CC BY
217
УДК 633.1:636.085:634.5:57.083.3
Экспрессные методики
иммуноферментного определения содержания микотоксинов в зерне, кормах и орехах
М.Ю. Медведевских, М.П. Крашенинина, канд. техн. наук; А.С. Сергеева, канд. хим. наук Уральский научно-исследовательский институт метрологии, г. Екатеринбург И.А. Шанин, П.А. Петухов
ООО «ХЕМА», Москва
Обеспечение безопасности пищевых продуктов и продовольственного сырья - одно из условий сохранения жизни и здоровья людей. Существенную угрозу для здоровья человека представляют микотоксины -большая группа вторичных метаболитов, образующихся в результате жизнедеятельности некоторых видов микроорганизмов, чаще всего плесневых грибов, поражающих сельскохозяйственное сырье и продукты питания. Многие из них обладают канцерогенными, мутагенными, ге-
№
2
(б)
■7-у ■■ П-, ::
Сорбция
ЖЖШМШГ
Конкурентное взаимодействие
АШ Детекция
* " » " Г-и * л ■
*
Рис. 1. Схемы ИФА микотоксинов: а - конкурентное связывание с мечеными антителами свободного микотоксина и иммобилизованного конъюгата микотоксин-белок; б - конкурентное связывание с иммобилизованными антителами свободного и меченого микотоксина; 1 - микотоксин в составе конъюгата с белком; 2 - белок-носитель; 3 - ферментная метка; 4 - специфические антитела; 5 - свободный микотоксин; С - субстрат; П - продукт
патотоксическими свойствами, а также оказывают иммунодепрессивный эффект [1].
Риску заражения микотоксинами наиболее подвержены продукты растительного происхождения: орехи, какао-бобы, сухофрукты, специи, зерновые и бобовые культуры. Они могут также присутствовать в продуктах животного происхождении, если животных кормили зараженным кормом. Микотоксины могут загрязнять продукцию и на стадии получения сырья, однако, как правило, появление их в продуктах питания связано с нарушением условий хранения и транспортировки. Наиболее распространенными микотоксинами, представляющими опасность для здоровья человека и животных, являются афлатоксины, Т-2 токсин, зеараленон, охратоксин А, дезок-синиваленол (ДОН), фумонизины. Эти вещества достаточно устойчивы к воздействиям окружающей среды и не разрушаются даже при термической обработке [1].
Высокая степень токсичности микотоксинов и, следовательно, угроза здоровью человека, а также огромные убытки производителей из-за зараженности всей цепочки продукции обусловили необходимость введения жесткого контроля, в частности, путем установления максимально допустимых уровней (МДУ) содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах [2, 3]. Ключевым моментом в решении задачи контроля содержания микотоксинов в продуктах питания и продовольственном сырье
является разработка современных аналитических методов измерений и их внедрение в практику рутинного анализа испытательных лабораторий.
Наиболее часто для определения содержания микотоксинов в пищевой продукции используют хроматогра-фические методы (газожидкостная хроматография совместно с масс-спектрометрией, высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-спектрометрической, флуоресцентной или масс-спектрометрической детекцией) с различными вариантами пробоподготовки [4]. Преимущества данных методов - их высокая чувствительность, селективность, возможность одновременного определения широкого круга микотокси-нов. Однако высокая стоимость оборудования, используемых реагентов, стандартных образцов, а также повышенные требования к квалификации персонала ограничивают применение хроматографических методов в испытательных лабораториях как производственных предприятий, так и организаций, осуществляющих санитарно-эпидемиологический надзор (филиалы Россельхознадзора, Роспотребнадзора). В связи с этим, хроматографическое определение используют, главным образом, в качестве подтверждающего метода измерений содержания микотоксинов.
Для осуществления рутинных измерений применяют скрининговые методы, наиболее распространенным из которых является твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Методы ИФА основаны на высокоспецифичной реакции антиген-антитело, детектирование которой осуществляется за счет введения ферментативной метки с последующим ее выявлением с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску [5, 6]. Твердой фазой в иммуноферментном анализе обычно служит поверхность лунки микропланшета. Типичные схемы проведения ИФА представлены на рис. 1 [7].
Высокоспецифическое взаимодействие антигена и антитела определяет высокую специфичность и чувствительность иммуноферментных методик измерений. Кроме того, ИФА обладает такими преимуществами, как оперативность, высокая производительность (одновременно на одном планшете проводится несколько десятков анализов), простота пробоподготовки и проведения измерений, низкая стоимость анализа по сравнению с хроматографически-
ми методами, малый объем тестируемого образца.
В настоящее время на рынке представлены различные тест-системы для иммуноферментного определения содержания микотоксинов. Подавляющее большинство тест-систем выпускаются иностранными фирмами: Ridascreen (компания R-Biopharm, Германия), Agra Quant (Romer Labs, Австрия), Veratox (Neogen, США) и т. д. Это определяет их высокую стоимость и, как следствие, низкую доступность для широкого круга потребителей. Альтернативой иностранных тест-систем являются наборы реагентов для иммуноферментного определения микотоксинов производства ООО «ХЕМА» (Москва) (табл. 1). Использование высокочувствительных антител и качественных реагентов собственного производства позволяет ООО «ХЕМА» продавать выпускаемые ИФА-наборы по цене в несколько раз ниже, чем иностранных аналогов. Высокая чувствительность, специфичность и эффективность ИФА-наборов подтверждена положительными результатами проверки квалификации по определению ми-котоксинов в кукурузе, организованной в 2017 г. FAPAS (подразделение Агентства по исследованию пищевых продуктов и окружающей среды Великобритании).
На основе применения перечисленных ИФА-наборов специалистами ООО «ХЕМА» разработаны методики измерений массовой доли микотоксинов в зерне и продуктах на зерновой основе, кормах и орехах (табл. 2). Разработанные методики были аттестованы, оформлены в соответствии с [8, 9] и отправлены на регистрацию в Федеральный информационный фонд по обеспечению единства измерений. Работы по аттестации проведены Уральским научно-исследовательским институтом метрологии (г. Екатеринбург). УНИИМ аккредитован на аттестацию методик (методов) измерений и проведение метрологической экспертизы (номер аттестата аккредитации RA. RU. 311866 от 07.09.2016 г.).
Оценка метрологических характеристик методик измерений массовой доли афлатоксина В1, Т-2 токсина, зеараленона, охратоксина А, де-зоксиниваленола была выполнена с применением метода добавок в соответствии с РМГ 61 [10]. В качестве добавки были использованы растворы, приготовленные из стандартных образцов (СО) утвержденных типов состава растворов микотоксинов ГСО
Таблица 1
Аналитические характеристики наборов реагентов для иммуноферментного определения микотоксинов производства ООО
«ХЕМА»
Наименование набора Специфичность, % Предел определения в буферном растворе, мкг / см3 (ppb) Степень извлечения, %
Афлатоксин В1 - 100
АФЛАТОКСИН-ИФА Афлатоксин В2 - 20 Афлатоксин G1 - 30 Афлатоксин G2 - 38 0,05 100 ± 10
Т-2 ТОКСИН-ИФА Т-2 токсин - 100 2 100 ± 15
ЗЕАРАЛЕНОН-ИФА Зеараленон - 100 0,75 95
ОХРАТОКСИН-ИФА Охратоксин А - 100 0,4 100 ± 10
Дезоксиниваленол - 100
3-ацетилдезокси-ниваленол - 221
ДЕЗОКСИНИВА-ЛЕНОЛ-ИФА 15-ацетилдезокси-ниваленол - <1% ДОН-3-глюкозид - <1% Ниваленол - <1% T-2 токсин - <1% HT-2 токсин - <1% 15 95 ± 10
ФУМОНИЗИН-ИФА Фумонизин В1 - 100 Фумонизин В2 - 100 0,3 95 ± 5
Таблица 2
Перечень разработанных методик
Шифр методики Наименование методики Номер и дата свидетельства об аттестации
K921B Методика измерений массовой доли афлатоксина В. в пробах зерновых культур, кормов и орехов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «АФЛАТОКСИН-ИФА» производства ООО «ХЕМА» 241.0192 /RA. RU. 311866 /2017 от 03.07.2017 г.
K922I Методика измерений массовой доли Т-2 токсина в пробах зерновых культур и кормов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «Т-2 ТОКСИН-ИФА» производства ООО «ХЕМА» 241.0194 / RA. RU. 311866 /2017 от 03.07.2017 г.
K923I Методика измерений массовой доли зеараленона в пробах зерновых культур, кормов и орехов методом имму-ноферментного анализа с помощью набора реагентов «ЗЕАРАЛЕНОН-ИФА» производства ООО «ХЕМА» 241.0195 / RA. RU. 311866 /2017 от 03.07.2017 г.
K924I Методика измерений массовой доли охратоксина А в пробах зерновых культур и кормов методом иммунофермент-ного анализа с помощью набора реагентов «ОХРАТОКСИН-ИФА» производства ООО «ХЕМА» 241.0193 / RA. RU. 311866 /2017 от 03.07.2017 г.
K925I Методика измерений массовой доли дезоксиниваленола в пробах зерновых культур, кормов и орехов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛ-ИФА» производства ООО «ХЕМА» 241.0196 / RA. RU. 311866 /2017 от 03.07.2017 г.
K927I Методика измерений массовой доли фумонизинов В. и В2 в пробах зерновых культур и кормов методом иммуноферментного анализа с помощью набора реагентов «ФУМОНИЗИН-ИФА» производства ООО «ХЕМА» 241.0199 / RA. RU. 311866 /2017 от 03.07.2017 г.
Таблица 3
Метрологические характеристики методик измерений содержания микотоксинов
Шифр методики Микотоксин Диапазон измерений массовой доли, мкг/кг (ppb), % Относительная погрешность, %
K921B Афлатоксин В1 0,3 - 20 20 - 62,4 32 18
K922I Т-2 токсин 24-240 240-960 44 16
K923I Зеараленон 9 - 120 120-2400 35 23
K924I Охратоксин А 2,4 - 19,2 19,2 - 76,8 22 39
K925I Дезоксиниваленол 100 - 1350 1350-5400 42 33
K927I Фумонизины В1 и В2 3,6 - 86,4 86,4-5184 44 34
7936 - 2001, ГСО 7940 - 2001, ГСО 7941 - 2001, ГСО 7942 - 2001 и ГСО 7944 - 2001. Для оценки точности измерений массовой доли фумо-низинов В, и В2 были применены матричные стандартные образцы иностранного производства - стандартные образцы кукурузы, загрязненной микотоксинами, TR-MT100, TR-MT500, TR-MT1000 производства Trilogy Analytical Laboratory (США). Валидация СО была проведена специалистами УНИИМ с использованием Государственного вторичного эталона единиц массовой доли и массовой (молярной) концентрации органических компонентов в жидких и твердых веществах и материалах на основе газовой и жидкостной хроматографии ГВЭТ 208 - 1 - 2016 (далее - ГВЭТ 208 - 1-2016) [11]. Метрологические характеристики методик измерений приведены в табл. 3.
В разрабатываемых методиках подчеркивается их назначение -для установления соответствия показателей безопасности выпускаемой продукции. Методики содержат полную информацию о порядке и особенностях подготовки пробы, проведения измерений и контроле получаемых результатов.
Следующим шагом в повышении качества определения содержания микотоксинов методом ИФА в продуктах питания и продовольственном сырье является участие испытательных лабораторий в межлабораторных сличительных (сравнительных) испытаниях (МСИ). МСИ планируется провести УНИИМ после внедрения разработанных методик в деятельность лабораторий и приобретения ими практического опыта проведения измерений. Таким образом, предлагается реализовать следующую последовательность внедрения экспрессных иммуноферментных методик с использованием наборов реагентов отечественного производства: разработка методики измерений токсичных веществ;
аттестация методики в соответствии с требованиями [8, 9];
внедрение методики в деятельность лабораторий;
проведение МСИ с целью проверки квалификации лабораторий при реализации ИФА-метода;
осуществление предупреждающих и корректирующих действий, и, в случае, необходимости, внесение изменений в методику измерений;
внесение методики в Федеральный информационный фонд по обеспечению единства измерений и допуск
методики для использования в сфере технического регулирования в области обеспечения единства измерений [12].
Предложенная схема позволит оптимизировать затраты лабораторий и обеспечить высокое качество измерений при установлении соответствия показателей безопасности пищевых продуктов и продовольственного сырья обязательным требованиям, установленным в [2, 3].
ЛИТЕРАТУРА
1. Bennett, J. W. Mycotoxins. Clin. Microbiol. Rev./J.W. Bennett, M. Klich. -2003. - V. 16 (3). - Р. 497 - 516.
2. СанПиН 2.3.2.1078 - 01 Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов (токсичные элементы, пестициды, мико-токсин ы). - М.: Москва, 2001.
3. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021 2011).
4. Амелин, В. Г. Хроматографические методы определения микотоксинов в пищевых продуктах / В. Г. Амелин, Н.М. Карасева, А.В. Третьяков // Аналитическая химия. - 2013. - Т. 68. - № 3. -С. 212 - 223.
5. Отто, М. Современные методы аналитической химии/М. Отто; 3-е изд. перераб. и доп. - М: Техносфера, 2008. -544 с.
6. Егоров, А. М. Теория и практика иммуноферментного анализа/А. М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев. - М.: Высшая школа, 1991. - 288 с.
7. Урусов, А. Е. Иммунохимиче-ские методы анализа микотоксинов (обзор)/ А. Е. Урусов, А. В. Жердев, Б.Б. Дзантиев // Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Т. 46. - № 3. -С. 276 - 290.
8. Приказ Минпромторга России от 15.12.2015 № 4091 «Об утверждении Порядка аттестации первичных референтных методик (методов) измерений, референтных методик (методов) измерений и методик (методов) измерений и их применения» (Зарегистрирован в Минюсте России 20.02.2016 г. № 41181).
9. ГОСТ Р 8.563 - 2009 Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений.
10. РМГ 61 - 2010 Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки.
11. Шохина, О.С. Разработка государственного вторичного эталона и стандартных образцов состава на основе жидкостной и газовой хроматогра-
фии/О.С. Шохина [и др.] // Стандартные образцы. - 2017. - Т. 13. - № 1. -С. 9 - 26.
12. Федеральный закон от 26 июня 2008 г. № 102-ФЗ «Об обеспечении единства измерений».
REFERENCES
1. Bennett J.W., Klich M. Mycotoxins. Clin. Microbiol. Rev., 2003, vol. 16 (3), pp. 497-516.
2. SanPiN 2.3.2.1078 - 01 Hygienic requirements for the safety and nutritional value of food products (toxic elements, pesticides, mycotoxins). Moscow, 2001. (In Russ.)
3. Technical regulations of the Customs Union "On Food Safety" (TR TS 021 2011). (In Russ.)
4. Amelin V.G., Karaseva N.M., Tretyakov
A.V. [Chromatographic methods for determining mycotoxins in food]. Analitiches-kaya khimiya, 2013, vol. 68, no 3, pp. 212223. (In Russ.)
5. Otto M. Sovremennye metody anal-iticheskoi khimii [Modern methods of analytical chemistry]. 3rd ed. Moscow, Tekhnosfera Publ., 2008. 544 p.
6. Egorov A.M., Osipov A.P., Dzantiev
B.B. Teoriya i praktika immunofermentno-go analiza [Theory and practice of enzyme immunoassay]. Moscow, Vysshaya shkola Publ., 1991. 288 p.
7. Urusov A.E., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. [Immunochemical methods for the analysis of mycotoxins (review)]. Priklad-naya biokhimiya i mikrobiologiya, 2010, vol. 46, no. 3, pp. 276-290. (In Russ.)
8. Order of the Ministry of Industry and Trade of the Russian Federation No. 4091 of 15.12.2015 "On the Approval of the Procedure for Attestation of Primary Reference Measurement Techniques (Methods), Reference Measurement Techniques and Measurement Techniques (Methods) and their Applications" (Registered in the Ministry of Justice of Russia No. 41181 of February 20.02.2016. (In Russ.)
9. GOST R 8.563 - 2009 State system for ensuring the uniformity of measurements. Methods (methods) of measurements. (In Russ.)
10. RMG 61 - 2010 State system for ensuring the uniformity of measurements. Indicators of accuracy, correctness, precision of quantitative chemical analysis techniques. Methods of evaluation. (In Russ.)
11. Shokhina O.S. et al. [Development of the state secondary standard and standard samples of the composition on the basis of liquid and gas chromatography]. Standartnye obraztsy, 2017, vol. 13, no. 1, pp. 9-26. (In Russ.)
12. Federal Law No. 102 FZ of June 26, 2008 "On ensuring the uniformity of measurements". (In Russ.)
Экспрессные методики иммуноферментного определения содержания микотоксинов в зерне, кормах и орехах
Ключевые слова
иммуноферментный анализ; методика измерений; микотоксины; пищевые продукты; тест-система
Реферат
В статье рассмотрены вопросы контроля зараженности пищевой продукции микотоксинами, обладающими канцерогенными, мутагенными, гепатотоксическими свойствами и представляющими серьезную угрозу для здоровья людей. Описаны основные пути попадания микотоксинов в продовольственное сырье и продукты питания. Перечислены ограничения применимости хроматогра-фических методов анализа. Показаны преимущества использования иммуноферментного анализа (ИФА) для осуществления рутинных измерений содержания микотоксинов в пищевой продукции. Описан принцип измерений и представлена схема проведения ИФА. Перечислены основные производители тест-систем для проведения ИФА. Приведены аналитические характеристики (специфичность, предел определения, степень извлечения) наборов реагентов производства ООО «ХЕМА» (Москва) для иммуноферментного определения афлатоксина Br Т-2 токсина, зеара-ленона, охратоксина А, дезоксиниваленола (ДОН), фумонизинов
и В2 в зерне, кормах и орехах. Представлен перечень аттестованных методик измерений массовой доли афлатоксина Br Т-2 токсина, зеараленона, охратоксина А, дезоксиниваленола (ДОН), фумонизинов и В2 в зерне, кормах и орехах с помощью наборов реагентов производства ООО «ХЕМА». Рассмотрена процедура аттестации методик измерений, выполненная специалистами УНИИМ, с использованием стандартных образцов утвержденных типов состава растворов микотоксинов ГСО 7936 - 2001, ГСО 7940 - 2001, ГСО 7941 - 2001, ГСО 7942 - 2001 и ГСО 7944 - 2001, прошедших валидацию на Государственном вторичном эталоне единиц массовой доли и массовой (молярной) концентрации органических компонентов в жидких и твердых веществах и материалах на основе газовой и жидкостной хроматографии ГВЭТ 208 - 1 - 2016. Приведены метрологические характеристики разработанных и аттестованных методик измерений массовой доли афлатоксина B1, Т-2 токсина, зеараленона, охратоксина А, дезоксиниваленола (ДОН), фумонизинов B1 и В2 в зерне, кормах и орехах с помощью наборов реагентов производства ООО «ХЕМА». Предложена схема внедрения экспрессных иммуноферментных методик измерений содержания токсичных веществ с использованием наборов реагентов отечественного производства.
Авторы
Медведевских Мария Юрьевна,
Крашенинина Мария Павловна, канд. техн. наук,
Сергеева Анна Сергеевна, канд. хим. наук
Уральский научно-исследовательский институт метрологии,
620000, г. Екатеринбург, ул. Красноармейская, д. 4,
lab241@uniim.ru; krasheninina_m@uniim.ru; sergeevaas@uniim.ru
Шанин Илья Александрович,
Петухов Павел Александрович
ООО «ХЕМА», 105264, Москва, ул. 9-я парковая, д. 48, onco@xema.ru
Express methods for the immunoenzymatic determination of the content of mycotoxins in grain, feed and nuts
Key words
enzyme immunoassay; measurement procedure; mycotoxins; food products; test system
Abstracts
The article deals with the control of contamination of food products with mycotoxins which have carcinogenic, mutagenic, hepatotoxic effects and present a serious threat to human health. The main ways of mycotoxins routes into food ingredients and products are described. The limitations of the applicability of chromatographic analysis methods are listed. The advantages of the use of an enzyme immunoassay (ELISA) to carry out routine measurements of mycotoxin content in food products are shown. The ELISA measurement principle is described. The scheme for ELISA carrying out is presented. The main manufacturers of test systems for ELISA carrying out are listed. The article gives the analytical characteristics (specificity, detection limit, extraction ratio) of chemical reagent kits produced by XEMA CO., Ltd. for the enzyme immunoassay of content of aflatoxin B1, T-2 toxin, zearalenone, ochratoxin A, deoxynivalenol (DON), fumonisins B1 and B2 in crops, feed and nuts. The article presents the list of validated measurement procedures of mass fraction of aflatoxin B1, T-2 toxin, zearalenone, ochratoxin A, deoxynivalenol (DON), fumonisins B1 and B2 in crops, feed and nuts with the use of chemical reagent kits produced by XEMA CO., Ltd. The article also considers the order for validation of measurement procedures which was performed by the specialist of the Ural Scientific Research Institute for Metrology (UNIIM) with the use of approved type reference materials for composition of mycotoxins solutions GSO 7936 - 2001, GSO 7940 - 2001, GSO 7941 - 2001, GSO 7942 - 2001 and GSO 7944 - 2001. These reference materials were validated on the State secondary measurement standard of units of mass fraction and mass (molar) concentration of organic components in liquid and solid substances and materials based on gas and liquid chromatography GVET 208 - 1 - 2016. The article presents the metrological characteristics of the developed and validated measurement procedures of mass fraction of aflatoxin B1, T-2 toxin, zearalenone, ochratoxin A, deoxynivalenol (DON), fumonisins B1 and B2 in crops, feed and nuts with the use of chemical reagent kits produced by XEMA CO., Ltd. The article proposes a scheme for the implementation of rapid measurement procedures for enzyme immunoassay of content of toxic substances with the use of domestically produced reagent kits to monitory food safety at Russian enterprises.
Authors
Medvedevskih Maria Yuryevna,
Krasheninina Maria Pavlovna, Candidate of Technical Sciences, Sergeeva Anna Sergeevna, Candidate of Chemical Sciences Ural Scientific Research Institute for Metrology, 4, Krasnoarmeiskaya str., Ekaterinburg, 620075, lab241@uniim.ru; krasheninina_m@uniim.ru; sergeevaas@uniim.ru Shanin Ilya Alexandrovich, Petukhov Pavel Alexandrovich
LTD. XEMA, 9th Parkovaya, 48, Moscow, 105264, onco@xema.ru
