Болезнь Реклингхаузена в Республике Башкортостан, результаты и перспективы исследований Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА

УДК 616-021:575.1

© Р.Н. Мустафин, М.А. Бермишева, Э.К. Хуснутдинова, 2016

Р.Н. Мустафин1, М.А. Бермишева2, Э.К. Хуснутдинова1'2 БОЛЕЗНЬ РЕКЛИНГХАУЗЕНА В РЕСПУБЛИКЕ БАШКОРТОСТАН, РЕЗУЛЬТАТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет», г. Уфа 2ФГБУН «Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН», г. Уфа

Болезнь Реклингхаузена - аутосомно-доминантное заболевание с опухолевым синдромом. Частота встречаемости этого заболевания в мире 1:3000 населения. Эффективные методы лечения болезни отсутствуют, поэтому установление причин заболевания на молекулярном уровне является важным аспектом в борьбе с данной патологией.

Исследованы образцы ДНК из лейкоцитов периферической крови 69 больных и 50 их здоровых родственников из 56 семей. Поиск мутаций в гене NF1 проводили методом SSCP c щелочной и температурной денатурацией с последующим секвенированием. Для выявления делеций NF1 использованы семь внутригенных маркеров: rs2066736, rs9894862, rs1801052, STR(TCCA)ii' IVS27AC28.4' D17S2237 (GXAlu), IVS38TG53.0. Подробно описаны симптомы проявления нейрофиброматоза 1-го типа у исследованных больных.

Идентифицированы 10 мутаций в гене NF1 у 16 пациентов. Из них 7 мутаций: ^1278G>A (p.Trp426X), ^1570G>A (p.Glu541Lys), с. 1973_1974delTC (р.Ьеи658Ргс^Х10), с.3526_3528delAGA (p.Arg1176del), с.382баеЮ (р.Arg1276GlufsX8)' с.4514+5G>A, c.5758_5761delTTGA (p.Leu1920AsnfsX7) - описаны впервые в мире. Гено-фенотипические корреляции не выявлены.

Ключевые слова: болезнь Реклингхаузена, нейрофиброматоз, опухолевый синдром, мутации, CpG-островки, метилирование, микроРНК.

R.N. Mustafin, M.A Bermisheva, E.K. Khusnutdinova VON RECKLINGHAUSEN'S DISEASE IN THE REPUBLIC OF BASHKORTOSTAN, THE RESULTS AND PROSPECTS OF RESEARCH

Von Recklinghausen's disease - is an autosomal dominant disease with tumor syndrome, with a frequency of occurrence in the world at 1: 3000 population. There are no effective treatments for this disease. Therefore, the determination of the molecular causes of the disease is an important step for its future treatment.

DNA samples were obtained from peripheral blood leukocytes of 69 patients and 50 of their healthy relatives from 56 families. Search for mutations in NF1 gene was performed by SSCP using alkaline and temperature denaturation. The samples with altered mobility in the gel were analyzed by sequencing. In order to detect deletions in NF1 gene seven intragenic markers were used: rs2066736, rs9894862, rs1801052, STR(TCCA)n, IVS27AC28.4, D17S2237 (GXAlu), IVS38TG53.0. Symptoms of neurofibroma-tosis type 1 have been described in detail for all studied patients.

We have identified 10 distinct NF1 mutations in 16 patients. The mutations included 7 novel: c.1278G>A (p.Trp426X), c.1570G>A (p.Glu541Lys), c. 1973_1974delTC (p.Leu658ProfsX10), c.3526_3528delAGA (p.Arg1176del), c.3826delC (p.Arg1276GlufsX8), c.4514+5G>A, c.5758_5761delTTGA (p.Leu1920AsnfsX7). We have not found genotype-phenotype correlation.

Key words: Von Recklinghausen's disease, neurofibromatosis, tumor syndrome, mutations, CpG-islands, methylation, miRNA.

Болезнь Реклингхаузена, или нейрофиброматоз 1-го типа (НФ1), - одно из самых распространенных наследственных заболеваний с аутосомно-доминантным типом наследования. Частота встречаемости НФ1 в мире в среднем составляет 1 случай на 3000 населения. Клинические проявления болезни связаны с развитием опухолевого синдрома у большинства больных: гиперпролиферации меланоцитов кожи (пятна цвета кофе с молоком (CALM)), нейрофибромы (опухоли из шванноцитов нервных волокон), гамартромы радужной оболочки глаза. Более тяжелые неоплазии развиваются с разной частотой: 30% составляют плексиформные нейрофибромы [1], 20% - глиомы зрительных нервов, 10% - злокачественные опухоли из оболочек периферических нервов [4]. У 30 - 60% пациентов определяются когнитивные нарушения, у 38% - скелетные аномалии (сколиоз, псевдоартроз), у 30% - задержка развития [9].

Причина НФ1 - гетерозиготные мутации в гене ЫП, кодирующем белок нейрофибро-мин - онкосупрессор, регулирующий Иа8-систему. Ген локализован на 17д11.2 и состоит из 57 экзонов [3]. В настоящее время механизмом туморогенеза при НФ 1 принято считать двухударную модель второго генетического события гена онкосупрессора, предложенную I. Е18епЬайЬ в 2000 году. Действительно, в шванноцитах нейрофибром выявляется биаллельная инактивация . Однако ни одно из предположений причины мутаций во втором аллеле не объясняет возникновение нейрофибром у большинства (95%) больных НФ1. Мутации второго аллеля гена в

шванноцитах опухолей являются скорее не инициирующими, а результатом общих нарушений стабильности генома и регуляции клеточного цикла при туморогенезе. Наиболее вероятной причиной инактивации второго аллеля являются эпигенетические процессы: ме-

тилирование промотора гена NF1 и микроРНК, роль которых в инактивации онкосупрессоров доказана и является предметом интенсивного изучения. Выявлены микроРНК, напрямую вовлеченные в злокачественный туморогенез при НФ1 miR-29c, miR-34a, miR-10b, miR-204, miR-21 [7]. Ген NF1 - прямая мишень miR-370, гиперэкспрессия которого вызывает NF1-опосредованный миелолейкоз [2]. На уровень экспрессии нейрофибромина оказывают влияние miR-128, miR-137, miR-103 [5]. При спорадическом плоскоклеточном раке головы и шеи выявлена гиперэкспрессия miR-514a, непосредственно влияющая на NF1 [8].

В базе данных генных мутаций человека (The Human Gene Mutation Database at the Institute of Medical Genetics in Cardiff, 2015) зарегистрировано более 1000 различных мутаций в гене NF1 без горячих точек мутагенеза. При этом у 5% больных обнаруживаются микроделеции. В 95% случаев обнаруживаются внутригенные мутации, в 5% - делеции протяженного участка, включающие NF1 с соседними генами [10]. В большинстве исследований не выявлена гено-фенотипическая корреляция, но отмечена широкая вариабельность клиники НФ1от стертых форм до тяжелых с множественными опухолями. На основании этого целью нашего исследования являются анализ клинического проявления НФ1 в каждом случае заболевания и обнаружение мутаций в гене NF1 у больных НФ1 в Республике Башкортостан (РБ) с попыткой определить их значение в выраженности опухолевого синдрома.

Материал и методы

Проведен анализ историй болезней больных НФ1, состоящих на учете в ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» за период с 2003 по 2015 годы. Подробно описаны симптомы болезни в каждом отдельном случае. По добровольному информированному согласию непосредственно исследованы 69 больных с диагнозом нейрофиброматоз 1-го типа и 50 их здоровых родственников из 56 семей, живущих в РБ. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови фе-нольно-хлороформной экстракцией по Mathew (1984). Поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене NF1 проводили методом анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP) по методике Orita (1989) с щелочной и температурной денатура-циями. Использованы олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие экзоны и прилегающие интронные области, подобранные с помощью программы Primer Select 5.05 из пакета

DNASTAR (1993-2002). Определение последовательности нуклеотидов у образцов с измененной подвижностью однонитевой ДНК проводили с помощью автоматического секвена-тора ABI PRISM модель 3100 («Applied Biosystems») с использованием набора для флюорис-центного мечения DYEnamic™ ET согласно протоколу фирмы-производителя («Amersham Pharmacia Biotech» DYEnamic™ ET Terminator Cycle Sequencing Kit).

Для выявления делеций проведен анализ семи внутригенных локусов в гене NF1. При анализе по микросателлитным маркерам STR(TCCA)n в интроне 1, IVS27AC28.4 в ин-троне 27a, D17S2237 (GXAlu) в интроне 27b, IVS38TG53.0 в интроне 38 [6] образцы наносили на 8% полиакриламидный гель (ПААГ) с окраской 0,09% раствором AgNO3. Генотипи-рование локусов rs2066736 и rs9894862 проводили методом SSCP, детекцию полиморфного варианта rs 1801052 - методом ПДРФ-анализа/RsaI. Образцы инкубировали при 37°C в течение 12 часов с последующим нанесением их на 7% ПААГ, гель окрашивали раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолете.

Результаты и обсуждение

Частота встречаемости НФ1 в РБ, по данным ГУЗ «Республиканский перинатальный центр» РБ, на 2015 год составила 1:17000 населения. Соотношение между долей больных среди жителей городов РБ к доле больных среди сельских жителей, а также разница между долей больных мужского и женского полов не достигает статистически значимой разницы. Больные НФ1 зарегистрированы в 38 из 54 административных районов и в 18 из 21 города республики. Характерно неравномерное распределение частоты встречаемости по районам. Минимальные показатели распространенности (менее 3 на 100000 населения) выявлены в городе Ишимбае и в Абзели-ловском и Баймакском районах; наивысшие показатели (более 13 на 100000 населения) - в Мишкинском и Нуримановском районах. Распределение больных НФ1 по этническому составу в РБ прямо коррелирует с демографической ситуацией в республике (рис. 1).

При выяснении семейного анамнеза с последующим уточнением клинических признаков и составлением родословных для 45% больных определены семейные случаи заболевания (наследование от матери - 25%, от отца - 20%), в 55% случаев - спорадические. Клиническая картина охарактеризована выраженным полиморфизмом (табл. 1) от стертых форм до тяжелого течения болезни (54% больных).

□ татары 31,904.

Рис. 1. Национальный состав больных НФ1 в Республике Башкортостан

Таблица 1

Сравнительная клиническая характеристика больных НФ1 в Республике Башкортостан с данными мировых исследований

Клинический признак Частота встречаемости у больных НФ1 в РБ, % Частота встречаемости у больных НФ1 в мире, %

CALM 90 100

Нейрофибромы 58 95

Низкий рост 18 34

Скелетные аномалии: 28 38

сколиоз 19 12-33

псевдоартроз 2 5

Когнитивные

нарушения 20 30-60

У больных НФ1 с нейрофибромами преобладали множественные опухолевые поражения, преимущественно подкожные. Большинство нейрофибром развивалось в пубертате. Среди скелетных аномалий чаще встречались тяжелые формы сколиоза (19%), у 7% больных выявлена деформация грудной клетки. У 23% пациентов отмечен дизморфизм лица. Определено утяжеление клинической картины при наследовании НФ1 от матери: задержка развития, низкий рост, сколиоз, псевдоартроз, диз-морфизм лица, тяжелые формы умственной отсталости. Развитие осложнений НФ1 в РБ значительно отличается по частоте встречаемости от данных мировой статистики (табл. 2).

Заключение

Частота встречаемости НФ1 в РБ составила 1:17000 населения. Выявленное утяжеление клиники НФ1 при наследовании от матери и характерное образование большин-

Таблица 2

Сравнительная оценка осложнений, выявленных у больных НФ1 из Республики Башкортостан, относительно мировых _статистических данных_

Частота Частота

Осложнения встречаемости встречаемости

у больных НФ1 у больных в

в РБ, % мире, %

Опухоли ЦНС 4 2

Глиомы зрительных

нервов 2 7-20

Гидроцефалия 3 5

Плексиформные нейро-

фибромы 2 30

Кисты головного мозга 1,7 1-10

МЖ8Т - 5-10

При анализе семи внутригенных локусов в гене ЫП1 для установления делеций ЫП1 выявлено двое больных, гомозиготных по всем семи анализируемым внутригенным маркерам: женщины из неродственных семей со спорадическими случаями НФ1, с тяжелым течением болезни.

В результате молекулярно-генетического исследования геномной ДНК 69 больных НФ1 из 56 семей в РБ с использованием 88СР-анализа и секвенирования гена ЫП1 выявлено 18 типов изменений подвижности однонитевых фрагментов ДНК в 18 экзонах и прилегающих к ним интронных областях. Секвенирование данных образцов позволило выявить 10 различных мутаций (табл. 3), из которых 7 ранее в литературе не описаны: с.12780>Л (р.Тгр426Х), с.15700>Л (р.01и541Ьу8), с.1973_1974ае1ТС (р.Ьеи658Р1сЁХ10), с.3526_3528ае1ЛОЛ

(р.Лге117бае1), с.382бае1С (р.Л^127601^Х8), с.4514+50>Л, о.5758_576Ые1ТГОЛ (р.Ьеи1920 Л8и£^Х7); 3 из выявленных мутаций (с.2991-Ю>С, с.4537С>Т, с.6792С>Л) описаны ранее [3].

ства нейрофибром в пубертате говорят в пользу влияния эпигенетических факторов в патогенезе болезни (импринтинг). Идентифицировано 10 мутаций в гене ЫП в 23% выборки больных НФ1, гено-фенотипичес-

Таблица 3

Спектр мутаций в гене №1 у больных НФ1 в Республике Башкортостан_

Пробанд Мутация Место Изменение в белке Наследование (И)

29.0, 29.2 с.1278С>А 10a экзон p.Trp426X N от отца

39.0, 39.1 с.15700>А 10с экзон p.Glu541Lys N от матери

46.0 с. 1973 1974 delTC 12b экзон р^и658Ргс^Х10 8 (спорадический)

48.0,48.1 51.0 с.2991-Ш>С 17 интрон Мутация сайта сплайсинга N от матери 8

43.0 45.0, 45.2 с.3526 3528 delAGA 21 экзон p.Arg1176del N от матери N от отца

25.0 с.3826delC 22 экзон р.Arg1276GlufsX8 8

47.0 ^4514+5G>A 26 интрон Мутация сайта сплайсинга N от отца

16.0 с.4537С>Т 27a экзон p.Arg1513X 8

44.0 c.5758 5761 delTTGA 31 экзон p.Leu1920AsnfsX7 N от отца

35.0 ^6792C>A 37 экзон p.Tyr2264X 8

ких корреляций не прослежено. В связи с этим предполагается продолжить изучение НФ1 в РБ с анализом влияния эпигенетических процессов в генезе опухолевого син-

дрома: сравнительный анализ метилирования промотора гена и исследование мик-

роРНК, роль которых в инактивации онкосу-прессоров доказана.

Сведения об авторах статьи: Мустафин Рустам Наилевич - аспирант кафедры генетики и фундаментальной медицины ФГБОУ ВО БГУ. Адрес: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32. E-mail: ruji79@mail.ru.

Бермишева Марина Алексеевна - старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики человека ФГБУН «Институт биохимии и генетики УНЦ РАН». Адрес: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71. Тел./факс: (347) 235-60-88. E-mail: Marina_berm@mail.ru.

Хуснутдинова Эльза Камилевна - д.б.н., профессор, зав. кафедрой генетики и фундаментальной медицины ФГБОУ ВО БГУ, зав. отделом геномики ФГБУН «Институт биохимии и генетики УНЦ РАН». Адрес: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71. Тел./факс: (347) 235-60-88. E-mail: ekkh@anrb.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Clinico-pathological and biomolecular findings in Italian patients with multiple cutaneous neurofibromas/ G. Ponti [et al.] // Hereditary Cancer in Clinical Practice. - 2011. - Vol. 9. - P. 6-15.

2. Garcia-Orti, L. Integration of SNP and mRNA Arrays with MicroRNA Profiling Reveals That MiR-370 Is Upregulated and Targets NF1 in Acute Myeloid Leukemia/ L. Garcia-Orti [et al.] // PLOS ONE. - 2012. - Vol. 7. - Iss. 10. - e47717.

3. Jeong, S. The Spectrum of NF1 Mutations in Korean Patients with Neurofibromatosis Type 1/ S. Jeong, S. Park, H. Kim // J. Korean Med Sci. - 2006. - Vol. 21. №1. - P. 107-111.

4. Monozygotic twins with Neurofibromatosis type 1, concordant phenotype and synchronous development of MPNST and metastasis/ G. Melean [et al.] // BMC Cancer. - 2010. - Vol. 10. - P. 407-412.

5. Paschou, M. Neurofibromin 1 Is a miRNA Target in Neurons/ M. Paschou, E. Doxakis // PLOS ONE. - 2012. - Vol. 7(10). - e46773.

6. Pasmant, E. Detection and Characterization of NF1 Microdeletions by Custom High Resolution Array CGH/ E. Pasmant, A. Sabbagh, J. Masliah-Planchon // Journal of Molecular Diagnostics. - 2009. - Vol. 11. - № 6. - P. 524-529.

7. Sedani, A. An emerging role for microRNAs in NF1 tumorigenesis/ A. Sedani, D. Cooper, M. Upadhyaya// Human Genomics. - 2012. -Vol. 6. - P.23-32.

8. Stark, M. MiR-514a regulates the tumor suppressor NF1 and modulates BRAFi sensitivity in melanoma/ M. Stark [et al.]// Oncotarget. -2015. - Vol. 6(19). - P. 177753-17763.

9. The correlation between clinical, nuclear and histologic findings in a patient with Von Recklinghausen's disease/J. Brinkman [et al.] // World Journal of Surgical Oncology. - 2007. - Vol. 5. - P. 130-137.

10. Unravelling the genetic basis of variable clinical expression in neurofibromatosis 1/ A. Sabbagh [et al.] // Human Molecular Genetics. -2009. - Vol. 18. № 18. - P. 2768-2778.

УДК 616.24-002

© А.М. Мирхайдаров, У.Р. Фархутдинов, Р.Р. Фархутдинов, 2016

А.М. Мирхайдаров1, У.Р. Фархутдинов2,3, Р.Р. Фархутдинов3 ИММУННЫЙ СТАТУС БОЛЬНЫХ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИЕЙ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИММУНОВЕНИНА В КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ

1ГБУЗ РБ «Поликлиника № 47», г. Уфа 2ГБУЗ РБ «Городская клиническая больница № 21», г. Уфа 3ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа

Внебольничная пневмония (ВП) является актуальной проблемой современной медицины. Сохраняются ее высокая заболеваемость, сложности в лечении больных, отмечается рост летальности при данном заболевании. Неблагоприятному течению ВП могут способствовать различные нарушения в состоянии иммунной системы. В этой связи представляется оправданным использование препаратов, корригирующих иммунный статус больных. У 52 больных ВП определяли в крови содержание относительного и абсолютного количества лимфоцитов, CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD16+-, CD20+-лимфоцитов, иммуноглобулинов (Ig) A, M, G, интерферона-у (ИФН-у) и фактора некроза опухоли (ФНО-а), оценивали микробицидную активность нейтрофилов крови. У больных ВП были выявлены различные нарушения иммунного статуса. В комплексном лечении у 18 пациентов был использован иммуноглобулин для внутривенного введения - иммуновенин (ИВ). Общепринятую терапию (ОТ) получали 34 больных. Применение ИВ у больных снижало выраженность клинических симптомов заболевания, улучшало показатели иммунитета. При общепринятой терапии у больных ВП длительно сохранялись симптомы заболевания и нарушения иммунного статуса.

Ключевые слова: внебольничная пневмония, иммунный статус, иммуновенин.

A.M. Mirkhaydarov, U.R. Farkhutdinov, R.R. Farkhutdinov IMMUNE STATUS IN PATIENTS WITH COMMUNITY-ACQUIRED PNEUMONIA AND IMMUNOVENIN EFFECTIVENESS IN COMPLEX THERAPY

Community-acquired pneumonia (CAP) is a topical problem in modern medicine. High incidence of CAP, difficulties in its therapy and growing number of fatal cases has been documented. Various forms of the impairment in the immune system can contribute to the unfavorable course of CAP. Thus, it seems appropriate to use medications correcting the immune status in the treatment of such patients. The content of relative and absolute number of CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD16+-, CD20+-lymphocytes, A, M, G immunoglobulins (Ig), interferon-y (IFN-y) and the of tumor necrosis factor-а (TNF-а) have been determined in the blood of 52 patients. In addition, microbi-