CC BY
12УДК 619:616.98:578.821.2:636.22/.28:57082.26
Косарева О. А., Константинов А. В., Кукушкина М. С.
(Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГУ «ВНИИЗЖ»)
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ГОНАД КОЗЫ К ВИРУСУ НОДУЛЯРНОГО ДЕРМАТИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Ключевые слова: нодулярный дерматит, крупный рогатый скот, культура клеток, культивирование.
Введение.
Нодулярный дерматит относится к особо опасным инфекциям крупного рогатого скота и имеет широкое распространение в странах Африканского континента и Азии. В связи с ростом внешнеэкономических отношений, возможен занос возбудителя болезни и в нашу страну.
Нодулярный дерматит вызывается вирусом рода Capripoxvirus семейства Poxviridae. Это острое, подострое или бессимптомное заболевание у КРС, которое поражает животных любого возраста и породы. Болезнь характеризуется повышением температуры, генерализованными оспенными поражениями кожи и внутренних органов которые можно наблюдать в виде твердых высыпаний органических узелков на коже, и генерализованной лим-фаденопатией. [1]
Нодулярный дерматит переносится жалящими насекомыми, особенно кровососущими, например, москитами и жигалками обыкновенными Stomoxys сакйгаш. По данным Yeruhama I. и др. [2, 5] вспышка заболевания бугорчатки была вызвана мухами жигалками, занесенными ветром из очагов болезни, находящиеся на расстоянии 85 км. Передача возбудителя болезни от животного к животному может происходить контактным методом, однако он не играет важной роли во время эпизоотии. [2, 3] Идентификацию возбудителя проводят методом постановки РСК, ИФА и др.
Для выделения и культивирования вируса используют культуры клеток дермы КРС с минимальной поддерживающей средой, содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки и гентамицин (исходное количество 50 мг/мл). [1] Вирус бугорчатки может также размножаться в культуре клеток тестикул ягненка и теленка, почек овцы, надпочечников ягненка, фетальных культурах мышц ягненка и теленка, почек эмбриона овцы и почек ягненка, феталь-ных культурах почки и кожи кролика, фи-
бробластах куриных эмбрионов, в линии клеток взрослой мартышки - вервет (AVK 58) и в линии клеток почки сирийского хомячка (ВНК/21). При первичном выделении вируса в монослое почки ягненка на растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лак-тальбумина и 0,5% сыворотки КРС, цито-патогенные изменения (ЦПИ) наблюдались через 11 суток и протекали исключительно медленно. При серийном пассировании вируса в этой культуре, изменения становились заметными на 3 день. ЦПИ изначально проявлялись в виде отдельных фокусов или округлых групп и клеток с повышенной рефрактивностью. Фокусы постепенно увеличивались, вовлекая клетки окружающие их, новые фокусы возникали на оставшейся части клеточной поверхности, хотя некоторое количество пораженных клеток случайным образом отслаивались оставляя неправильной формы пробелы в клеточном слое. Большинство фокусов, как правило, оставались прикрепленными к поверхности стекла в течение продолжительного времени. В культурах, зараженных вирусной суспензией, данные фокусы или микроплашки могут учитываться и расцениваться как чувствительный вирусологический метод.
Проявление цитопатогенного изменения в монослое клеток почек ягненка показало, что улучшенные показатели выявлены при концентрации гидролизата лак-тальбумина 2%. На адаптированной культуре изменения, обусловленные действием вируса проявлялись в течение 24 часов, а полное поражение клеток через 48-72 часа. Значительное возрастание уровня ци-топатогенного действия также наблюдалось в культуре почки ягненка с использованием поддерживающей среды на растворе Хенкса без гидролизата лактальбумина и сыворотки, со сниженной концентрацией электролитов. [4].
В настоящее время для получения вакцины против оспы овец и коз широко ис-
пользуется перевиваемая культура клеток гонад козы. Учитывая то, что возбудитель оспы овец и коз, а также возбудитель но-дулярного дерматита КРС относятся к одному роду Capripoxvirus, целью наших исследований было изучить возможность адаптации вируса НД к указанной культуре клеток, определить степень накопления вируса в зависимости от количества пассажей, а также методом электронной микроскопии изучить его структуру. Идентификацию возбудителя проводили методом постановки РДСК, РДП и ИФА подтвердивших его специфичность.
Материалы и методы
Чувствительность перевиваемой культуры клеток гонад козы к вирусу нодуляр-ного дерматита крупного рогатого скота штамма «Эфиопский» проводили методом последовательных пассажей с использованием патогенного материала в виде подкожной клетчатки, полученной от больного животного. С этой целью на 13 день после экспериментального заражения быка подвергли эвтаназии, получали отёчную подкожную клетчатку в области шеи, в местах наибольших специфических поражений кожи, которую растирали в ступке в стерильных условиях с добавлением ФБР рН 7,6, дважды замораживали при минус 60°С и оттаивали при комнатной температуре. Затем суспензию центрифугировали при 2000 об/мин, в надосадочную вируссо-держащую жидкость вносили антибиотики пенициллин 100 ед/см3, стрептомицин 100 ед/см3 и гентамицин 100 ед/см3.
Полученую суспензию инокулировали по 10 см3 в 1,5 литровые клинские матрасы с монослоем 48-72 часовой перевиваемой культурой клеток гонад козы.
Монослойную культуру клеток заражали с адсорбцией вируса на клетках. Вирус вносили после удаления ростовой среды, инкубировали при 37°С в течение 1 часа, а затем вносили поддерживающую среду. Для культивирования вируса использовали поддерживающую среду Игла и ПСП с содержанием 1 - 2 % нормальной сыворотки КРС. Репродуктивную способность вируса оценивали по времени появления ЦПД, интенсивности его развития и накоплению вируса.
Титр вируса вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в ^ ТЦД50/см3. Сбор вируса производили при проявлении ЦПД на 70-90% площади монослоя. Полученный вирус хранили при температуре минус 40°С. Всего было проведено 8 пассажей (срок наблюдения).
В дальнейшем с целью изучения структуры вируса нодулярного дерматита, его исследовали под электронным микроскопом.
Результаты и обсуждения.
Было установлено, что вируссодержа-щая суспензия, приготовленная из патогенного материала, при заражении 48-72 часовой перевиваемой культуры клеток гонад козы вызывала специфическую дегенерацию клеток. При этом сроки обусловившие наличие ЦПД на площади 70-90% монослоя клеток и его накопление, зависели от количества проведенных пассажей. При проведении первого пассажа деструкция клеток наступала через 5 суток. При этом титр полученного вируса был 4,0 ^ ТЦД50/ см3. В дальнейшем сроки действия вируса сокращались. Вирус 2го и 3го пассажей вызывал дегенерацию клеток через 3 суток. В этом случае отмечено увеличение титра вируса в пределах 5,0 - 5,33 ^ ТЦД50/см3 соответственно.
После проведения 4го и 5го пассажей сроки культивирования вируса НД сокращались до 2х суток. Однако при этом выявлено некоторое снижение титра инфекционной активности вируса, который был 4,66 - 4,91 ^ ТЦД50/см3 соответственно.
При проведении 6го, 7го и 8го пассажей сроки специфической дегенерации клеток выявлены в течение 3х суток, а 8го - на 5ые сутки. Титр вируса был 5,5; 4,5 и 4,5 ^ ТЦД50/см3, соответственно.
Как видно из представленных данных при культивировании вируса НД в перевиваемой культуре клеток гонад козы наиболее выраженное накопление вируса нодулярного дерматита КРС отмечено в течение 1-6 пассажей в пределах 4,0 - 5,5 ^
ТЦД50/см3.
В дальнейшем для изучения морфологии вируса нодулярного дерматита КРС монослой клеток гонад козы с выраженным ЦПД, полученный в клинских матрасах, механическим путем снимали со стекла, предварительно слив питательную среду, ресуспендировали 0,01 М фосфатным буферным раствором в объеме уменьшенным в 200 раз по сравнению с первоначальным объемом питательной среды. Полученную концентрированную суспензию вируса для разрушения клеток замораживали при минус 60°С, оттаивали при комнатной температуре и для осаждения клеточного детрита центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут. Инфекционный титр, надосадочной ви-руссодержащей жидкости при титровании
в культуре клеток гонад козы, составлял 107,5 lg ТЦД50/см3. В дальнейшем методом центрифугирования через слой 20% сахарозы при 20000 g в течение 1,5 часов проводили очистку надосадочной жидкости. Полученный вирусный препарат исследовали под электронным микроскопом (JEM 100 B), используя негативное контрастирование 4% раствором фосфатно - фоль-
фрамовой кислоты рН 6,8.
Изучение вируса нодулярного дерматита КРС методом электронной микроскопии показало, что он имеет типичную структуру каприпоксвирусов, размер по большой оси - форма эллипса 150х200 нм, по малой оси - сферическая форма 180х200 нм (рис.)
VJ
Рис. Морфология вирионов вируса нодулярного дерматита КРС увеличение х 60000 (исследования проведены совместно с д.б.н. А.П. Пономаревым)
Заключение
1. Установлена чувствительность перевиваемой культуры клеток гонад козы к вирусу нодулярного дерматита крупного рогатого скота. Сроки культивирования вируса составляли 2-3 суток, а инфекцион-
ный титр в культуре клеток достигал величины 5,5 ^ ТЦД50/СМ3.
2. Морфология вирионов ВНД соответствовала структуре каприпоксвирусов.
Резюме: Установлена высокая чувствительность перевиваемой культуры клеток гонад козы к вирусу нодулярного дерматита крупного рогатого скота (ВНД). По морфологии ВНД соответствует структуре каприпоксвирусов.
SUMMARY
High sensitivity of continuous goat gonad cell culture to bovine lumpy skin disease virus (LSDV) was determined. According to its morphology LSD virus corresponds to capripoxvirus structure.
Keywords: lumpy skin disease, cattle, cell culture, cultivation.
Литература
1. Absence of lumpy skin disease virus in semen of vaccinated bulls following vaccination and subseguent experimental infection / U.I. Osuagwuh, V Bagla, E.H. Venter [et al]. // Vaccine. - 2007. - Vol. 25, № 12. - P. 22382243.
2. Mechanical transmission of lumpy skin disease virus by Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) / C. M.
Chihota, L. F Rennie, R. P. Kitching, PS. Mellor. // Epidemiol. Infect. - 2001. - Vol. 126. - P. 317-321.
3. Lumpy skin disease / Barnard B. J., Munz E., Dumbell K., Prozesky L.// Coetzer JAW Infectious diseases of livestock with special reference to Southern Africa / ed - Cape Town, 1994. - P. 604-612.
4. Lumpy skin disease // Virol. Monogr. Weiss K. E. ted, 1 - 1968. Vol. 3. - P. 111-131.
5. Spread of lumpy skin diseas in Israeli drairy herds // Yeruham I., Nir O., Braverman Y., [et al]. Vet. Rec. 1995. - Vol. 137, N 4. - P. 91 - 93.
Контактная информации об авторах для переписки О. А. Косарева - ведущий технолог ОБТК, аспирантка, А. В. Константинов - начальник ОБТК, канд. ветер. наук, М. С. Кукушкина - руководитель сектора, канд. биолог. наук.
Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГУ «ВНИИЗЖ») 600901, Россия, Владимирская область, город Владимир, микрорайон Юрьевец тел.\факс: (4922) 26-38-77, (4922) 26-06-14, (4922) 26-19-14 E-mail: [email protected] E-mail: [email protected]
УДК: 619: 616.9: 636.4
Скворцов В.Н., Сафонова Н.А., Балбуцкая А.А., Маханев В.В., Войтенко А.В.
(ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко)
АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ОФЛОКСАЦИНА В ОТНОШЕНИИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
Ключевые слова: антибиотики, фторхинолоны, офлоксацин, микроорганизмы, чувствительность, резистентность.
Введение
Антибактериальные препараты - одно из величайших достижений XX века. Они выступают в роли приоритетных специфических лекарственных средств при патологических состояниях инфекционной этиологии как у людей, так и животных. Однако их широкое и не всегда рациональное применение способствует появлению и распространению микроорганизмов с повышенной резистентностью к антимикробным препаратам. Особенно опасна тенденция выработки у бактерий мульти-резистентности. Поэтому оптимизированное назначение такого рода медикаментов наиболее результативно [2].
В последние годы при лечении животных, инфицированных лекарственнорези-стентными формами микроорганизмов, чаще стали использовать фторхинолоны. В этой связи особый интерес представляет офлоксацин - трициклический монофтор-хинолон.
Обладая обширным диапазоном бак-териостатического действия в отношении грамотрицательных и грамположитель-ных микроорганизмов, а также возбудителей с внутриклеточной локализацией оф-локсацин зарекомендовал себя как препа-
рат, обладающий широкими показаниями к применению [1].
Целью нашей работы явилось изучение антимикробной активности офлокса-цина в отношении микроорганизмов, выделенных от животных с различными патологиями.
Материалы и методы
Определение антибактериальной чувствительности к офлоксацину проводили диско-диффузионным методом. В опытах было использовано: 36 штаммов Escherichia coli, выделенных от птиц; 31 штамм Escherichia coli, выделенных от свиней; 15 штаммов Salmonella enteritidis, выделенных от цыплят; 40 штаммов Staphylococcus hyicus, выделенных от свиней; 12 штаммов Staphylococcus pseudintermedius, выделенных от собак; 11 штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от свиней и птиц; 6 штаммов Streptococcus spp., выделенных от свиней; 4 штамма Pasteurella multocida; 7 штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных от свиней и птиц. Интерпретацию результатов оценивали по одной из трех категорий: чувствительный, промежуточный и резистентный штамм.
Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) офлоксацина определяли
