CC BY
36
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 616-006.487-085.373]-092.9
Сосновцева А.О.1, Каршиева С.Ш.2, Смирнова Г.Б.2, Борисова Ю.А.2, Лебединская О.В.3, Шубина И.Ж.2, Трещалина Е.М.2, Чумаков П.М.4, Чехонин В.П.1'5
чувствительность перевиваемой нейробластомы человека
К ОНКОЛИТИчЕСКОМУ ВИРУСУ КОКСАКИ А7
1 ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, 117997, г. Москва, Россия;
2 ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России,115478, г. Москва, Россия;
3 ФГБОУ ВО «Пермский государственный медицинский университет им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России, 614990, г. Пермь, Россия
4 ФГБУ «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» Российской академии наук, 119991, г. Москва, Россия;
5 ФГБУ «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского» Минздрава России, 119034, г. Москва, Россия;
Онколитическая виротерапия - перспективный подход в таргетной терапии злокачественных новообразований. В данной работе исследован терапевтический потенциал непатогенного вируса Коксаки А7 с нейро-тропными свойствами на модели нейробластомы (НБ) человека.
Цель исследования: изучение чувствительности in vitro/in vivo НБ человека (из линии клеток JMR-32) к действию вируса Коксаки А7 (CVA7). Задачи - определение цитолитической активности CVA7 на верифицированных цитоморфологически клетках НБ в тесте in vitro и оценка динамики роста подкожных (п/к) ксе-нографтов НБ у мышей-самцов Balb/c nude под действием CVA7 при многократном внутривенном введении. Материал и методы. Исследования выполнены с CVA7, наработанным в клетках линии-продуцента С-33А. Культуру клеток и штамм перевиваемой НБ (JMR-32) получали из коллекции РОНЦ. Цитоморфологическую верификацию НБ и определение цитолитической активности CVA7 выполняли с помощью стандартных куль-туральных методов и критериев ТЦД5(, IC. Опыты in vivo выполнены на иммунодефицитных мышах-самцах Balb/c nude разведения и содержания РОНЦ с развившимися к 6-му дню до Vcp = 79-82 мм3 п/к ксенограф-тами НБ. Лечение CVA7 в разовой дозе 1'1(8 клеток/мышь проводили внутривенно трехкратно (через 72 ч) с оценкой эффективности по стандартному критерию Т/С < 42% и контролем скорости роста опухоли (V/V() в динамике. Статистическую значимость различий проводили в компьютерной программе Exel для Windows 2((7 с использованием t-теста при p < (,(5.
Результаты. Цитолитический эффект CVA7 на клетки НБ регистрируют на уровне исходной линии-продуцента С-33А ТЦД = (,99'Ю-4 БОЕ/кл, а IC5( = 1,11'Ю-4БОЕ/кл, а уровень репродукции вируса в клетках НБ через 48 и 72 ч на 2 и 1,5 порядка выше, чем в клетках линии-продуцента. Ингибирующее действие CVA7 на рост больших п/к ксенографтов НБ реализуется после введения в/в первой дозы на минимальном уровне Т/С = 67% (критерий < 42%) на фоне уменьшения скорости роста опухоли в 1,5 раза и отмены ранней гибели мышей, на 22-й день, тогда как в группе нелеченного контроля - на 15-й (n = 8).
Заключение. Полученные данные позволяют считать НБ человека (JMR-32) in vitro/in vivo слабочувствительной к онколитическому действию CVA7. Для получения значимого результата in vivo следует начинать лечение при двукратно меньших опухолях и увеличенной первой дозой онколитического препарата.
Ключевые слова: онколитический вирус; вирус Коксаки А7; нейробластома человека; чувствительность in vitro/in vivo.
Для цитирования: Сосновцева А.О., Каршиева С.Ш., Смирнова Г.Б., Борисова Ю.А., Лебединская О.В., Шубина И.Ж., Трещалина Е.М., Чумаков П.М., Чехонин В.П. Чувствительность перевиваемой нейробластомы человека к онколитическому вирусу Коксаки А7. Российский онкологический журнал. 2017; 22(2): 158-163. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1028-9984-2017-22-2-158-163 Для корреспонденции: Сосновцева Анастасия Олеговна, аспирант кафедры медицинских нанобио-технологий, E-mail: aososnovtceva@gmail.com.
SosnovWeva A.O.1, Karshieva S.Sh.2, Smirnova G.B.2, Borisova Yu.A.2, Lebedinskaya O.V.5, Shubina I.Zh.2, Treshali-naH.M.2, Chumakov P.M.4, Chekhonin V.P.13
SENSITIVITY OF THE TRANSPLANTED HUMAN NEUROBLASTOMA TO ONCOLYTIC COXSACKIE A7 VIRUS
1 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, 117997, Russian Federation;
2 N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow, 119034, Russian Federation;
3 V.P. Serbsky Federal Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology, Moscow, 115478, Russian Federation;
4 Engelhardt Institute of Molecular Biology of Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991, Russian Federation;
5 E.A. Wagner Perm State Medical Academy, Perm, 614990, Russian Federation
Oncolytic viral therapy is a promising approach to targeted therapy of malignant tumors. In this article we consider
the therapeutic potential of a non-pathogenic Coxsackie A7 virus (CA7V) with neurotropic properties on a model of
human neuroblastoma.
Purpose to study in vitro/in vivo sensitivity of human neuroblastoma HNB (from cell line JMR-32) to Coxsackie virus
A7 (CA7V). Objectives: еvaluation of cytolytic activity in vitro on NB cells verified by cytomorphology and assess-
ment of dynamics of the growth of subcutaneous neuroblastoma xenografts in Balb/c nude male mice exposed to CA7V
multiple i.v. injections.
BASIC RESEARCH - PRACTICAL MEDICINE
Material and methods. CA7V was produced in the cells of line-producer C-33A. Cell culture and the strain of transplanted NB (JMR-32) were obtained from the Collection of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center. Cytomorphologic verification of neuroblastoma and CA7V cytolytic activity were executed with the use of standard cultural methods, TCID50 and IC50criteria. Experiments «in vivo» were performed on immunodeficient Balb/c nude male mice bred and reared in the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center. The experiments were made at day 6 when neuroblastoma subcutaneous xenografts developed to the Vmean = 79-82 mm3 by day 6. The treatment with CA7Vat the i.v. single dose of 1x10s cells per mouse was performed 3 times with 72-hours intervals; evaluation of the efficacy was made according to standard criterion T/C < 42%; and control of the tumor growth rate (V/V) in the dynamics. Statistical assessment was made with the software Excel for Windows 2007 with the use of T-test under p < 0.05.
Results. Cytolytic effect of CA7V on neuroblastoma cells was registered similar to basic parameters of the original line-producer C-33A: TCID50 = 0.99^1Q-4pfu/cell, andIC50 = 1.11x10-4pfu/cell; 48 and 72 hours after virus reproduction in NB cells the rate was 2.0 and 1.5-fold higher than in the line-producer cells. CA7Vinhibiting effect on the growth of large subcutaneous neuroblstoma xenografts is registered after the first i.v. injection at the minimal level of T/C = 67% (criterion < 42%) with the 1.5-fold decrease of the tumor growth rate and cancellation of early mice death by day 22 vs day 15 in the control group of untreated mice (n = 8).
Conclusion. The obtained results allow to consider human neuroblastoma (JMR-32) to possess the low sensitivity to oncolytic effect of in vitro/in vivo. In order to obtain significant effect in vivo the treatment should be started in mice with 2-fold smaller tumors and a higher initial dose of the oncolytic agent.
Keywords: oncolytic virus; Coxsackie A7 virus; human neuroblastoma; sensitivity in vitro/in vivo.
For citation: Sosnovtceva A.O., Karshieva S.Sh., Smirnova G.B., Borisova Yu.A., Lebedinskaya O.V., Shu-bina I.Zh., Treshalina H.M., Chumakov P.M., Chekhonin V.P. Sensitivity of the transplanted human neuroblastoma to oncolytic Coxsackie A7 virus. Rossiiskii onkologicheskii zhurnal. (Russian Journal of Oncology). 2017; 22(3): 158-163. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/1028-9984-2017-22-3-158-163 For correspondence: Anastasiia O. Sosnovtceva, MD, PhD-student of the Department of Medical Nanobio-technology of the Medical Biological Faculty of the N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, 117997, Russian Federation. E-mail: aososnovtceva@gmail.com. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The work was supported by the RSF (grant №14-14-00882).
Received 23 November 2016 Accepted 22 December 2016
Нейробластома (НБ) - одна из наиболее распространенных солидных опухолей у детей. Лечение больных НБ группы высокого риска имеет ограниченную эффективность и неблагоприятный прогноз [1]. Это обусловливает необходимость разработки новых стратегий лечения НБ. В последние годы идет активная разработка различных подходов таргетной терапии опухолевых заболеваний. Один из таких подходов - онколитическая виротерапия (ОВТ), которая использует различные репликативно-компе-тентные вирусы, способные напрямую лизировать опухолевые клетки и в некоторых случаях активировать иммунную систему. В качестве перспективных кандидатов для ОВТ НБ изучают как ДНК-, так и РНК-содержащие вирусы [2-5]. Использование РНК-содержащих вирусов имеет несколько терапевтических преимуществ: отсутствие генотоксично-сти, так как эти вирусы реплицируются в цитоплазме; кроме этого, в ходе инфицирования клеток они сразу индуцируют стойкие цитолитические изменения, также они не несут онкогены, которые могут привести к онкогенезу и быть легко генетически изменены с помощью методов обратной генетики [6].
В качестве перспективных кандидатов для противоопухолевой терапии рассматривают мелкие РНК-содержащие одноцепочечные энтеровирусы (Enterovirus) с высоким онколитическим потенциалом, например вакцинные и рекомбинантные штаммы полиовирусов, Coxsackie А21 и В3, ECHO 1 и 7 [2, 7-11]. Вирус Коксаки А7 (Human coxsackievirus A7 strain Parker, GenBank AY421765, CVA7) (вид Enterovirus A, семейство Picornoviridae) in vivo проявляет миотропные и нейротропные свойства, а при инфицировании человека вызывает полиомие-
литоподобные симптомы [12, 13]. В СССР в 19601970-х годах выделен непатогенный штамм CVA7, на его основе получена одна из живых энтеровирус-ных вакцин (ЖЭВ-8), которая в дальнейшем была апробирована для профилактики респираторных и энтеровирусных заболеваний более чем у полумиллиона человек. Также для нее была исследована возможность лизиса злокачественных клеток у ряда онкологических больных с исчерпанными возможностями лечения [7, 14, 15]. Проведенные исследования позволяют считать CVA7 из ЖЭВ-8 одним из перспективных энтеровирусов для изучения на модели НБ человека в качестве нового безопасного авирулентного онколитического таргетного средства с естественной нейротропностью. Соответственно сформулированы цель и задачи исследования.
Цель исследования - изучение чувствительности in vitro/in vivo НБ (из линии клеток JMR-32) к действию вируса Коксаки А7 (CVA7).
Задачи исследования - определение цитолитиче-ской активности CVA7 на верифицированных цито-морфологически клетках НБ в тесте in vitro и оценка динамики роста подкожных (п/к) ксенографтов НБ у мышей-самцов Balb/c nude под действием CVA7 при многократном внутривенном введении (в/в).
Материал и методы
Тестируемый агент. Вирус CVA7 нарабатывали в клетках HPV-негативной карциномы шейки матки человека С-33А (ATCC, HTB-31). После микроскопической констатации 100% гибели клетки вместе с вируссодержащей средой лизировали трехкратным замораживанием-оттаиванием и осветляли центрифугированием, полученный супернатант исполь-
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ
зовали в тесте in vitro. Для экспериментов in vivo в течение 2 ч проводили концентрирование вирусного препарата на ультрацентрифуге при 45 000 об/мин (ротор угловой, TLA-100.3, BeckmanCoulter, USA), супернатант удаляли, осадок растворяли ресуспен-дированием в стерильном физиологическом растворе («ПанЭко», Россия). Вирусный титр определяли стандартным методом бляшек и выражали в БОЕ/мл (бляшкообразующие единицы). Полученный стоковый раствор вируса хранили при -20 °C. В день введения животным стоковые растворы размораживали и готовили аликвоты для внутривенного (в/в) введения (Ь108 Б0Е/200 мкл физиологического раствора) с помощью индивидуальных стерильных пластиковых шприцов. Введение CVA7 после трансплантации опухоли выполняли трехкратно с интервалом 72 ч (6-е, 9-е и 12-е сутки) в разовой дозе Ь108 Б0Е/200 мкл физраствора, курсовая доза 3^108 БОЕ/мышь.
Опухолевая модель. Линия клеток эстроген- и андроген-независимой перевиваемой НБ (JMR-32) и опухолевый штамм для п/к трансплантации получены из коллекции опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина [16]. Для культурального теста клетки НБ размораживали при 37 °C в водяной бане 3-5 мин, осаждали центрифугированием при 1000 об/мин 5-7 мин и переносили во флаконы площадью 25 см2 с ростовыми средами RPMl-1640 и DMEM, содержащими 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), а также в смесь этих сред в соотношении 1:1 с целью выбора оптимальных условий для наращивания клеточной массы. Клетки культивировали в инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO2. Заменяли среду на свежую на следующие сутки после размораживания и далее в процессе роста клеток через каждые 3 сут. Пересев культуры осуществляли при достижении клетками плотного монослоя один раз в 3 дня. Получение донорского опухолевого материала НБ выполняли на мышах-самцах Balb/c nude на мышь (n = 2) разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина при трехкратном пассировании: 0 пассаж 5^106 клеток, 1-й и 2-й пассажи - по 50 мг взвеси опухолевой ткани на мышь.
Оценка результатов in vitro. Для анализа вирус-нойрепликациимонослой клетокв24-луночныхплан-шетах инфицировали вирусом в дозе 0,001 БОЕ/кл и инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Несвязав-шийся вирус удаляли, клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером и содержали в ростовой среде с 2% ЭТС. Через 0; 24; 48 и 72 ч клетки в ростовой среде лизировали с помощью 3 циклов замораживания-оттаивания. Жидкость с лизированными клетками очищали низкоскоростным центрифугированием и использовали для определения стандартного показателя 50% тканевой цитотоксической дозы (ТЦД/мл) на линии-продуценте С-33А методом Рида-Менча. Уровень вирусной репродукции в клетках определяли каждые 24 ч в течение 72 ч. Определение чувствительности клеток к CVA7 in vitro проводили в диапазоне концентраций от W07 до 1-101 БОЕ/мл с помощью Cell Titer 96 A Queous One Solution Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS-тест, Promega), как описано ранее [17]. Результаты представляли в процентах от неинфицирован-ного контроля. Поскольку тестированный вирусный материал рассматривали в качестве потенциального противоопухолевого средства, чувствительность клеток к CVA7 определяли по концентрации, способ-
ной уменьшить пролиферацию клеток на 50% (50% ингибирующая концентрация, IC,^, используемой для противоопухолевых агентов. Показатель рассчитывали методом регрессионного анализа (данные MTS-теста и графика «доза-ответ»).
Оценка результатов in vivo. Лечение в группе ОВТ вирусом CVA7 проводили трехкратно, на 6-е, 9-е и 12-е сутки после трансплантации опухоли; в группе КРО мыши получали физраствор в те же сроки. Исходный объем опухоли составил V0 = 79 ± 46 мм3. Начало введения (48 ч после трансплантации опухоли) связано с завершением аваскулярной стадии ангиоге-неза и обеспечением биодоступности агента к клеткам, в том числе при внутривенной терапии. В обеих группах измеряли опухолевые узлы трехкратно до проведения инъекции и на 3-и сутки после окончания трехкратного курса ОВТ. Для измерений использовали штангенциркуль (Mitutoyo, Япония), соединенный USB-портом со статистической программой Exel. С помощью нее рассчитывали индивидуальные и средние объемы (средняя арифметическая V0, V ), стандартное отклонение (standard deviation, s. d.)- и Ttest. По полученным данным определяли стандартный показатель эффективности T/C% (treatment/control) как соотношение средних объемов опухолей в сравнении с группой контроля роста опухоли (КРО), критерий T/C < 42% [18]. Кроме того, рассчитывали скорость роста опухолей в каждой группе как соотношение Vt1-3/V0 и Ttest в сравниваемых группах. Сформированная таким образом база данных была первичным документом эксперимента. В таблицах приведено стандартное отклонение, при построении графиков -разброс с учетом доверительного интервала средней арифметической величины.
Результаты исследований in vitro/in vivo статистически обработали с оценкой достоверности различий приp < 0,05.
Завершение эксперимента на животных. После окончания опыта выживших на 23-е сутки опыта мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза. Трупы павших и умерщвленных мышей подвергали аутопсии и кремировали в специализированном подразделении с учетом международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложенных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», ЕЭС, Страсбург (1985) [19, 20].
Результаты
Цитологическая верификация нейробластомы человека HB (JMR-32). При цитоморфологическом исследовании показано, что клетки НБ человека (IMR-32) 9-го пассажа имеют большие размеры, округлую или неправильную форму. Контуры клеток неровные - от тела клетки распространяются многочисленные псевдоподии и мелкие выросты. Ядра округлые, овальные или бобовидной формы с вдавлениями. В некоторых клетках наблюдают нарушение целостности ядерных мембран. У отдельных клеток ядра фрагментированы. Содержимое ядер неоднородное. В них на фоне эухроматина выявляют плотные глыбки хроматина разной величины, неправильной формы и округлые образования, похожие на ядрышки. Глыбки хроматина иногда выходят за
-о- НБ (Л\/1Р1-32) -д- Линия-продуцент (С-ЗЗА)
Рис. 2. Определение жизнеспособности клеток нейробластомы человека (JMR-32) и линии-продуцента (С-33А) в MTS-тесте через 72 ч после заражения СУА7.
91
8Ч 7"
Д 6-
о
ю 5- 21 -
О- ....
О 24 48 72
Часы после инфекции □ НБ (Л\ЛР-32) Ц Линия-продуцент (С-ЗЗА)
Рис. 3. Динамика вирусной репродукции СУА7 в клетках нейробластомы человека и линии-продуцента (метод Рида и Менча).
BASIC RESEARCH - PRACTICAL MEDICINE
Таблица 1
Динамика роста подкожных ксенографтов нейробластомы человека у мышей-самцов Balb/c nude без лечения (группа КРО)
№ мыши, Средний объем опухоли после трансплантации*, мм3
показатели 6-е, 9-е и 12-е сутки 15-е сутки
V0 V„ VÍ2
6 9 12 15
1 19 27 36 405
2 113 478 1024 3740
3 79 414 1122 2470
4 84 280 630 1496
5 64 330 745 2755
6 72 247 499 499
7 190 711 1346 842
8 27 193 378 822
9 90 526 1914 Пала от опухоли
10 48 120 265 Пала от иммунодефицита
11 78 429 998 Пала от иммунодефицита
V ср. 79 341 814 1629
Стандартное отклонение 46 196 539 1224
Т/С, % 100 100 100 100
Vt/V0 1,0 4,3 10,3 20,6
Примечание: * - измерение опухолевых узлов проводили до начала инъекций физраствора (¥0), после каждой инъекции (V. и ¥„) и затем соответственно 3 сут после окончания введения ОВТ (V ); период наблюдения 6-22 сут, гибель мышей от опухоли зарегистрирована с 15-х суток после трансплантации.
пределы ядра. Заметно разделение цитоплазмы на участки, прилегающие к ядру (эндоплазма), и периферические зоны (эктоплазма). Эндоплазма более базофильная, эктоплазма светлая, вуалевидная. Характер и эндо- и эктоплазмы неоднородный - вакуо-лизированный (рис. 1, см. 4-ю полосу вклейки).
Тестирование in vitro. Результаты MTS-теста представлены на рис. 2. Видно, что для CVA7 ТЦД = 0,99^10-4 БОЕ/кл, а IC^ = 1ДЫ0-4 БОЕ/кл. Это свидетельствует о высокой и сравнимой чувствительности к вирусу клеток НБ и исходной линии-продуцента С-33А в тестах in vitro. Способность CVA7 реплицироваться в чувствительных клетках представлена на рис. 3. Как видно, CVA7 способен размножаться в клетках НБ (JMR-32), так же как и в клетках линии-продуцента, в течение 72 ч, причем уровень репродукции вируса в клетках НБ через 48-72 ч на 2 и 1,5 порядка соответственно выше, чем в клетках линии-продуцента. Таким образом, в экспериментах in vitro вирус CVA7 показал активность в отношении клеток НБ (JMR-32), превышающую уровень активности в клетках, используемых для его наработки.
Тестирование in vivo. Показано, что п/к ксено-графты НБ без лечения (группа КРО) растут чрезвычайно быстро: от 6 до 15 сут после трансплантации опухолевые узлы увеличились от V0 = 79 ± 46 до V3 = 1629 ± 1224 мм3, VJV = 20,6. Это свидетельствует
об агрессивном характере модели. На 9-15-е сутки после трансплантации скорость роста соответствовала кинетике штамма: V 3 = 4,3-20,6 соответственно. Гибель мышей от опухоли зарегистрирована, начиная с 15-х сут опыта (табл. 1).
2
ш
ю о
>5 X
с£ си а. U
600-, 500400 300200100
Т/С=67%
CVA7 1x108 вирусных частиц на мышь
6 9
Сутки после трансплантации опухоли
Ц КРО □ ОВТ
Рис. 4. Ингибирование роста подкожных ксенографтов нейробластомы человека после первой внутривенной инъекции 108 вирусных частиц/мышь СУА7.
Здесь и на рис. 5: КРО - группа без лечения; ОВТ - группа, получающая вирус Коксаки А7.
ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ
I "
1 5
2 4 2 о
I° 1 О 1 а
Я О
О
КРО
ОВТ
Рис. 5. Скорость роста подкожных ксенографтов нейробластомы человека у мышей Balb/c nude контрольной и опытной групп через 9 сут после имплантации (через 3 дня после начала терапии).
В группе ОВТ, получавшей СУЛ7 п/к ксенографты НБ росли от 6-х до 22-х суток опыта с такой же скоростью и увеличились от V = 82 ± 39 до V = 6692 ± 2126 мм3, VJV = 81,2. Оценка эффективности ин-гибирования роста опухоли в группе ОВТ в динамике показала, что слабый недостоверный эффект на уровне Т/С = 67% (Ttest = 0,28) наступал только после 1-й инъекции (рис. 4), а после 2-й и 3-й инъекций эффект практически отсутствовал, Т/С = 94-107 (Ttest = 0,83-0,98).
Анализ скорости роста в группе ОВТ показал, что после первой инъекции на 9-е сутки скорость роста ксенографтов (V V) была в 1,5 раза ниже, чем в кон-
Таблица 2
Динамика роста подкожных ксенографтов нейробластомы человека у мышей-самцов Balb/c nude в процессе и после трехкратного курса внутривенных инъекций CVA7 в разовой дозе 108 вирусных частиц/мышь (группа ОВТ)
№ мыши, показатели Средний объем опухоли, мм3
V, V, V,
0 и 12 t3
1 110 341 1073 2093
2 144 259 374 1218
3 63 84 379 572
4 27 100 301 1250
5 93 732 2096 3220
6 36 59 554 1217
7 94 90 734 2156
8 89 177 609 2218
V ср. 82 230 765 1743
Стандарт- 39 225 592 834
ное откло-
нение
Т/С, % 104 67 94 107
Ttest - 0,28 0,86 0,83
V/V t 0 1,0 2,8 9,3 21,3
Примечание. Введения выполняли на 6-е, 9-е и 12-е сутки после трансплантации опухоли Измерение опухолевых узлов проводили до проведения каждой инъекции ОВТ и на 3-и сутки после окончания курса лечения; гибель мышей от опухоли зарегистрирована на 22-е сутки после трансплантации.
троле: 2,8 и 4,3 соответственно (рис. 5). Начало гибели мышей от опухоли зарегистрировано на 5 дней позже - 22-е сутки после трансплантации (табл. 2).
Заключение
Проведенные исследования показали, что вирус CVA7 проявляет определенный цитолитический эффект по отношению к клеткам НБ (JMR-32), ТЦД = 0,99^10-4 БОЕ/кл, IC50 = 1ДЫ0-4 БОЕ/кл. При этом уровень репродукции вируса в опухолевых клетках через 48 и 72 ч на 2 и 1,5 порядка выше, чем в клетках линии-продуцента.
Ингибирующее действие CVA7 на рост развившихся п/к ксенографтов НБ реализуется после введения в/в первой дозы на минимальном уровне Т/С = 67% (критерий < 42%) на фоне уменьшения скорости роста опухоли в 1,5 раза и отмены ранней гибели мышей - на 22-е и 15-е сутки в группе неле-ченного контроля соответственно (n = 8).
Полученные данные позволяют считать НБ (JMR-32) in vitro/in vivo слабочувствительной к онколити-ческому действию CVA7. Для получения значимого результата in vivo следует начинать лечение при двукратно меньших опухолях и увеличенной первой дозой онколитического препарата.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке РНФ (грант № 14-14-00882).
ЛИТЕРАТУРА
1. Weinstein J.L., Katzenstein H.M., Cohn S.L. Advances in the diagnosis and treatment of neuroblastoma. Oncologist. 2003; 8(3): 278-92.
2. Toyoda H., Yin J, Mueller S, Wimmer E., Cello J. Oncolytic treatment and cure of neuroblastoma by a novel attenuated poliovirus in a novel poliovirus-susceptible animal model. Cancer Res. 2007; 67(6): 2857-64.
3. Parikh N.S., Currier M.A., Mahller Y.Y., Adams L.C., Di Pasquale B., Collins M.H. Oncolytic herpes simplex virus mutants are more efficacious than wild-type adenovirus Type 5 for the treatment of high-risk neuroblastomas in preclinical models. Pediatr. Blood Cancer. 2005; 44(5): 469-78.
4. Pesonen S., Helin H., Nokisalmi P., Escutenaire S., Ribacka C., Sarkioja M., Cerullo V. Oncolytic adenovirus treatment of a patient with refractory neuroblastoma. Acta Oncol. 2010; 49(1): 120-2.
5. Garcia-Castro J., Alemany R., Cascallo M., Martinez-Quintanilla J., Arriero Mdel M., Lassaletta A. Treatment of metastatic neu-roblastoma with systemic oncolytic virotherapy delivered by au-tologous mesenchymal stem cells: an exploratory study. Cancer Gene Ther. 2010; 17(7): 476-83.
6. Miyamoto S., Inoue H., Nakamura T., Yamada M., Sakamoto C., Urata Y., Okazaki T. Coxsackievirus B3 is an oncolytic virus with immunostimulatory properties that is active against lung ad-enocarcinoma. Cancer Res. 2012; 72(10): 2609-21.
7. Чумаков П.М., Морозова В.В., Бабкин И.В., Байков И.К., Не-тесов С.В., Тикунова Н.В. Онколитические энтеровирусы. Молекулярная биология. 2012; 46(5): 712-25.
8. Skelding K.A., Barry R.D., Shafren D.R. Systemic targeting of metastatic human breast tumor xenografts by Coxsackievirus A21. Breast Cancer Res. Treat. 2009; 113(1): 21-30.
9. Haley E.S., Au G.G., Carlton B.R., Barry R.D., Shafren D.R. Regional administration of oncolytic Echovirus 1 as a novel therapy for the peritoneal dissemination of gastric cancer. J. Mol. Med. 2009; 87(4): 385-99.
10. Shafren D.R., Sylvester D., Johansson E.S., Campbell I.G., Barry
R.D. Oncolysis of human ovarian cancers by echovirus type 1. Int. J. Cancer. 2005; 115(2): 320-8.
11. Donina S., Strele I., Proboka G., Auzins J., Alberts P., Jonsson B. Adapted ECHO-7 virus Rigvir immunotherapy (oncolytic vi-rotherapy) prolongs survival in melanoma patients after surgical excision of the tumour in a retrospective study. Melanoma Res. 2015; 25(5): 421.
12. Seitsonen J.J., Shakeel S., Susi P., Pandurangan A.P., Sinkovits R.S., Hyvonen H. Structural analysis of coxsackievirus A7 reveals conformational changes associated with uncoating. J. Virol. 2012; 86(13): 7207-15.
13. Mahy B.W. J. The Dictionary of Virology. Atlanta: Academic Press; 2009.
14. Нетёсов С.В., Кочнева Г.В., Локтев В.Б., Святченко В.А., Сергеев А.Н., Терновой В.А. и др. Онколитические вирусы: достижения и проблемы. Эпидемиология и санитария. 2011;(3): 10-7.
15. Сейбиль В.Б., Малышкина Л.П. Проблема ликвидации полиомиелита как инфекции требует иного решения. В кн.: Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН. Медицинская вирусология. М.; 2014; 28(1): 30-6.
16. Трещалина, Е.М. Коллекция штаммов опухолей человека / Под ред. М.И. Давыдова. М.: Практическая медицина; 2009: 88-90.
17. Сосновцева А.О., Липатова А.В., Гриненко Н.Ф., Баклаушев В.П., Чумаков П.М., Чехонин В.П. Чувствительность клеток глиомы С6, несущих полиовирусный рецептор человека к онколитическим полиовирусам. Бюл. экспер. биол. 2016; 161(6): 780-4.
18. Трещалина Е.М. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К.; 2012; Ч. 1.: 642-57.
19. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, ЕЭС, Страсбург. 1985. Ланималогия. 1993; (1): 29.
20. Большаков О.П., Незнанов Н.Г., Бабаханян Р.В. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. ВОЗ. 2000. Рекомендации комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований. Качественная клиническая практика. 2002; (9): 24-8.
REFERENCES
1. Weinstein J.L., Katzenstein H.M., Cohn S.L. Advances in the diagnosis and treatment of neuroblastoma. Oncologist. 2003; 8(3): 278-92.
2. Toyoda H., Yin J, Mueller S, Wimmer E., Cello J. Oncolytic treatment and cure of neuroblastoma by a novel attenuated poliovirus in a novel poliovirus-susceptible animal model. Cancer Res. 2007; 67(6): 2857-64.
3. Parikh N.S., Currier M.A., Mahller Y.Y., Adams L.C., Di Pasquale B., Collins M.H. Oncolytic herpes simplex virus mutants are more efficacious than wild-type adenovirus Type 5 for the treatment of high-risk neuroblastomas in preclinical models. Pediatr. Blood Cancer. 2005; 44(5): 469-78.
4. Pesonen S., Helin H., Nokisalmi P., Escutenaire S., Ribacka C., Sarkioja M., Cerullo V. Oncolytic adenovirus treatment of a patient with refractory neuroblastoma. Acta Oncol. 2010; 49(1): 120-2.
BASIC RESEARCH - PRACTICAL MEDICINE
5. Garcia-Castro J., Alemany R., Cascallo M., Martinez-Quintanilla J., Arriero Mdel M., Lassaletta A. Treatment of metastatic neu-roblastoma with systemic oncolytic virotherapy delivered by au-tologous mesenchymal stem cells: an exploratory study. Cancer Gene Ther. 2010; 17(7): 476-83.
6. Miyamoto S., Inoue H., Nakamura T., Yamada M., Sakamoto C., Urata Y., Okazaki T. Coxsackievirus B3 is an oncolytic virus with immunostimulatory properties that is active against lung ad-enocarcinoma. Cancer Res. 2012; 72(10): 2609-21.
7. Chumakov P.M., Morozova V.V., Babkin I.V., Baykov I.K., Ne-tesov S.V., Tikunova N.V. Oncolytic enteroviruses. Molekulyar-naya biologiya. 2012; 46(5): 712-25. (in Russian)
8. Skelding K.A., Barry R.D., Shafren D.R. Systemic targeting of metastatic human breast tumor xenografts by Coxsackievirus A21. Breast Cancer Res. Treat. 2009; 113(1): 21-30.
9. Haley E.S., Au G.G., Carlton B.R., Barry R.D., Shafren D.R. Regional administration of oncolytic Echovirus 1 as a novel therapy for the peritoneal dissemination of gastric cancer. J. Mol. Med. 2009; 87(4): 385-99.
10. Shafren D.R., Sylvester D., Johansson E.S., Campbell I.G., Barry R.D. Oncolysis of human ovarian cancers by echovirus type 1. Int. J. Cancer. 2005; 115(2): 320-8.
11. Donina S., Strele I., Proboka G., Auzins J., Alberts P., Jonsson B. Adapted ECHO-7 virus Rigvir immunotherapy (oncolytic vi-rotherapy) prolongs survival in melanoma patients after surgical excision of the tumour in a retrospective study. Melanoma Res. 2015; 25(5): 421.
12. Seitsonen J.J., Shakeel S., Susi P., Pandurangan A.P., Sinkovits R.S., Hyvonen H. Structural analysis of coxsackievirus A7 reveals conformational changes associated with uncoating. J. Virol. 2012; 86(13): 7207-15.
13. Mahy B.W. J. The Dictionary of Virology. Atlanta: Academic Press; 2009.
14. Netesov S.V., Kochneva G.V., Loktev V.B., Svyatchenko V.A., Sergeev A.N., Ternovoy V.A. et al. Oncolytic viruses: progress and problems. Epidemiologiya i sanitariya. 2011; (3): 10-7. (in Russian)
15. Seybil' V.B., Malyshkina L.P. The problem of eradication of poliomyelitis as infections requires different solutions. In: [Trudy Instituta poliomielita i virusnykh entsefalitov imeni M.P. Chu-makova RAMN. Meditsinskaya virusologiya]. Moscow; 2014; 28(1): 30-6. (in Russian)
16. Treshchalina E.M. The Сollection of Human Tumor Strains. / Ed. M.I. Davydov. Moscow: Prakticheskaya meditsina; 2009. (in Russian)
17. Sosnovtseva A.O., Lipatova A.V., Grinenko N.F., Baklaushev V.P., Chumakov P.M., Chekhonin V.P. The sensitivity of the C6 glioma cells carrying the human poliovirus receptor to onco-lytic poliovirus. Bul. Exper. Biol. 2016; 161(6): 780-4. (in Russian)
18 Treshchalina E.M. Guidelines for preclinical study of antitumor activity of drugs. In: Guidelines for Preclinical Studies of Srugs. Moscow: Grif i K; 2012; Pt. 1: 642-57. (in Russian)
19. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes, the EC, Strasbourg. 1985. Lanimalogiya. 1993; (1): 29. (in Russian)
20. Bol'shakov O.P., Neznanov N.G., Babakhanyan R.V. Didactic and ethical aspects of research on biomodels and laboratory animals. Kachestvennaya klinicheskaya praktika. 2002; (9): 24-8. (in Russian)
Поступила 23.11.16 Принята к печати 22.12.16
