Cканирующая зондовая микроскопия как метод определения свойств механоактивированных биологических материалов и реакции на них тканевых структур глаза

Карбань Оксана Владиславовна; Васильев Юрий Геннадьевич; Жаров Виктор Владимирович; Перевозчиков Петр Арсентьевич; Леесмент Станислав Игоревич; Тимофеев Сергей Владимирович

УДК 576.3.314 579.23.234

О.В. Карбань, ЮТ. Васильев, В.В. Жаров, ПА. Перевозчиков, С.И. Леесмент,

..

C

ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВОЙСТВ МЕХАНОАКТИВИРОВАННЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ И РЕАКЦИИ НА НИХ ТКАНЕВЫХ

СТРУКТУР ГЛАЗА

Методом сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) изучены изменения тканей передней поверхности стенки глаза при введении наноразмерного механоактивированного

.

объективной оценки основных составляющих биополимерных клеточных и неклеточных соединений с помощью спектрального анализа срезов биологических объектов. Показано, что использование наноструктурированной плаценты ускоряет проникновение трансплантанта в склеру реципиента и инициирует образование новых соединительно-тканных структур. Выявлены различия в структуре зрелых и новообразованных коллагеновых волокон. Полученные данные указывают на возможную перспективу применения биоконтейнера с наностуктурированной плацентой человека в лечении прогрессирующей близорукости,

, , -

.

СЗМ; наноразмерный биологический материал; ткани глаза.

O.V. Karban’, Y.G. Vasil’ev, V.V. Zharov, P.A. Perevozhikov, S.I. Leesment,

S.V. Timofeev

USAGE OF SCANNING PROBE MICROSCOPY FOR INVESTIGATION

OF MECHANOACTIVATED BIOLOGICAL MATERIALS PROPERTIES AND THEIR IMPACT ON TISSUE EYE STRUCTURE

Changing the fibrous capsula of the eyeball treated by injection of nanosizemechanoacti-vated biological substance was investigated with usage of Scanning Probe Microscopy (SPM). It was shown that usage of this method together with spectral analysis of cuts provides the way for impartial assessment of main components of cellular and non-cellular biopolymer. The using nanostructured human placenta was showed to accelerate penetration of the graft in recipient sclera and give rise to the forming novel conjunctive tissue. The novel collagen fibrils showed fibrillar properties that were different from those of the mature fibrils. The results obtained show the potentialities of the use of biocontainers with nanostructured human placenta for the treatment of progressive myopia, retina dystrophy, partial optic-nerve atrophy and some other diseases of the eye. The study performed calls for further investigation in this field.

CPM; nanostructured biomaterial; eye tissue.

Одним из направлений биологических исследований является поиск новых методов, позволяющих получить достоверную информацию о состоянии тканевых структур в контроле и в ходе реактивных проявлений на эндогенные и экзогенные .

микроскопия, выявляющая пространственные и плотностные свойства биологических объектов в условиях относительно простой их предварительной подготовки и .

применения атомно-силовой микроскопии (ACM), лазерной конфокальной микро-, , молекулярной и макромолекулярной организации.

Отличительной особенностью метода ACM, сопоставимого по своей разрешающей способности с электронной микроскопией, является то, что при приме-

нении последней методики пучок электронов взаимодействует собственно не с самим биологическим объектом, а с осажденными на его структурах тяжелыми металлами, что исключает само выяснение упругих свойств биологических объектов и по своей сути является непрямым методом оценки биологических объектов. АСМ является прямой методикой с минимальным изменением биологических свойств биоматериала, связанных с использованием фиксации для предотвращения аутолитических процессов. Преимущества атомно-силовой микроскопии обусловлены также возможностью стереологического исследования биоло-, -стых составляющих межклеточного вещества, плотных глобулярных образований и применяется для оценки структурно-функциональной организации сложных субклеточных образований, степени упорядоченности взаимосвязанных тропоколлагеновых и микрофибриллярных комплексов [1, 2]. Биохимические изменения в биомолекулярных комплексах исследовали некоторые авторы на примере митохондрий и лизосом клеток сердца кролика [3]. Ими была показана высокая чувствительность и информативность метода для оценки мембранных клеточных образований цитоплазмы.

Лазерная конфокальная микроскопия в сочетании с методами комбинационного рассеяния и флуоресцентной микроскопией в биологических исследованиях применялись для оценки отдельных биохимических составляющих тканевых образований различных органов. В частности, проводился анализ возможности интеграции гетерогенных липидных и пептидных фракций в тканевые образования кожи с лонгитудинальным мониторингом этих процессов методом комбинационного рассеяния [4] .

В данной работе показана возможность определения закономерностей организации наноразмерного механоактивированного биологического материала и тканей передней стенки глаза в ходе реакций на его введение методами сканирующей зондовой микроскопии.

Объектом исследования были структуры коньюнктивы, склеры и передних участков сетчатки половозрелых кроликов породы Шиншилла в возрасте от одного года до двух лет с массой тела от 3 до 3,5 кг. Исследования на животных проведено согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Под местной анестезией в верхненаружный квадрант в суб-коньюнкивальную основу глазного яблока кролика внедряли биоконтейнер, изготовленный из отрезка пупочной артерии человека длиной до 10 мм и шириной 2 . -,

высушенного материала в шаровой планетарной мельнице Ри1уепБеие-7. Морфологические исследования тканей глаза животных проводили у контрольных животных без оперативного вмешательства, через 3, 7 суток, 1, 2 и 3 месяца после пересадки. Энуклеированные глаза фиксировали в 10 %-ном растворе нейтраль, . вмешательства помещались на поверхность предметного стекла с последующей химической очисткой от парафина.

Исследование структуры и свойств наноразмерного механоактивированного (МА) биологического материала плаценты перед введением, а также гистологических срезов тканей глаза были проведены с помощью сканирующей зондовой лаборатории Ntegra (ЭТ-МБТ) в прерывисто-контактной методике на воздухе. Порошок измельченной плаценты предварительно крепился на пленку полистирола, полученную испарением этилацетата из раствора полистирола в этилацетате. Пленка наносилась на ситал, с последующим закреплением порошка под ультра.

Спектроскопический флуоресцентный анализ гистологических срезов по точкам был выполнен на сканирующей зондовой лаборатории Ntegra Spectra (NT-MDT). В данном случае прибор использовался для конфокального оптического исследования образца, с возможностью двумерного сканирования отдельных участков в выбранном спектральном диапазоне и анализа спектральной картины в . -ре из области фокуса лазера с участков около 400 нм. Использовались твердотельный лазер с непрерывным источником электромагнитного излучения с длиной волны 473 нм и гелий-неоновый лазер на длине волны 632,8 нм. Распределение химического состава по образцу проводилось выбором отдельных участков спек, - ( )

-,

выбранной области образца. Характерное время накопления сигнала спектральной картины для каждой контрольной точки - 10 с. Размеры структурных фрагментов были оценены из анализа СЗМ-изображений, предварительно обработанных самосогласованным ранговым фильтром высоких частот и фильтром для устранения межстрочных скачков с помощью программы Image Analysis 3 (NT-MDT).

Как видно из рис. 1, МА-материал формирует агломераты до 2-10 мкм. Они, , 200-500 ,

от 40 до 100 нм. Данные агломераты и частицы весьма неустойчивы и их связи, -,

механических воздействиях при сканировании методом ACM распадаются до уровня зерен. Агломераты имеют сложные поверхностные характеристики, формируя объекты с развитой поверхностью.

Рис. 1. АСМ-изображения: а - агрегата частиц механоактивированной плаценты человека; б - профиля сечения вдоль линии

При изучении динамики реакций передней стенки глаза важной составляющей оценки ответов явилось выяснение динамики организации волокнистого компонента межклеточного вещества соединительных тканей склеры и коньюнктивы. В интактной склере распределение коллагеновых волокон носит упорядоченный , , равномерный характер толщины волокон, строго упорядоченное и ясно прослеживаемое положение изотропных и анизотропных дисков, выявляемое по характеру жесткости по ходу коллагеновых волокон и характеру изменения рельефа. При этом , -. -

геновых волокон, определенные из АСМ-изображений с помощью Фурье-анапиза (Image Analysis 3, NT-MDT) спектральных частот соответствуют 69-70 нм, что соответствует аналогичному распределению анизотропных и изотропных дисков, выявляемых при помощи электронной микроскопии [5, 6]. В рыхлой соединительной ткани коньюнктивы волокна имеют сетевидное распределение в объеме межклеточ-, , -. , -

,

нередко формирует войлокообразную структуру диаметром 0,3-0,5 мкм (рис. 2, а). Сохраненные коллагеновые волокна разрыхлены, теряют равномерный характер , -. -ются проявления дезорганизации волокнистого компонента межклеточного вещества исследуемых тканевых структур. Склера характеризуется формированием новообразованной соединительной ткани, которая к концу 1-го месяца отличается меньшей толщиной волокон, меньшей жесткостью и не столь выраженной гетероморф-( . 2, , ). , -од исчерченности составляет 69,7 нм. Однако высота шага между щелью и зоной перекрытия для зрелых фибрилл составляет 28-29 нм, а для новообразованных коллагеновых фибрилл эта величина не постоянна и изменяется в широком диапазоне значений, от 14 до 24 нм.

Рис. 2. АСМ-изображения в методе изображения рельефа: а - 3-й день имплантации; б - 2-й месяц имплантации; в - в методе фазового контраста участка склеры с новообразованными коллагеновыми волокнами в зоне имплантации: 1 - новообразованная ткань, 2 - зрелое коллагеновое волокно

б

а

в

Лазерное конфокальное исследование и спектроскопический флуоресцентный анализ реакции тканевых образований существенно дополняют данные, полу-

- .

после введения биоконтейнера в нескольких контрольных зонах: стекловидного тела и сетчатки глаза и коньюнктивы склеры, располагающихся на равноудаленных расстояниях от биоконтейнера. Все эти участки имеют различные структурные и спектральные характеристики организации при их исследовании в лазерном конфокальном и флуоресцентном режиме. В частности, при рассмотрении содержимого биоконтейнера на конфокальном изображении, выявляются поверхностные характеристики агломератов и обнаруживается глобулярный (р^мером до 2 мкм) характер их организации. Эта характеристика более наглядно выявляется при анализе профиля этого объекта на конфокальном изображении. В то же время на флуоресцентном изображении этот же объект имеет более гомогенный характер организации в силу близких химических характеристик объекта.

При изучении склеры на третьи и седьмые сутки после имплантации наблюдается сохранение ее волокнистого характера организации. Хорошо заметны скопления коллагеновых волокон, более ясно прослеживаемых на флуоресцентном изображении. При изучении этого же участка в оптическом режиме, наряду с волокнами, обнаруживаются глобулярные структуры, более явно видны поверхностные характеристики объекта. Не менее интересны результаты исследования сетчатки глаза (рис. 3,а,б). При исследовании ее организации в спектральном диапазоне достаточно заметна гетероморфность образующих ее элементов в различных слоях. Хорошо различима зона палочек и колбочек, участки наружного и внутреннего ядерных слоев. При изучении слоя палочек и колбочек, наружного и внут-,

, .

этой же зоны в лазерном конфокальном режиме не позволяет значимо повысить информацию о рассматриваемом нативном объекте, позволяя в основном предполагать локализацию наружного и внутреннего ядерных слоев.

Результаты конфокальных исследований дополняются данными спектрально, -центы в близлежащие зоны передних участков стенки глаза. Представленные на рис. 3,в спектры дают представление о распределении интенсивностей для различных участков склеры. Спектры сняты в равноудаленных точках поперек толщины склеры от стенки биоконтейнера к интактной склере. Для спектров, соответствующих точкам 4 и 5 (приближенных к интактной склере), максимум интенсивности флуоресценции отвечает длинам волн, лежащих в интервале 540-550 нм, и соответствует максимуму, наблюдаемому в спектре интактной склеры с небольшим смещением в сторону длинных волн (не более 5 нм). На спектрах точек 1-3 и механоактивированной плаценты наблюдается два максимума: 545-555 и 554 до 570 нм. Ясно выявляется сходство спектров со спектром интактной склеры, с ,

, . , 1-3 -

,

для МА плаценты, и соответственно на этих участках произошло взаимодействие ткани склеры с указанным материалом. Таким образом, на седьмые сутки имплантации наблюдается проникновение наночастиц плаценты в толщу склеры на 2/3 ее толщины.

К концу 3-го месяца усиливается упорядоченность организации волокнистого компонента межклеточного вещества склеры и коньюнктивы в зонах, примыкающих

,

с контрольными животными и указывает на усиление прочностных свойств волокнистой соединительной ткани в зоне имплантации биоконтейнера. При этом структура коллагеновых волокон приближается к таковым у контрольных животных, что указывает на высокую степень их структурно-функциональной зрелости.

б

а

в

Рис. 3. Седьмые сутки после имплантации. Сетчатка глаза: а - конфокальное лазерное изображение; б - флуоресцентное изображение; в - склера.

Флуоресцентные спектры по точкам от стенки биоконтейнера к интактной склере

Динамика изменений в структуре тканевых образований стенки глаза в поздние сроки эксперимента наиболее явно заметна при анализе спектральных характеристик объекта, что позволяет предполагать наибольшую целесообразность применения данного метода для выявления возможного проникновения чужеродных ультрадисперсных объектов в биологические структуры. В частности, при анализе спектральных характеристик склеры через 2 месяца от начала эксперимента уровень концентрации МА биологического материала в полости биоконтейнера , , прилежащих к нему зонах, в то время как на третьи - седьмые сутки его содержание в этих участка было максимальным. В то же время выявлена относительно высокая очаговая концентрация биологического материала на значительном удалении от зоны биоконтейнера в направлении задней стенки глазного яблока, что указывает на возможное направление диффузионных потоков в области глаза [7].

Таким образом, в ходе структурного анализа нативных биологических материалов стенки глаза методом ACM и лазерной конфокальной микроскопии, сочетаемых со спектральным анализом объектов, наиболее демонстративными представляются данные о возможном характере перераспределения инородных включений биологических и иных материалов. Это представляется полезным при изучении диффузионных процессов в биологических объектах. Метод ACM позволяет существенно повысить информативность анализа за счет резкого увеличения раз, , возможности выяснения упругих характеристик и объемно-пространственного распределения исследуемых объектов, на фоне сравнительной простоты изготовления исследуемых материалов.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Bozec L.,Horton M.A. // J. Mater Sci: Mater Med. - 2006. - Vol. 17. - P. 1043-1048.

2. Ludwig T., Kirmse R., Poole K., Schwarrz U.S. // Pflugers Arch- Eur. J. Physiol. - 2008.

- Vol. 456. - P. 29-49.

3. Kaupp G. // Intrnational Journal of Photoenergy. - 2006. - Vol. 2006. - P. 1-22.

4. Xiao C., Moore D.J., Rerek M.E., Flach C.R., Mendelsohn R. // J. Invest. Dermatol. - 2005.

- Vol. 124. - P. 622-632

5. Yamabayashi S., Ohno S., Aquilar R.N. et al. // Ophthalmic Res. -1991. - Vol. 23. - P. 320-329.

6. Meller D., Petrs K., Meller K. // Cell Tissue Res. - 1997. - Vol. 288. - P. 111-118.

7. Nickerswon J.M., Shuler R.K., Davies J.B., Dioguardi P.K. et al. Noninvasive delivery of DNA into the eye in Ophnhalmology:Ocular Angiogenesis:Diseases, Mechanisms and Nherapeutics/edited by J. Tombran and C.J. Barnstable, Totowa: Numana Press Inc. - P. 373-388.

Статью рекомендовал к опубликованию д.т.н., профессор О А. Агеев

Карбань Оксана Владиславовна

Физико-технический институт УрО РАН.

E-mail: [email protected].

426001, . , . , 132.

Тел.: +73412725239'.

Старший научный сотрудник; к.ф.-м.н.

Васильев Юрий Геннадьевич

Ижевская государственная сельскохозяйственная академия.

E-mail: [email protected].

426069, . , . , 11.

Тел.: +73412 591520.