CC BY
118
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro HamoHa№Horo ymBepcurery BeTepHHapHOi MegnuUHH Ta 6i0TexH0H0riH iMeHi C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet6643
ISSN 2413-5550 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
y^K 574.6
Характеристика можливостей iмуноферментного аналiзу
Н.П. Шемедюк [email protected]
Львiвський нацюнальнийутверситет ветеринарно'1' медицини та бютехнологт iMeHi С.З. Гжицького,
вул. Пекарська, 50, м. Львiв, 79010, Укра'та
Розвиток бiотeхнологiй у сучасному ceimi е вирiшальним для розв 'язання першочергових завдань медицини, фармакологи, стьського господарства, екологи, рiзних галузей nромиcловоcmi, зокрема харчовоХ. Актуальною е розробка пiдходiв та заcобiв аналтичноХ бiоmeхнологiï iз застосуванням моноклональних антиты (МКА).
Забруднення кормiв тварин мжотоксинами, активне використання анmибакmeрiальних заcобiв, cmимуляmорiв росту у mваринницmвi, що забезпечуе сировиною харчову промиcловicmь, обумовлюе нeобхiднicmь впровадження оптимальних мemодiв аналтичного контролю якоcmi продукmiв харчування. Iншi важливi питання - дiагноcmика захворювань люди-ни, контроль стану довюлля. Вiдкриmmя МКА, iмунофeрмeнmного аналiзу (1ФА) е одними iз шляхiв виршення цих пи-тань. Порiвняно низька cобiварmicmь, нетривалий час виконання аналiзу, недороге обладнання дае можливicmь застосо-вувати 1ФА у рiзних сферах дiяльноcmi, мотивуе до вдосконалення.
Зробивши висновок щодо можливостей i застосування методу, надалi обговорюватимуться окрeмi його оcобливоcmi та наявт на ринках пропозицй щодо рeагeнmiв, обладнання 1ФА.
Knm4oei слова: метод 1ФА, методи до^дження, тест-система, чуmливicmь, cпeцифiчнicmь, контроль якоcmi, дiа-гностика, антитыа, антигени.
Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С.З. Гжицкого,
ул. Пекарская, 50, г. Львов, 79010, Украина
Развитие биотехнологии в современном мире имеет важное значение для решения вопросов медицины, фармакологии, сельськохозяйственной промышленности, экологии, других отраслей промышленности, в том числе пищевой. Актуальной является разработка подходов и средств аналитической биотехнологии с применением моноклональных антител
Загрязнение кормов микотоксинами, активное использование антибактериальных средств, стимуляторов роста в животноводстве, которое обеспечивает сырьем пищевую промышленность, обусловливает необходимость внедрения оптимальных методов аналитического контроля качества продуктов питания. Другие важные вопросы - диагностика заболеваний человека, контроль состояния окружающей среды. Открытие МКА, иммуноферментного анализа (ИФА) является одним из путей решения этих вопросов. Сравнительно низкая себестоимость, непродолжительное время выполнения анализа, недорогое оборудование дает возможность применять ИФА в различных сферах деятельности, мотивирует к совершенствованию.
Ключевые слова: метод ИФА, методы исследования, тест-система, чувствительность, специфичность, контроль качества, диагностика, антитела, антигены.
Citation:
Shemediuk N. (2016). Description possibilities of elisa. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 18, 2(66), 212-216.
Характеристика возможностей имуноферментного анализа
Н.П. Шемедюк [email protected]
(МКА).
Description possibilities of elisa
N. Shemediuk [email protected]
Lviv national university of veterinary medicine and biotechnologies named after S. Gzhytskyj, Pekarska Str., 50, Lviv, 79010, Ukraine
Development of biotechnologies in modern world is one of the pressing questions in medicine, pharmacology, agriculture, ecology progres, different spheras of industry in particular food. In fact, development of approaches and facilities of analytical biotechnology with application of monoklonal antibodies (MKA) are actual nowdays.
Contamination
of animal forages by mikotoxins, active using of antiinfectives, growthfactors in a stockraising (that provides raw material for foo d industry) stipulates thenecessity of introduction optimal methods of analytical control of foodstuffs quality. Diagnostics of man diseases, control of the environment state are other important questions. The MKA, ELISA are ways of decision these questions.Comparatively subzero prime price, short duration time of analysis implementation , an inexpensive equipment explains to perfection, gives an opportunity to apply ELISA-test in different spheres of activity.
Key words: ELISA, research methods, sensitiveness, specificity, control of quality, diagnostics,antibodies, antigens, testsystem.
Вступ
1ФА e офщшним методом контролю продукпв тваринництва у кра!нах £вросоюзу. Вперше цей метод застосовано у ricTOxiMU. Метод 1ФА чи ELISA-тест (enzyme linked immunoadsorbent assay - визначен-ня за допомогою iмуноcорбентiв, пов'язаних з ферментами) запропоновано у 1971 рощ Е. Енгвалл та Р. Перлманом для аналiзу фракцп iмуноглобулiнiв G. Незалежно ввд них Ван Веемен i Р. Шурс 1ФА досль джували естрогени (Engvall and Perlman, 1971). Методики ELISA кшьшсно та яшсно дають можливють щентиф^вати бюлопчш компоненти (гормони, фе-рменти, нейропептиди, продукти iмунноi системи, антигени тощо) за низьких концентрацш у зразку: 10-9-10-12 М (Samuilov, 1999).
Метою е характеристика можливостей 1ФА, порiв-няння чутливосп, cпецифiчноcтi, економiчноi' обгрун-тованоcтi альтернативних методiв дослвдження. За-вдання роботи: аналiз переваг i недолiкiв 1ФА, сфер застосування методу, порiвняння з iншими традицш-ними методами доcлiдження.
Деякi речовини, для иситифнкаци яких у продуктах
Використання у тваринництвi, птаxiвництвi й риб-ництвi гормональних активних cтимуляторiв росту й тиреоcтатикiв (табл. 1) негативно вщображаеться на здоров'! людини. Наприклад, вмicт у продуктах хар-чування cтильбенiв, стеро!дних гормонiв е причиною канцерогенезу, порушення статевого дозрiвання та репродуктивноcтi, а тиреостатики порушують функ-цiю щитовидно! залози й провокують алергш. Деякi катеxол-метаболiти спричиняють вiльнорадикальне окиснення ДНК у культурi клiтин й теcт-cиcтемi ла-бораторна тварина. Доведено токсичну, алергенну, мутагенну та онкогенну дiю на оргашзм людини i тварини гербiциду 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота. Значна кiлькicть речовин (табл. 1) мае ввддалеш ефек-ти: тератогенний, мутагенний, ембрiотокcичний, кан-церогенний. Для них характерною е iмуноcупреcивна д!я та вiдcутнicть cенcибiлiзуючиx властивостей. Так препарати не вiдразу руйнуються у печiнцi тварин, продукти !х трансформацй' зберiгаютьcя у м'ясних, молочних продуктах, шформащею про вмicт яких необхвдно володiти.
Таблиця 1
Групи речовин Речовини, яш можливо iдентифiкувати у продуктах тваринного походження 1ФА
Гормони тестостерон, 17ß-еcтрадiол, зеранол, кленбутерол, диетилстильбестрол, медроксипрогестерон, ацетилгестагени
Антимжробш речовини докcициклiн, фуразолiдон, фуралтодон, фурадошн, тетрациклши, стрептоцид, сульфагуашдин, cульфадiазин, cульфатiазол, сульфамеразин, нiтрофуран, сульфаметазин, левомщетин, сульфаме-токсазол, ампшилш, норсульфазол, cульфаметокcипiридазин, сульфадиметоксин, сульфахлорт-разин, бензилпенiцилiн, амокcицилiн, клоксацилш, стрептомщин, окситетрациклш
Мжотоксини афлатоксини, афлатоксин В1, фумошзин, токсин Т-2, деоксишваленол, афлатоксин М1, охратоксин А, зеараленон
Протипаразитичш препарати шермектин, фенбендазол
Пестициди синтетичш третро!ди, сим-триазини, 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота
1снують тест-системи 1ФА RIDASCREEN® (R-Biopharm, Шмеччина), призначенi для кiлькicного ви-значення концентрацй' свинини у харчових продуктах, тест-системи «Хема» (Роciя) - для визначення со!, араxicу, люового горixа, мигдалю, селери, глютену, грецького горixа, гiрчицi, риби, люпину, ракоподiбниx,
молюскiв. Тест-системи «Beacon Analytical Systems Inc.» (США); «Envirologix Inc.» (США); «Хема» (Рот) застосовують для визначення залишково! кшькосп шюдливих речовин у продуктах харчування.
Традицiйно контроль концентрацй ксенобютишв у продуктах харчування здшснюють фiзико-хiмiчними
Таблиця 3
методами анал1зу: газова, газорщинна i високоефек-тивна рщинна хроматографп. Цi методи досить ефек-тивнi для щентифжацй речовин. Позаяк, вони мають ряд ютотних недолiкiв - трудомiсткiсть, складнiсть, тривалють аналiзу, необхiднiсть використання дорогого устаткування i залучення висококвалiфiкованого персоналу (Oellerich, 1980; Harris et al., 1998). 1х собь вартiсть на 28% перевищуе вартiсть 1ФА. Аналiзуючи
Допустимi дози вмпсту деяких препаратов
табл. 2 i 3 можна зробити висновок про те, що чутли-вiсть ELISA не е нижчою, нгж чутливiсть хроматог-рафiчних методiв дослiдження i придатний до аналiзу залишку речовин у бiоматерiалi (Janovich, 2013; Ja-novich, 2014). Забруднення 1ж1, води й шших об'ектiв навколишнього середовища, що становить потенцiйну небезпеку, диктуе потребу в простих, недорогих, швидких методах дослiдження.
Таблиця 2
Гормональш препарати i стимулятори росту Допустима доза, мкг/кг (мкг/л) Мшмальна концентращя речовини, яку можливо визначи-ти у бiоматерiалi, ppb (мкг/кг чи мкг/л) 1ФА
диетилстильбестрол 0 0,1 (м'ясо); 2 (жовч); 0,2 (сеча); 2,5 (корм)
кленбутерол 0,1 (м'ясо) 0,5 (печшка, нирки) 0,05 (молоко) 0,2 (сеча); 0,04 (м'ясо, печшка); <0,5 (очне яблуко)
зеранол 0 0,5 (м'ясо); 1,5 (сеча)
тестостерон 0,5 (кров) 0,05 (м'ясо); 0,02 (кров)
17ß-естрадiол 0,04 (кров) 0,05 (м'ясо); 0,02 (кров)
гестагени (ацетоксипрогес-терон, медроксипрогестерон, мегестрол, хлоромадшон) 0 0,3 (жир)
Портняльна оцiнка чутливостi методш визначення залишкових кiлькостей
Назва методу ^жнародна абревiатура) Вмiст залишюв субстанцш/груп антимкробних препаратiв/ ppb (мкг/кг чи мкг/л)
хлорамфеш-кол штрофуран тетрациклши стрептомщин сульфатаазол метошдазол
Межi визна зна-чення min Межi визна-зна-чення min Межi визна-зна-чення min Межi визна-чення min Межi визна-зна-чення min Межi визна-зна-чення min
1ФА (ELISA) 0,10,15 0,1 0,20,5 0,5 3,05,0 5,0 3,05,0 5,0 2,03,0 2,0 0,10,2 0,2
Рiдинна хроматографа з масспектромет-ричним детектуван-ням (LC/MS/MS) 0,050,1 0,1 0,30,5 0,5 1,05,0 5,0 5,010,0 5,0 1,03,0 2,0 0,050,2 0,2
min - шшмальт значения вмiсту залишюв, визначення яких повиннi забезпечитиметоди.
Обов'язковими складовими лабораторно! дiагнос-тики iнфекцiйних захворювань е класичнi методи видiлення збуднишв на вiдповiдних поживних сере-довищах або у бiосистемах з !х iдентифiкацiею та визначення приросту специфiчних аититiл у серолоп-чних реакцiях (реакцп нейтралiзацil, гальмування гемаглютинацп, зв'язування комплементу, преципгга-цй' та ш). Як правило, цi методи пролонговаш у часi. Розвиток захворювання потребуе визначеностi вщно-сно етюлогп у бшьш стислий термiн (Oellerich, 1980; Harris et al., 1998; Trohimchuk et al., 2012).
Використовуючи антитша до специфiчноl мiшенi, можна виявити незначнi кiлькостi антигенiв чи анти-тiл у бiологiчних рiдинах (плазма та сироватка кровi, сеча, слина, молоко тощо), якi з'являються в органiзмi людини пвд час вiрусного або бактерiального захво-рювання, проаналiзувати показники онкомаркерiв, цитокiнiнiв, факторiв росту, гормошв (Oellerich,
1980). 1ФА тест-системи, наприклад, «Vitrotest» (Укра1'на), «DRG Diagnostics» (Нiмеччина) призначенi для виявлення антитш до аскарид, лямблiй, exiHOKOKiB та шших паразипв, вiрусу герпесу 1-го та 2-го титв, цитомегаловiрусу людини, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, а також для вивчення репроду-ктивно! та тиреовдно! функцп, дiагностики раку, дiа-бету, аутоiмунних захворювань людини.
Серед онкомаркерiв у практицi найкраще вивче-ний i широко застосовуеться альфа-фетопроте1'н (АФП) (наприклад, тест-системи ТОВ «Бест Дiагнос-тик» (Укра!на). Збшьшенння концентрацп АФП i хорiонiчного гонадотрошну людини може сввдчити про наявшсть пухлин яйник1в. Значне пiдвищення раково-ембрюнального антигену спостерiгаеться в 70 - 75% хворих на рак кишково-шлункового тракту, тдшлунково! залози, легень, у 50% хворих на рак грудно! залози, тша матки. При пiдозрi на рак перед-
мixуровоi залози необхвдним е визначення рiвня прос-татичного cпецифiчного антигену (Dovgich et al., 2015).
Диагностику 1ФА бажано паралельно проводити з шшим сучасними методом молекулярно! бiологii полiмеразною ланцюговою реакцieю (ПЛР). Методи ПЛР та 1ФА взаемно доповнюють один одного. 1ФА базуеться на виявленш не збудника шфекцп, а його продуктiв життeдiяльноcтi - бiлкiв-маркерiв, тому пicля захворювання 1ФА може cвiдчити хибний пози-тивний результат, що заперечить метод ПЛР. За до-помогою ПЛР у бiоматерiалi дослвджують наявнicть
ДНК шфекцшних агентiв, можливе виявлення ДНК неживих органiзмiв пicля лiкування - хибний результат, який може заперечити 1ФА. Переваги 1ФА в пм, що cинтезованi антитiла виявляються у кровi незале-жно вiд мюця локалiзацii збудника. Зразок для аналiзу ПЛР не завжди можна отримати ¡з мicця локалiзацil збудника захворювання.
На сьогодшшнш день 1ФА - це найб№ш ушвер-сальний, шформативний, економiчний метод досль дження та дiагноcтики, що доводить порiвняльна табл. 4.
Порiвняння основних лабораторних методiв дослiдження бюлопчного матерiалу
Таблиця 4
Характеристика П1Ф 1ФА Бактерюлопчний ПЛР
Чутливють 80-95% 95% 80-100% 95-100%
Специфiчнicть 80-95% 96-99% 100% 95-100%
Потреба у спещальному обладнанш Люмшесцентний мжроскоп Комплект для 1ФА Центрифуга, дотри-мання умов культиву-вання Амптфжатор, обладнання для електрофорезу
Тривалють виконання 2-3 год. 1,5-3 год. 2-14 дiб 4,5-8 год.
Читання результата Суб'ективне, втомливе Об'ективне, просте Суб'ективне, помiрно втомливе Об'ективне, про-сте
Собшартють Висока Низька Висока Висока
Автоматизащя Неможлива Можлива Неможлива Можлива
Недолiки Наявшсть власно1 флюоресце-нци мiкроорганiзмiв, перехре-сних iмунологiчниx реакцш, неcпецифiчне фарбування матерiалу мiченими iмунореа-гентами. Можливе виявлення антигешв неживих органiзмiв Позитивнi резуль-тати пicля лжу-вання Висока cобiвартicть, трудомicткicть. Скла-дтсть транспортуван-ня, збереження мате-рiалу Висока cобiвар-■псть. Можливе виявлення ДНК неживих оргашз-мiв
Переваги Задовшьна доcтовiрнicть результату за невисоко1 cобiвар-тоcтi Не залежить вiд локалiзацil шфекцп Виявляе тiльки живi мiкроорганiзми Низька cуб'eктивнicть
У порiвняннi з шшими методами дослвдження (прямою iмунофлуориcценcieю (П1Ф), бактерюлопч-ним, ПЛР) значення cпецифiчноcтi i чутливоcтi 1ФА близьке до 100% (Levchuk et al., 2008; Dovgich et al., 2012; Zagrebel'nyj et al., 2015). Специфiчнicть тест-систем рекомбшантного типу найвища. Виконання методу, аналiз результата можуть бути автоматизо-ваними, що зменшить ймовiрнicть помилки у насль док, так званого, людського фактору, суб'ективносп.
Будь-яку речовину, яка володie властивостями антигену, можна кшьшсно визначити 1ФА. Для прове-дення цього методу необxiдно мати очищений антиген, cпецифiчне антитiло, фермент як мггку для антигена чи антитша i заciб реестраци активноcтi фермента (спектрофотометр). yci компоненти е складовими тест-систем (дiагноcтикумiв), можуть бути стандар-тизованими. Виконання реакцш методично просте й легко контролюються. Для проведення 1ФА викорис-товують автоматичнi та напiвавтоматичнi аналiзато-ри, перевагами яких е: зручшсть у роботi, швидк1сть, об'eктивнicть за рахунок автоматизацii облiку результата, висока cпецифiчнicть та чутливicть, можливють виконання великоi кiлькоcтi аналiзiв. Автоматизована ощнка реакцiй дозволяе стандартизувати метод. Основою 1ФА е cпецифiчна взаeмодiя антитiла з антигеном, при цьому один з компонента кон'югованих з
ферментом, в результата реакцп з ввдповвдним хромо-генним субстратом утворюе забарвлений продукт. Для створення тест-систем необxiдно вирiшити за-вдання, що пов'язанi з отриманням антигена, антип-ла, адсорбованих на твердш фазi; комплексу антиген чи антитшо з ферментом (кон'югат). Необхвдно пщб-рати фермент, який довгий час збертатиме актив-нicть, володггаме високою cпецифiчнicтю до субстрату. З вище вказаною метою у дiагноcтикумаx викори-стовують пероксидазу хрону, лужну фосфатазу та ß-галактозидазу Escherichia coli (Oellerich, 1980; Samu-ilov, 1999).
Висновки
Основними перевагами 1ФА порiвняно з шшими методами аналiзу е екcпреcивнicть та висока ввдтво-рюванicть; вiдcутнicть потреби у спещальному обла-днаннi та додатковому його обслуговуваннц висока чутливicть i cпецифiчнicть; аналiз великог' кiлькоcтi зразк1в можна провести вручну або автоматизовано; низька cобiвартicть; немае необxiдноcтi у спещальних навиках персоналу в роботi з проведенням аналiзу; можливicть стандартизацп методу.
Перспективи подальших дослгджень. Сьогодш метод 1ФА використовуеться для визначення широкого
спектру речовин: гормошв, онкомаркерiв, лiкарcькиx препаратiв у рiзниx бюлопчних субстратах; наркотиков, бактерiй, вiруciв i антитiл до них; для дослвджен-ня продуктiв тваринного, рослинного походження. £ можливicть проводити дослщження i виявляти зали-шкову шльшсть речовин у продуктах харчування, що сприятиме контролю ix безпеки.
Зробивши висновок щодо можливостей i застосу-вання методу, надалi обговорюватимуться окремi його особливосп та наявнi на ринках пропозици щодо реагентiв, обладнання 1ФА.
Бiблiографiчнi посилання
Engvall, E., Perlman, P. (1971). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8, 871-874. Harris, A.S., Wengats, I., Wortberg, M., Kreissig, B., Gee, S.J., Hammock, B.D. (1998). Development and application of immunoassey for biologycal and environmental monitoring. Multiple Stresses in Ecosystems. Washington: Lewis Publishers. 135-153. Oellerich, M. (1980). Enzyme immunoassay in clinical chemistry. Present status and trends. J. Clin. Chem. Biochem. 18, 197-208. Dovgich, T.A., Mechev, D.S., Shherbina, O.V., Starchak, N.M., Ovcharenko, V.l. (2015). Rol' radioimunologichnogo analizu u klinichnij praktici. Ukrains'kij radiologichnij zhurnal. T. HHIII. 3, 55-57 (in Ukrainian).
Zagrebel'nyj, V.O., Petrenko, O.S., Aleksjejeva, G.B. (2015). Ocinka chutlyvosti imunofermentnogo analizu dlja diagnostyky enzootychnogo lejkozu velykoi' rogatoi' hudoby. Veterynarna medycyna Ukrai'ny. 3(229), 9-12 (in Ukrainian). Levchuk, I.V., Kishhenko, V.A., Golubec', O.V. (2008). Udoskonalennja tehnologii' procesu vyznachenn pestycydiv v nasinni olijnyh kul'tur metodom imunofermentnogo analizu. Harchova promyslovist'. 7, 25-28 (in Ukrainian). Samuilov, V.D. (1999). Imunofermentnyj analiz. Sorosovskij obozrevatel'nyj zhurnal. 12, 9-15 (in Russian).
Trohimchuk, T.Ju., Ganova, L.O., Ivans'ka, N.V., Maksimenok, O.V., Ribalko, S.L. (2012). Viznachennja chutlivosti test-sistemi dlja diagnostiki VIL za mizhnarodnimi standartami i v kul'turah klitin, zarazhenih VIL. Laboratorna diagnostika. 4(62), 2730 (in Ukrainian). Janovich, D.V. (2014). Vpliv rozvitku suchasnih tehnologij v galuzi harchovoi' analitiki na riven' svitovih vimog do pokaznikiv jakosti ta bezpeki medu. «Proizvodstvennaja laboratorija». 1(52), 20-23 (in Ukrainian).
Janovich, D.V. (2013). Koncentruvannja zalishkiv an-tibiotikiv v molochnih produktah glibokoi' pererobki. Molochnoe delo. 5, 29 (in Ukrainian).
Cmammn nadium^a dopeda^ii 19.09.2016
