CC BY
32
5. Павлов М. Е. Контроль за состоянием здоровья и меры его нормализации / М. Е. Павлов // Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства. -Горки, 1998.- С. 304-307.
6. Демидюк С. К. Рання д1агностика i симптоматика хвороб, пов'язаних з порушенням обмшу речовин у високопродуктивних Kopie / С. К. Демидюк,
A. М. Стадник // 36. наук. праць Харюв. держ. зоовет. акад. - Харюв, 2008. - Вип. 16 (41). - Ч. 2, т. 3. - С. 244-249.
7. Сл1вшська Л. Г. Умют у кров1 юсткових маркер1в метабол1зму за остеодистрофп Kopie / Л. Г. Сл1вшська, В. Л. Федорович // Наук. вюник вет. медицини: 36. наук. праць. - Бша Церква, 2011. - Вип. 8 (87). - С. 151-155.
8. Ковзов В. В. Диагностика нарушений обмена веществ у высокопродуктивных коров / В. В. Ковзов // Учёные записки УО Витебской ордена «Знак Почёта» госуд. акад. вет. медицины. - Витебск, 2007. - Вып. 1, т. 43. -С.109-111.
9. Стадник А. М. Современные направления доклинической молекулярной диагностики остеодистрофии / А. М. Стадник, В. Л. Федорович // Учёные записки УО Витебской ордена. "Знак Почёта" госуд. акад. вет. медицины. - Витебск, 2007. - Т. 43, вып. 1. - С. 228-230.
10. Диагностическая информативность некоторых показателей крови коров при остеодистрофии / Л. Г. Сливинская, В. Л. Федорович, С. К. Демедюк и др. // Учёные записки УО Витебской ордена. "Знак Почёта" госуд. акад. вет. медицины. -Витебск, 2014. - Т. 50, вып. 2, ч. 1. - С. 224-227.
11. Федорович В. Л. Стан кюткового метабол1зму за остеодистрофп Kopie /
B. Л. Федорович, Л. Г Сл1вшська // Наук. вюник Луган. нац. аграр. ун-ту. -Луганськ, 2011. - № 31. - С. 223-226.
Стаття надшшла до редакци 3.03.2015
УДК 619:614.31:615.9:631.57
Спиридонов В. Г., д.с.-г.н., заступник директора УЛЯБП АПК, Мельничук С. Д., д.б.н., член-кор. НААН Украши, Рибальченко Д. Ю., наук. сшвр. УЛЯБП АПК 1щенко В. Д., к.вет.н., доцент, Ткаченко В. В., к.вет.н., асистент © E-mail: [email protected] Нащоналънийушверситет 6iopecypcie i природокористуеання Украгни, Кигв
ЧУТЛИВ1СТЬ РОЗРОБЛЕНО! 1ФА ТЕСТ-СИСТЕМИ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ АФЛАТОКСИНУ Вх ПОР1ВНЯНО 3 ХРОМАТОГРАФ1ЧНИМИ МЕТОДАМИ
Розроблено тест-систему для выявления афлатоксину В1 методом 1ФА. В1дпрацьована методика синтезу iмуноферментного кон'югату афлотоксин-ЛФ i nidiöpano стабтзуюч1розчини для його збер1гання та створення iмуноферментног тест-системи. nidiöpano стабтзуючий розчин для збер1гання кон 'югату та розчин на ocHoei mpicoeozo буфера, який найкраще спраеляеся з подоланням неспециф\чних взаемод1й антиты з матер1алом планшету i зменшуеае кыъюстъ хибнихрезультат1в при постанову анал1зу.
Для естаноелення чутливост1 розробленог 1ФА тест-системи готуеали серт розведенъ стандарту афлатоксину В1 в молоц1 з концентрац1ями 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ppb. Зразки тестуеали методом 1ФА та за допомогою ВЕРХ. Визначено, що чутлив1сть еияелення афлатоксину Bj в розроблемй тест-cucmeMi 1ФА (ELISA) складае 4-40 ppb, а у ВЕРХ - 1-320 ppb. Доведено, що хроматограф1чм методи (тонкошароеа хроматограф1я та ВЕРХ) менш специф1чт поргвняно з iмуноферментним аналгзом. Отримавши основт компоненти тест-системи i оптим1зувавши умоеи проведения анал1зу показали,
© Спиридонов В. Г., Мельничук С. Д., Рибальченко Д. Ю., 1щенко В. Д., Ткаченко В. В., 2015
175
що розроблена тест-система легко егдтеорюеана, мае високу чутливгсть та специф1чшстъ.
Ключовг слова: афлатоксин Bj, тест-система, iмуноферментний анал1з, тонкошароеа хроматограф1я, еисокоефектиена piduuna хроматограф1я, чутлив1сть, специф1чмстъ.
УДК 619:614.31:615.9:631.57
Спиридонов В. Г., д.с.-х.н., заместитель директора УЛКБП АПК, Мельничук С. Д., д.б.н., член-кор. НААН Украины, Рыбальченко Д. Ю., науч. сотр. УЛКБП АПК, Ищенко В. Д., к. вет. н., доцент, Ткаченко В. В., к. вет. н., асистент Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, Киев
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ РАЗРАБОТАННОЙ НФА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АФЛАТОКСИНА В1 ПО СРАВНЕНИЮ С ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Разработана тест-система для опредеения афлатоксина Bj методом ИФА. Отработанная методика синтеза иммуноферментного конъюгата афлотоксин-ЩФ и подобраны стабилизирующие растворы для его хранения для создания иммуноферментной тест-системы. Подобран стабилизирующий раствор для хранения конъюгата и раствор на основе трисового буфера, который лучше справлялся с преодолением не специфических взаимодействий антител с материалом планшета и уменьшал количество ложных результатов при постановке анализа.
Для определения чувствительности разработанной ИФА тест-системы готовили серию разведений стандарта афлатоксина Bj в молоке с концентрациями 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ppb. Образцы тестировали методом ИФА и с помощью ВЭЖХ. Определено, что чувствительность обнаружения афлатоксина Bj в разработаной тест-системе ИФА (ELISA) составляет 4-40 ppb, а в ВЭЖХ - 1-320 ppb. Доказано, что хроматографические методы (тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ) менее специфичны по сравнению с иммуноферментным анализом. Получив основные компоненты тест-системы и оптимизировав условия проведения анализа показано, что разработанная тест-система легко воспроизводима, имеет высокую чувствительность и специфичность.
Ключевые слова: афлатоксин В1, тест-система, иммуноферментный анализ, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, чувствительность, специфичность.
UDC 619:614.31:615.9:631.57
Spyrydonov V. G., Dr. agricultural Sciences, Melnychuk S. D., Dr. biol. Sciences, Rybal'chenko D. Y., researcher, Ischenko V. D., PhD. vet. Science, Associate Professor, Tkachenko V. V., PhD. vet. Science (E-mail: [email protected]) National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kiev
THE SENSITIVITY OF DEVELOPED ELISA TEST SYSTEM FOR AFLATOXIN
B1 DETECTION COMPARED TO CHROMATOGRAPHIC METHODS
The test system was developed for the detection of aflatoxin Bj by ELISA. The methodology for synthesis of immune-enzyme aflatoxin-alkaline phosphatase conjugates was completed and selected stabilizing solutions for the storage and creating ELISA test system. The stabilizing solution was selected for storing conjugate and trises buffer solution that better cope with overcoming nonspecific interactions of antibodies with the
176
material ofplate and reduces amount offalse positives in the formulation of analysis. For determining the sensitivity of developed ELISA test systems was prepared the dilutions series of aflatoxin Bj standards in milk at the concentrations 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ppb. The samples were analized by ELISA and HPLC. Determined that the sensitivity of detection of aflatoxin B1 at the developed of ELISA test system is 4-40 ppb, and HPLC - 1-320 ppb. Was proved that the chromatographic techniques (thin layer chromatography and HPLC) compared with the ELISA less specific. After receiving the basic components of the test system and optimized of the analysis conditions were showed that the developed test system can be easily reproducible and has a high sensitivity and specificity.
Key words: aflatoxin Bj, test systems, ELISA, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, sensitivity, specificity.
Важливе значения для забезпечення випуску яюсно! продукцп та попередження переходу до оргашзму людини та тварин шкщливих речовин у кшькостях, що перевищують ппешчш норми, е контроль за вмютом контамшант1в х1м1чного та бюлопчного походження. За оцшками заруб1жних анаттиюв, понад 40 % св1тового зерна забруднено мшотоксинами. Сьогодш доведено, що безпечних piBHiB м1котоксин1в немае, навпъ найменш1 i'x кшькосп в кормах волод1ють негативним ефектом i здатш поступово накопичуватися в оргашзму Окр1м того, у бшьшосп випадюв мшотоксини в кормах присутш не окремо, а в комбшацп. Внявлення навпъ одного мшотоксину на меж1 максимально допустимого р1вня (МДР) - досить вагома шдстава вважати про присутнють шших мшотоксишв. Комбшацп м1котоксин1в викликають змшаш симптоми м1котоксикоз1в у тварин, що значно ускладнюе д1агностику захворювань. Постшне вживання декшькох м1котоксин1в у кшькостях, що у 2-3 рази нижч1 за МДР, створюе бшьш негативний ефект, шж нетривале вживання одного мшотоксину у високш доз1. Головним завданням фах1вщв в робот1 з контамшованими комбшормами i зерновими компонентами е своечасне виявлення мшотоксишв, встановлення i'x концентрацп [1, 2, 4, 5]. _
Ниш для д1агностики шфекцшних захворювань та виявлення х1м1чних сполук вживаним е метод ¿муноферментного анал1зу (1ФА), що був запропонований на початку 70-х роюв. До кшця XX столнтя цей метод пройшов шлях вщ новнньо! науково! розробки до рутинного методу в кшшчшй д1агностищ. До його переваг можна вщнести високу чутливють, специф1чнють, вщтворюванють, ушфшовашсть i придатнють для масових обстежень. Можливють шструментально! оцшки результата усувае чинник суб'ективносл [6]. До цього часу в Украш не вироблялись набори для визначення мшотоксишв та компонента для i'x виготовлення (мшотоксини, гаптени для ¿мушзаци та антитша).
Метою роботи е розробка простих та доступних метод1в експрес-виявлення афлатоксину, встановлення piBHiB детекцп та надання рекомендацш щодо використання розроблених тест-систем.
Методи та матер1али. Роботи проведеш у вщцш молекулярно-генетичних дослщжень УЛЯБП АПК. Методи дослщжень включають синтез кон'югата на 0CH0Bi гаптешв, приготування стабшзуючих та блокуючих розчишв та шших компонента ¿муноферментних тест-систем, адсорбцп антитш на тверду фазу, видшення екстракцп токсишв з р1зноманнних субстрата, проведения статистичного анал1зу. В дослщах використовували зразки pi3Horo походження, яю мютили афлатоксин Bi.
Виявлення афлатоксину В1 за допомогою тонкошаровог хроматографа. Плапвку для тонкошарово! хроматографп («Merck», art.5567) розм1чають тонкими
177
ол1вцевими лшями. На горизонтально лшп, проведенш на вщсташ 1,5 см вщ ннжнього краю пластинки, наносять за допомогою мшрошприца на вщсташ в 2 см один вщ одного по 0,002, 0,005 i 0,01 см3 робочого розчину стандарту афлатоксину B1 (2, 5 i 10 нг вщповщно). На вщсташ 1 см м1ж плямами стандарту наносять 0,01 i 0,02 см3 дослщжуваного розчину. Плат1вку помщають в камеру для тонкошарово! хроматографп з сумшшю еф1р-метанол-вода (94:4,5:1,5) i витримують пластинку до досягнення фронтом розчинника лшп, проведено! в 1 см вщ верхнього краю пластинки. Плат1вку витягують з камери, сушать на noehpi 5 хв i розглядають в довгохвильовому УФ-свиль Виявлення на плат1вщ плям, вщповщних за хроматограф1чною рухливютю i кольором флуоресценцп плям1 стандарту афлатоксину, свщчить про можливу наявнють афлатоксину [3].
Выявления афлатоксину В1 за допомогою ВЕРХ. Для кал1брування приладу по флуориметричному детектору в шжектор за допомогою мшрошприца вводять 0,001; 0,002; 0,003; 0,005 см робочого розчину стандарту афлатоксину Bi (вщповщае 1,0; 2,0; 3,0; та 5,0 нг афлатоксину В1). Для кожно! кшькосп афлатоксину визначають висоту шку та розраховують кал1брувальний коефщент для афлатоксину В1.
Умови хроматографування: об'ем дослщжуваного розчину (20 мкл та 100 мкл для заповнення можливого мертвого об'ему); колонка розм1рами 15x4,6 мм з оберненою фазою С18; збудження флуоресценцп - 362 нм, детекщя - 440 нм; рухома фаза - ацетоштрил-метанол-вода у сшввщношеннях 2:2:6 з додаванням 0,12 г/л бром1ду кал1ю та 0,2 г/л азотно! кислоти; швидк1сть протоку - 1 мл/хв.; температура термостату колонки - 40°С. При використанн1 електрох1м1чного дериватизатору межа визначення становить 0,9 мкг/кг.
Результаты досл1джень. У в1дд1л1 молекулярно-генетичних досл1джень УЛЯБП АПК було розроблено тест-систему для виявлення афлатоксину В1 методом 1ФА. В1дпрацьована методика синтезу ¿муноферментного кон'югату афлотоксин-лужна фосфатаза i пщ1брано стаб1л1зуюч1 розчини для його збер1гання. В1дпрацьовано п1дб1р стаб1л1зуючого розчину для збер1гання кон'югату для створення ¿муноферментно! тест-системи. П1д1брано розчин, який приготований на основ1 тр1сового буфера, що найкраще справлявся з подоланням неспециф1чних взаемод1й антит1л з матер1алом планшету i зменшував к1льк1сть хибних результата при постановщ ¿муноферментного анал1зу.
Передовс1м було встановлено специф1чн1сть розроблено! тест-системи. В дослщах використовували зразки р1зного походження, як1 м1стили афлатоксини В1 та М1, що було пщтверджено методом ВЕРХ. Для пост-колоночн! дериватизацй при проведенн1 ВЕРХ вибрали п1р!д1н1ум бром1д пербром1д (PBPB). На хроматограф! показана р1зниця в чутливосп двох метод1в дериватизац!! - шрщшумом бром1д пербром1дом та йодом (рис. 1).
Результата досл1джень щодо встановлення специф1чност! виявлення афлатоксину В1 ¿з використанням розроблено! тест-системи представлено в табл. 1.
Для встановлення чутливосп розроблено! 1ФА тест-системи готували серда розведень стандарту афлатоксину В1 в молощ з наступними концентрац1ями: 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ppb. Зразки тестували методом 1ФА та за допомогою ВЕРХ.
Необхщно наголосити, що за досить високо! чутливосп (табл. 3) хроматограф!чн1 методи (тонкошарова хроматограф1я та ВЕРХ) менш специф1чш пор1вняно з 1ФА. Тонкошарова хроматограф1я практично не розр1зняе афлатоксин
178
В] в1д В2, необхщне спектральне тдтвердження xiMÎ4H0Ï будови анал1ту; для ВЕРХ необхщна наявнють флуоресцентного детектору та дюдно! матриц!.
зап п а
зкп а а
2 4Д аа
22а OD
juu xi а
s au а а
__ I ко п а
В « а и
Щ
— s an па
■ па я а
da JQ а
en an
ЛИ U LB
за па
PBRB iodine
M
îaaa hie i2£c 13. an ■ л.лэ -s:
Рис. 1. Пост-колоночш методи дериватизаци - шрвдшумом бромщ пербромщом
Таблиця 1
№ з/п Зразки, що мютять афлатоксин В1 ppb. Результата дослщження в1ФА (ELISA) Зразки що мютять афлатоксин М1 PPb. Результата дослщження в1ФА (ELISA) Зразки, що не мктять афлатоксин В1 Результата дослщження в 1ФА (ELISA)
1 Люцерна 0,58 Виявлено Соевий шрот 1,24 Не виявлено Люцерна Не виявлено
2 Солома 0,61 Виявлено Кукурудза 2,14 Не виявлено Солома Не виявлено
3 PinaK 8,05 Виявлено Пшениця 5,54 Не виявлено PinaK Не виявлено
4 Силос 73,22 Виявлено Соя 7,87 Не виявлено Кукурудза Не виявлено
5 Кукурудза 9,81 Виявлено Кукурудза 65,14 Не виявлено Кукурудза Не виявлено
6 Соевий шрот 0,82 Виявлено Кукурудза 30,12 Не виявлено Пшениця Не виявлено
7 Люцерна 0,96 Виявлено Кукурудза 14,62 Не виявлено Соя Не виявлено
8 Солома 0,67 Виявлено Люцерна 7,42 Не виявлено Силос Не виявлено
9 PinaK 8,05 Виявлено Люцерна 9,17 Не виявлено Соевий шрот Не виявлено
10 Пшениця 73,22 Виявлено - - Люцерна Не виявлено
Для внзначення в1дтворюваност1 вносили у 20 повторах один i той самий зразок та вирахували середне значения (maen) та стандартне в1дхилення (SD), за допомогою Microsoft Office Excel, яке поставляли у формулу, та вираховували вщтворювашсть :
C.V. = SD/mea *100 %= 0,0237/0,353*100=6,7 % Таким чином, вщтворюванють розробленого 1ФА для виявлення афлатоксину складае 6,7 %, що в1дпов1дае стандартам прийнятих для тест-систем даного типу.
179
Отже, ¿муноферментна тест-система е легко вщтворюваною, мае високу чутливють та специф1чнють, що дозволяе отримати в1рогщш результати анал1зу.
Таблиця 2
Чутливкть виявлення афлатоксину Bi в 1ФА (ELISA) пор1вняно з _високоефективною рщинною хроматограф1ею_
№ п/п Розведення стандарта Результат! Результати досл!дження методом
афлатоксину В1 досл1дження високоефективно! рщинно!
в зразку молока, в1ФА хроматографп (HPLC)
ppb. (ELISA)
1 0 Не виявлено Не виявлено
2 1 Виявлено Виявлено
3 5 Виявлено Виявлено
4 10 Виявлено Виявлено
5 20 Виявлено Виявлено
6 40 Виявлено Виявлено
7 80 Не виявлено Виявлено
8 160 Не виявлено Виявлено
9 320 Не виявлено Виявлено
10 640 Не виявлено Не виявлено
Таблиця 3
Чутливкть метод1в визначення афлатоксину В1_
Тонкошарова хроматограф!я (ТШХ) Високоефективна рщинна хроматограф!я (ВЕРХ) 1муноферментний анал!з (1ФА)
3-20 мкг/кг 0,9 - 320 мкг/кг 4-40 мкг/кг
Висновки
1. Визиачеио, що чутливють виявления афлатоксину Bi в розробленш тест-систем! 1ФА (ELISA) складае 4-40 ppb, а чутливють виявлення у ВЕРХ становить 1-320 ppb.
2. Доведено, що хроматограф1чш методи (тонкошарова хроматограф1я та ВЕРХ) менш специф1чш пор1вняно з ¿муноферментним анал1зом.
3. Отримавши 0CH0BHi компонента тест-системи та оптим1зувавши умови проведения, показано, що розроблена ¿муноферментна тест-система е легко вщтворюваною, мае високу чутливють та специф1чнють, що дозволяе отримати BiporiflHi результати анал1зу.
Перспективи подальших дослщжень. Розробка тест-систем для визначення в 1ФА шших MiKOTOKCHHiß, забруднювач1в навколишнього середовища, корм1в i сщьськогосподарсько! продукцп.
Лггература
1. Evaluation of certain mycotoxins in food : fifty-sixth report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives (WHO technical report series ; 908). -Geneva, 2002. - 62 p.
2. Know Mycotoxins - Global Mycotoxin Information Resource [ електронний ресурс]. - Режим доступу : URL : http://www.knowmycotoxins.com/ru/vpig.htm
3. ДСТУ EN 12955 - 2001. Метод високоефективно! рщинно! хроматографп за допомогою постколонково! дериватизацп та очищения на ¿муннш колонщ.
4. ДСТУ ISO 22000:2007 Системи керування безпекою харчових продукпв
- Вимоги до будь-яких орган1зац1й харчового ланцюга.
5. Кравченко Л. В. Биобезопасность. Микотоксины - природные контаминанты пищи / Л. В. Кравченко, В. А. Тутельян // Вопросы питания. - 2005.
- № 3. - С. 3-13.
180
6. Теория и практика иммуноферментного анализа / [А. М. Егоров, А. П. Осипов, Б. Б. Дзантиев, М. Е. Гаврилова]. - М. : Высш. шк., 1991. - 288.
Стаття надшшла доредакци 23.03.2015
УДК 619:611(092)
Стегней М. М., к.вет.н., доцент © E-mail: [email protected]
Нац10налънийутверситет 6iopecypcie i природокористуеання Украгни,
м. Кигв, Украгна
ВНЕСОК ПРОФЕСОРА Г. О. ПММЕЛЬРЕЙХА У СВ1ТОВУ МОРФОЛОГ1ЧНУ НАУКУ
Зроблено анал1з науковог д1яльност1 еидатного украгнського морфолога, eidoMOi oco6ucmocmi в ceimi у галуз1 пор1вняльног та еволющйног морфологп теарин, доктора б1олог1чних наук, професора Г. О. Пммелърейха. 1м'я Германа Олександровича Пммелърейха вгдоме широкому колу вчених не лише в галузг ветеринарног медицини, гуманног медицини, бюлогН, зоологи Украгни, але i фах1вцямАзИ, Африки, Латинсъког Америки, Свропи.
HayKoei досл1дження Г. О. Пммелърейха грунтувалися на вивченш м'яз1в глоткових стток ссавщв. Досл1дженнями показано, що в 6ydoei м 'яз1в глотки у pi3HUX групах ссавщв iснуютъ значш eidMiHHOcmi. У результатi широкого i ретелъного морфо-функцюналъного до^дження глотки вгн створив нове уявлення про шляхи фыогенетичного розвитку eciei переднъог Ылянки апарату травления. Базуючисъ на власних даних, вт запропонував eidMiHHi eid iснуючого тлумачення меж1 глотки ссавщв, iieiddrne, будоеу та функцт им'язового апарату.
Здобут! урезультат1 досл1джень матер1али викладеш у 80 наукоеих працях i опубл1ковам не лише у в1тчизняних зб1рниках, але i у еизнаних м1жнародних журналах.
Ключовг слова: еетеринарна морфолог1я, кафедра анатомп, еетеринарний incmumym, iстор1я ветеринарног медицини, м'язиглотки, голоенакишка, ссавц1.
УДК 619: 611 (092)
Стегней М. М., к.вет.н., доцент Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, г. Киев
ВКЛАД ПРОФЕССОРА Г. А. ГИММЕЛЬРЕЙХА В МИРОВУЮ МОРФОЛОГИЧЕСКУЮ НАУКУ
Сделан анализ научной деятельности выдающегося украинского морфолога, известной личности в мире в области сравнительной и эволюционной морфологии животных, доктора биологических наук, профессора Г. А. Гиммельрейха. Имя Германа Александровича Гиммельрейха известное широкому кругу ученых не только в области ветеринарной медицины, гуманной медицины, биологии, зоологии Украины, но и специалистам Азии, Африки, Латинской Америки, Европы.
Научные исследования Г. А. Гиммельрейха основывались на изучении мышц глоточных стенок млекопитающих. Исследованиями показано, что в строении мышц глотки в разных группах млекопитающих существуют значительные различия. В результате широкого и тщательного морфо-функционального исследования глотки он создал новое представление о путях филогенетического
©Стегней М. М., 2015
181
