CC BY
51
УДК 617.7:615.36:611.013.85
Жаров В.В.12, Перевозчиков П.А.12, Карбань О.В.3, Самарцева Н.Н.2
1ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Росздрава, г Ижевск 2БУЗ УР «Республиканская офтальмологическая клиническая больница МЗ УР», г Ижевск 3Физико-технический институт Уро РАН, г Ижевск E-mail: [email protected]
ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ НАНОДИСПЕРСНОЙ ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА В ОФТАЛЬМОЛОГИИ
Изучено влияние имплантации нанодисперсной плаценты человека на процессы репара-тивной регенерации в условиях эксперимента на кроликах. Показано, что значительные биологические эффекты происходят не только на границе контакта склера - биоконтейнер, а практически во всей толще склеры в зоне имплантации биоконтейнера с нанодисперсной плацентой человека. При этом происходит укрепление как собственно склеры реципиента в области не менее 2/3 ее толщины, так и формирование плотного соединительно-тканного образования в зоне имплантации на поверхности склеры, что значимо превосходит аналогичные изменения с применением макродисперсного биологического материала плацентарного происхождения.
Ключевые слова: репарация, регенерация, нанодисперсная плацента человека, биоконтейнер.
Актуальность
В настоящее время биологические ткани в медицинской практике, в частности в офтальмологии, используются в виде макроскопических трансплантатов или крупнодисперсного порошка [1, 2, 3]. Однако известно, что эффективность усвоения трансплантата тканями реципиента повышается с уменьшением его размера [2].
Создание нанодисперсных трансплантатов из биологических материалов, способных глубоко проникать в ткани реципиента, вызывая в них репарацию и ангиогенез, и, тем самым, способствуя восстановлению их трофики и функции, является актуальной задачей. Ее решение может значительно расширить возможности медицины в комплексном лечении глазных заболеваний и особенно таких, которые до сих пор трудно или совсем не поддаются лечению.
Применение трансплантатов с указанными свойствами может значительно расширить возможности клинической медицины, особенно в лечении состояний, нуждающихся в деликатной замене или обновлении коллагеновых структур, образованию новых качественных сосудов и активированию систем, заинтересованных в улучшении гемодинамических процессов. Аллоплацентарные ткани в нано-размерной форме сохраняют свои преимущества, такие как высокая биодоступность и биологическая активность, сочетающиеся с низкими антигенными свойствами и высоким
энергетическим потенциалом. Они с успехом могут быть использованы в офтальмологии при лечении таких социальных заболеваний, как близорукость, глазной травматизм, глаукома и дистрофия сетчатки. Более целесообразным и перспективным представляется применение нанодисперсной аллоплаценты в лечении заболеваний, связанных с деструкцией соединительной ткани.
Одним из методов увеличения дисперсности материалов является механоактивация [4]. Однако до сих пор никто не занимался получением механоактивированных нанодис-персных биологических материалов. Нами разработан способ получения биологического материала в виде нанодисперсного порошка [5] и биологический контейнер (БК) [6], заполняемый взвесью нанодисперсного биологического материала для имплантации, используемый при реваскуляризации и интрас-клерального укрепления фиброзной оболочки глазного яблока.
Цель настоящей работы - экспериментальное исследование свойств биологического контейнера с нанодисперсной плацентой человека и процессов репарации в зоне его имплантации.
Материалы и методы. Механоактивиро-ванный порошок плаценты получали методом механического измельчения крупнодисперсного лиофилизированного материала в шаровой планетарной мельнице Ри1уеп8ейе-7.
Биоконтейнер был изготовлен из отрезка сосуда пуповины длиной до 10 мм и шириной до 2 мм, заполнялся порошком нанодисперсной плаценты человека. Порошок состоял [7] из отдельных частиц размером от 200 до 500 нм, сформированных зернами размером от 40 до 100 нм. Частицы в свою очередь образовывали слабосвязанные агломераты размером от 2 до 10 мкм (рис. 1, цветная вкладка).
Экспериментальные исследования выполнялись на половозрелых кроликах породы Шиншилла в возрасте от 1 года до 2 лет с массой тела от 3 кг до 3,5 кг согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Имплантацию БК производили под местной анестезией в верхненаружном квадранте в теноново пространство глазного яблока кролика. В качестве контроля производилась имплантация БК, содержащего макродисперсную взвесь плаценты с размерами частиц от 50 мкм и более [8]. Динамику структурно-функциональных изменений глаза животных проводили через 3 дня, 7 дней, 1, 2 и 3 месяца после пересадки. Для контроля микроанатомических изменений нукле-ированные глаза фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, заливали в парафин. Исследование структуры порошка измельченной плаценты человека и поверхности гистологических срезов зоны оперативного вмешательства проводились на сканирующей зондовой лаборатории Ntegra (NT-MDT) и сканирующем зондовом микроскопе Solver Pro (NT-MDT) в полуконтактном режиме на воздухе после предварительной химической очисткой от парафина. Аналогичным образом изучена структурная организация коллагеновых волокон в участках предварительно проведенных манипуляций. Для общего морфологического анализа препараты окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизону.
Результаты и обсуждение
На 3-е сутки после имплантации БК во всех рассмотренных случаях имплантат сосуда пуповины сохранялся. Отмечалась умеренная воспалительная инфильтрация, как стенки сосуда, так и окружающей конъюнктивы и субконъюнктивальной основы. Это были в основном сегментоядерные лейкоциты, по периферии концентрировались лимфоциты и еди-
ничные эозинофилы. Прилегающий участок склеры реципиента в опыте характеризовался разволокнением стромы, между коллагеновыми волокнами которой видны нейтрофилы и лимфоциты, а также мелкие пылевидные частицы синевато-розового цвета, аналогичные наблюдаемым при исследовании гистологического среза биоконтейнера. Такие же частицы - агломераты находились внутри пуповинного сосуда между клетками инфильтрата, а также в толще стенки и между окружающих имплантант воспалительными элементами. При этом отмечено сохранение на-норазмерной структуры измельченной плаценты 40-100 нм. По периферии инфильтрата, в склере, эписклере и слизистой оболочке регистрировалось полнокровие и расширение сосудов. В контроле, при имплантации БК с крупнодисперсной плацентой в просвете сосуда четко регистрировалась сиреневая масса из крупных частиц. Разволокнение поверхностных слоев склеры, их инфильтрация под БК не отмечались.
Для исследования глубины проникновения нанодисперсной плаценты в толщу склеры глаза животного были проведены спектроскопические исследования поперечного среза склеры по точкам и биологического контейнера на 7-е сутки после его имплантации. В качестве контрольных точек исследовалась нанодисперсная плацента человека и интакт-ная склера. Полученный люминесцентный спектр наноплаценты на 7-е сутки имплантации показывает проникновение нанодиспер-сных частиц плаценты в глубину склеры реципиента на 2/3 ее толщины.
На 10-е сутки имплантации в опыте наблюдался процесс распада и фагоцитоза пуповинного сосуда. В остатках его просвета наблюдались мононуклеарные лейкоциты. Среди клеток лейкоцитарного ряда в прилежащей конъюнктиве, а также в склере на 2/3 ее глубины по-прежнему прослеживались мелкодисперсные массы синевато-розового цвета (рис. 2а, цветная вкладка). В стенке пуповинного сосуда, и в окружающей конъюнктиве и склере наблюдалась очаговая лимфоци-тарно-макрофагическая инфильтрация. Выявлялись пролиферативные эндотелиально-фибробластические реакции. Вокруг лейкоци-тарно-фибробластических клеточных скопле-
ний начались процессы фибриллогенеза и развитие новой соединительной ткани. В контрольном образце на этом сроке проникновение крупнодисперсных частиц плаценты ограничивалось просветом капсулы и непосредственно прилежащей к донорской ткани суб-коньюнктивальной основой, исключая склеру реципиента (рис. 2б, цветная вкладка).
Через месяц имплантации микроскопически стенка БК как в опыте, так и в контроле, в значительной степени рассасывалась. В нем и его непосредственном окружении наблюдались лимфоцитарные скопления с примесью пролиферирующих фибробластов, эпителиоидных клеток и отдельные эозинофильные гранулоциты. Фибробласты формировали тонкую соединительную капсулу с множеством гемокапилляров и наличием эпи-телиоидных клеток. В опыте в склере инфильтрата практически нет. Отмечалось небольшое разволокнение волокон стромы, с наружной стороны. В контроле склеральная оболочка практически интактна, ангиогенез менее выражен, что согласуется данными ряда авторов [13].
Через два месяца имплантации в опыте мелкодисперсные частицы синевато-розоватого цвета в значительной степени рассасывались. Вокруг донорских структур в опыте образовалась капсула, состоящей в частности из эпителиоидных клеток и крупных макрофагов, содержащих внутри себя мелкие пылевидные частицы. Наружные слои капсулы были представлены вновь образованной рыхлой соединительной тканью с множеством вновь сформированных сосудов, активных фибробластов. В опыте строма склеры несколько разрыхлена, по периферии склеры определялось множество юных фибробластов. Вблизи высокий уровень микроциркуляции. В контроле крупнодисперсные частицы находились свободно в субконьюнктивальной основе, располагаясь между клетками лимфоидного ряда. Склера интактна, микроцирку-
ляция не столь выражена.
Через 3 месяца на месте БК в опыте была четко видна хорошо выраженная грануляционная ткань с эпителиоидными клетками и макрофагами, содержащими в цитоплазме ультрадисперсные частицы. Вокруг виднелась хорошо оформленная соединительнотканная капсула. В наружных слоях склеры также наблюдалось увеличение числа активных фибробластов, окруженных новообразованными коллагеновыми волокнами, что хорошо было видно при окраске пикрофукси-ном по Ван-Гизону. При использовании БК с крупнодисперсной плацентой так же наблюдалась новообразованная грануляционная ткань на поверхности склеры, однако новообразование коллагеновых волокон в самой склере не отмечено.
Заключение
Таким образом, полученные данные указывают на значительные биологические эффекты, возникающие в зоне имплантации БК с нанодисперсной плацентой человека, заключающиеся в модуляции репаративной регенерации в тканях реципиента, приводящей к формированию новой соединительнотканной капсулы на поверхности склеры и интрамуральному укреплению собственно склеры на 2/3 ее толщины. А это, в свою очередь, значимо превосходит аналогичные изменения с применением крупнодисперсных биологических материалов и макротрансплантатов. Кроме того, значительно усиливается трофическое обеспечение тканей за счет выраженного ангиогенеза в зоне имплантации БК с нанодисперсной плацентой человека. Полученные данные раскрывают перспективность использования нанодисперсной плаценты человека в офтальмологии для лечения прогрессирующей миопии, дистрофии сетчатки, частичной атрофии зрительного нерва, некоторых других заболеваний глаз и необходимость проведения исследований, однако требуют еще более глубокого детального анализа.
20.09.2011
Список литературы:
1. Сомов, Е.Е. Склеропластика. - СПб, 1995. - 144 с.
2. Муслимов С.А. Морфологические аспекты регенеративной хирургии. - Уфа, 2000. - 168 с.
3. Канюков В.Н. Экспериментально-гистологические основы новых технологий в офтальмохирургии / В.Н. Канюков, А.А. Стадников. -Оренбург, 2009. - 104 с.
4. Механохимия создания новых материалов: учеб. пособие / О.В. Андрюшкова [и др.]. - Новосибирск, 2007. - 385 с.
5. Способ приготовления биофункционального трансплантата в виде наночастиц : пат. РФ № 2367448 от 09.01.08.
6. Биологический контейнер для реваскуляризации соединительной ткани : патент РФ № 2З69З61 от 04.04.08.
7. Сканирующая зондовая микроскопия в изучении регенерации тканей при склеропластических операциях в офтальмологии / В.В. Жаров [и др.] // Поверхность. Рентгеновские, синхотронные и нейтронные исследования. / 2009. / № 10. / С. 69-74.
8. Морфологическое исследование биоконтейнеров в эксперименте / А.В. Корепанов [и др.] // Морфологические ведомости. / 2005. / № 1-2. / С. 91-92.
UDC 617.7:615.36:611.013.85
Zharov V.V., Perevozchikov P.A., Karban O.V., Samartseva N.N.
PROSPECTS OF HUMAN NANODISPERSED PLACENTA APPLICATION IN OPHTHALMOLOGY
Implantation influence of human nanodispersed placenta on processes of reparational regenerations in experimental conditions on rabbits is studied. It is shown that considerable biological effects occur not only on contact border sclera - the biocontainer, and practically in all thickness of sclera in a zone of implantation of the biocontainer with human nanodispersed placenta. Thus there is a strengthening as actually the recipient sclera in the field of not less 2I3 of its thickness, and shaping thick connecting-woven formation in zone of the implantations on a surface of sclera that significantly surpasses similar changes with application of a macrodispersed biological material of a placentary origin.
Keywords: reparation, regeneration, human nanodispersed placenta, biocontainer.
Bibliography:
1. Somov E.E. Scleroplasty. - SPb, 1995. - 144 p.
2. Muslimov S.A. Morphological aspects of regenerative surgery. Ufa, 2000. - 168 p.
3. Kanyukov V.N. Experimental-histological foundations of new technologies in ophthalmosurgery I V.N. Kanyukov, A.A. Stadnikov. - Orenburg, 2009. - 104 p.
4. Mechanochemistry of new materials creation: schoolbookI O.V. Andryushkova et al. - Novosibirsk, 2007. - 385p.
5. Preparation method of biofunctional graft in the form of nanoparticles: Pat. RF № 2367448, 09.01.08.
6. Biological container for connective tissue revascularization: Pat. RF №2369361, 04.04.08.
7. Scanning probe microscopy in the study of tissues regeneration at scleroplastic surgeries in ophthalmology I V.V. Zharov et al. II Surface. X-ray, synchotrone and neutron investigations I 2009. I № 10. - P. 69-74.
8. Morphological investigation of biocontainers in experiment I A. V. Korepanov et al. II Morphologicheskie vedomosti. I 2005. I № 1-2. I С. 91-92.
