившая название негомологичного соединения концов NHEJ («non-homologous end-joining»), когда целостность ДНК восстанавливается без достраивания, по причине отсутствия матрицы (рис. 5).
Однако система редактирования CRISPR/ Cas9 в настоящий момент несовершенна, так как в результате ее работы по ряду причин существует вероятность неправильного связывания sgPHK и возникновения так называемых нецелевых эффектов, в результате чего появляются случайные разрезы ДНК и, как следствие, инсерции и делеции, то есть дополнительные ошибки. Как минимизировать последние и повысить вероятность гомологичной рекомбинации - задачи, которые пытаются решить во многих лабораториях. [7].
Прогресс биологической науки открыл совершенно неожиданные перспективы использования криспер-системы для решения проблемы наследственных заболеваний. При изучении той или иной болезни обычно сталкиваются с одной непреодолимой трудностью, связанной с моделированием патологии. Как оказалось, многочисленные экспериментальные модели заболеваний на животных не воспроизводят всего комплекса генетических и фено-типических особенностей заболевания у людей. Можно думать, что метод CRISPR будет весьма полезен при моделировании наследственных болезней, и в первую очередь редких для человеческой популяции. Модели полигенных заболеваний, созданные с помощью криспер-системы, дают возможность определить, нокаут каких генов приводит к тем или иным феноти-пическим изменениям в клетках, как из клеток формируются разнообразные ткани с различным генетическим фоном и какие молекулярные события происходят при развитии патологического процесса. На основании подобного рода данных формируются программы создания целых органов.
Другая задача, решаемая посредством CRISPR/Cas9,- разработка метода лечения вирусных инфекций, например вируса иммунодефицита человека HIV-1, после которого клетки становятся невосприимчивыми к HIV-1 [8], а также коррекция мутаций, обусловливающих различные наследственные заболевания: муко-висцидоз, миодистрофию Дюшена, гемофилию, серповидноклеточную анемию и др. [9].
Для коррекции мутаций (причин болезней) стали использоваться индуцированные плюри-потентные стволовые клетки человека, которые могут быть получены из любой соматической клетки пациента с наследственным заболеванием. После индукции плюрипотентности эти клетки можно редактировать (исправлять мутации) и/или дифференцировать в различных направлениях, то есть превратить в любую клетку нашего организма. Иными словами, в нашем распоряжении универсальная модельная система для анализа патогенеза заболеваний, помогающая исправить генетические дефекты в модели in vitro и использовать эту информацию при разработке методов лечения.
Главное преимущество описанного подхода в том, что он позволяет исключить вклад генетического полиморфизма в результаты благодаря получению изогенных клеточных моделей. Криспер-система открыла широкие перспективы повышения эффективности генной терапии наследственных и приобретенных социально значимых заболеваний человека. Технология редактирования CRISPR/Cas9 -существенный прорыв в биологической науке, развивающейся в тесном сопряжении с медициной, значимость которого нам еще предстоит осознать. Ответ на вопрос, поставленный в заглавии статьи, должен быть однозначный -«да!». Началась массированная атака на наследственные заболевания, и можно не сомневаться, что в ближайшие годы мы станем свидетелями ее позитивных результатов. СИ
http://innosfera.by/2017/12/CRISPR
ЛИТЕРАТУРА
1. Orban P.C., Chili D., Marth J.D. Tissue- and site-specific DNA recombination in transgenic mice // PNAS USA. 1992. V. 88, N 15. P. 6861-6865.
2. Aartsma-Rus A., Fokkerma I., Verschuuren J., GinjaarI. et al. Theoretic applicability of antisense-mediated exon skipping for Duchenne muscular dsptrophy // Hum. Mutat. 2009. V. 30, N 3. P. 293-299.
3. Beerli R.R., Segal D.J., Dreier B., Barbas C.F. 3rd. Toward controlling gene expression at will: specific regulation of the erb-2/HER-2 promoter by using polydactyl zink finger proteins constructed from modular building bloks // PNAS USA. 1998. V. 95, N 25. P. 14628-14633.
4. Moscou M.J., Boganove A.J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors // Science. 2009. V. 326, N 5959. P. 1509-1512.
5. Mali P., Yang L., Esvet K.M., Aach J. et al. RNA-guided human genome engineering vie Cas9 // Science. 2013, V. 339, N 621. P. 823-826.
6. Jinek M., Chyilinski K., Fonfara I., Hauer M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. 2012. V. 337, N 6096. P. 816-821.
7. Ma H., Marti-Gutierrez N., Park S.- W. et al. Correction of pathogenic gene mutation in human embryos // Nature. 2017. V. 548, N 7668. P. 413-419.
8. Ebina H., Misawa N., Kenemura Y., Koyanagi Y. Harnessing the CRISPR/Cas9 system to disrupt latent HIV-1 provirus // Sci. Rep. 2013, N 3. P. 2510.
9. Валетдинова К.Р. Применение системы CRISPR/Cas9 для создания и исследования клеточных моделей наследственных заболеваний человека // Гены & клетки. 2016. Т. 11, №2. С. 10-20.
10. Cong L., Ran F.A., Cox D., Lin S. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas9 systems // Science. 2013. V. 339, N 6121. P. 819-823.
